光固定明膠修飾的聚醚醚酮（PEEK）表面促進細胞增殖及成骨性研究

萬騰 張郡 田海清 袁天陽 劉欽毅*

聚醚醚酮（PEEK）材料由于具有與人體骨骼相近的彈性模量、機械強度較高、生物相容性較好、X線可穿透及優(yōu)良的自潤性等獨特的優(yōu)勢，其在整形外科、骨外科及口腔外科已得到了廣泛的應(yīng)用[1]。然而其材料表面的生物學(xué)惰性及疏水性嚴重限制了其進一步擴大應(yīng)用[2]，并可導(dǎo)致患者術(shù)后出現(xiàn)骨折部位的延遲愈合甚至不愈合等并發(fā)癥，給患者帶來身體及經(jīng)濟上的負擔(dān)。

明膠為膠原的一種降解產(chǎn)物[3]。作為一種天然的高分子化合物，其具有生物相容性、生物活性、免疫毒性較低等優(yōu)點[4]。光固定明膠可通過紫外照射產(chǎn)生內(nèi)部高分子交聯(lián)粘附于材料的表面，具有廣泛的粘附性[5]，增加材料的生物活性。本研究旨在通過光固定明膠粘附于PEEK材料表面，增加PEEK材料的生物活性。

1 材料與方法

1.1 光固定明膠及改性PEEK材料的制備

本研究中明膠的制備如以前的文獻報道[6]。一定量的明膠（Sigma-Aldrich）溶于10 mL的去離子水中。25.8mg的（4-疊氮苯甲酸基）琥珀酰（Sigma-Aldrich）溶于20 mL的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）（北京化工廠）中并與明膠溶液共混，4℃下磁力攪拌下過夜。將PEEK片放入上述溶液中，24h后取出PEEK片于紫外燈下照射5min。一次水反復(fù)沖洗未粘附的明膠。本研究采用的聚醚醚酮規(guī)格均為醫(yī)用級PEEK（吉林中研科技公司）24孔板大?。娣e2cm2）、厚度為0.1 cm。

1.2 材料性能表征學(xué)研究

⑴電子場發(fā)射掃描顯微鏡（SEM,S-4800,Hitachi）觀察材料表面形態(tài)變化。

⑵靜態(tài)水接觸角： 采用懸滴法測試材料接觸角變化（VCA 2000,AST），實驗組及對照組均測試3個樣品，每樣品選區(qū)3個點進行測試。

1.3 細胞學(xué)研究

1.3.1細胞的培養(yǎng)

本實驗采用鼠前成骨細胞（MC3T3-E1）（吉林大學(xué)第二醫(yī)院實驗中心）在HG-DMEM培養(yǎng)基（（Dulbecco's modified eagle medium）（Sigma-Aldrich）中，于加濕、37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3.2 CCK-8法測細胞增殖

將材料用75%乙醇消毒30 min，無菌PBS液反復(fù)清洗3次。1mLMC3T3-E1細胞懸液（2×105/mL）種植于材料表面。采用CCK-8（Sigma-Aldrich）測試材料上第3、7天的細胞增殖情況。

1.3.3梯度脫水觀察細胞形態(tài)

于24孔板內(nèi)將1mL MC3T3-E1細胞懸液（2×105/mL）種植于材料表面，培養(yǎng)第 3天及第 7天后，吸棄培養(yǎng)基，PBS溶液清洗三遍，4%多聚甲醛室溫下固定30 min，分別用50%、60%、70%、80%、90%、100%濃度的乙醇溶液脫水30 min后采用SEM觀察細胞形態(tài)。

1.3.4堿性磷酸酶（ALP）測試

于24孔板內(nèi)將1 mL MC3T3-E1細胞懸液（2×105/mL）種植于材料表面，培養(yǎng)第7天及第14天后，吸棄培養(yǎng)基，PBS溶液清洗三遍，每孔加入200uL細胞裂解液，-80℃反復(fù)凍融2到3次，采用BCA試劑盒測試總蛋白量，并于吸光度405 nm處測試ALP量，細胞分化使用ALP量/總蛋白量進行定量。

本研究應(yīng)用SPSS1.30統(tǒng)計軟件進行分析處理，計量資料以±s表示，并精確到小數(shù)點后三位，組建比較采用獨立樣本 檢驗，p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PEEK及光固定明膠改性PEEK表面SEM形態(tài)結(jié)果

如圖1所示，可觀察到粗糙的普通PEEK表面圖1(A)，改性后可觀察到光固定明膠粘附于PEEK表面圖1(B)，且表面形態(tài)變得相對規(guī)則。

圖1，SEM觀察PEEK表面形態(tài)（A），表面黏附光固定明膠后表面形態(tài)（B）。

2.2 靜態(tài)接觸角改變

如圖2，PEEK的靜態(tài)接觸角為99.7+3.752°(B)，表面粘附光固定明膠改性后靜態(tài)接觸角減少到43.2+4.375°(C)，表明表面粘附光固定明膠后PEEK親水性明顯增強。

圖2，PEEK及光固定明膠改性后PEEK表面親水性變化，(A)每組測試3個樣品得出親水性變化柱狀圖；（B）PEEK靜態(tài)水接觸角；（C）光固定明膠改性后PEEK表面接觸角。p＜0.05,n=3。

2.3 細胞增殖

MC3T3-E1細胞在材料表面第3、7天細胞增殖情況如圖3。PEEK組在第3天及第7天OD值相對于光固定明膠改性后OD值明顯較低。表明經(jīng)光固定明膠改性后PEEK促進細胞增殖能力增強，在第3天及第7天光固定明膠改性組OD值較對照組別分強加了33.7%及42.9%，PEEK表面生物活性明顯增強。

圖3，CCK-8法測試PEEK及光固定明膠改性后對細胞3天及7天增值的影響，光固定明膠改性后PEEK的生物活性明顯增強p＜0.05。

2.4 細胞形態(tài)測定

通過 SEM觀察細胞第3及第7天細胞形態(tài)如圖4，在第3天未改性PEEK表面細胞形態(tài)仍呈現(xiàn)豆?fàn)畹脑技毎螒B(tài)，且?guī)缀跷窗l(fā)現(xiàn)細胞基質(zhì)的分泌，光固定明膠改性組可發(fā)現(xiàn)細胞鋪展成圓盤狀或呈帶狀，細胞通過肌動蛋白及足絲蛋白粘附于材料表面，且發(fā)現(xiàn)大量細胞基質(zhì)的分泌。對照組細胞伸展形態(tài)在第7天較第3天明顯較好，細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閳A盤狀，且可觀察到少量細胞基質(zhì)分泌，細胞通過足絲蛋白及偽足黏附于PEEK表面。光固定明膠改性組細胞已完全伸展形成扁平狀，部分細胞已被大量分泌的細胞基質(zhì)覆蓋，細胞牢固的粘附于材料表面，表明光固定明膠改性后PEEK的生物相容性明顯增強。

圖4，SEM觀察MC3T3-E1細胞第3天及第7天形態(tài)：(A)PEEK組3天細胞形態(tài)；(B)光固定明膠改性組3天細胞形態(tài)；(C)PEEK組7天細胞形態(tài)；(D)光固定明膠改性組7天細胞形態(tài)。

2.5 堿性磷酸酶（ALP）定量測定

為了探究光固定明膠改性后PEEK對于前成骨細胞分化的影響，我們進行了堿性磷酸酶（ALP）定量測試，如圖5，在第7天及第14天光固定明膠改性后實驗組的ALP含量較對照組別分增強了5.1%及7.3%，說明通過光固定明膠改性后對于前成骨細胞的分化具有一定的促進作用。

圖5，第3及第7天堿性磷酸酶（ALP）定量，可發(fā)現(xiàn)光固定明膠改性后PEEK對于細胞分化具有一定的促進作用。

3 討論

隨著聚醚醚酮（PEEK）在臨床中的廣泛應(yīng)用，PEEK材料的疏水性及生物惰性等缺點引起了廣大學(xué)者的注意[1,2,7]。目前PEEK材料的改性方式主要分為兩種[8]：①通過在PEEK表面結(jié)合一些活性因子改善PEEK材料的表面生物活性；②通過將PEEK與一些生物活性物質(zhì)共混，增加PEEK材料的生物活性。其中表面改性的方案由于能在增加PEEK材料生物活性的同時，保留了其力學(xué)性能較高、密度與人體骨骼相似、X線可穿透性及自潤性等優(yōu)點，為廣大學(xué)者所認同[8]。

明膠為膠原的降解產(chǎn)物，其具有優(yōu)良的生物相容性、生物降解性及低免疫毒性等。光固定明膠為目前應(yīng)用較為廣泛的生物活性基質(zhì)。其目前已廣泛應(yīng)用水凝膠、擔(dān)載生長因子、材料表面改性等醫(yī)用材料，其臨床應(yīng)用前景較為可觀。本研究采用光固定的方式將明膠粘附于PEEK表面，增加材料的生物活性。根據(jù)以往的研究表明光固定明膠的疊氮基團在紫外光照射激發(fā)下生成高反應(yīng)活性的氮烯，這種高反應(yīng)活性氮烯可與高分子材料表面的碳氫化物共價結(jié)合，從而使明膠通過共價結(jié)合牢固的粘附于材料表面[9]。Mojgan Heydari等人[10]采用鈦片表面粘附光固定明膠的方法對鈦片進行改性，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)改性后PEEK表面早期細胞粘附性、生物活性等明顯增加。本研究方案中明膠也可有效的粘附于PEEK表面，并持久的改善PEEK表面生物相容性。

本研究采用PEEK表面改性的方案。通過電鏡觀察粘附光固定明膠后，PEEK材料表面發(fā)生類似細胞基質(zhì)狀物粘附于表面，表明采用該方案光固定明膠可粘附于PEEK表面，并且粘附光固定明膠的方法可使PEEK親水性明顯增加。目前研究表明材料表面親水性的增強會促進細胞對于材料的早期粘附[11]，且目前研究發(fā)現(xiàn)表面粘附的光固定明膠的活性基團對胎牛血清等組織蛋白具有吸附性，表面組織蛋白的粘附會明顯增強材料的生物活性[9]。在細胞學(xué)研究中采用CCK-8法對MC3T3-E1細胞第3及第7天細胞增殖進行了測定，發(fā)現(xiàn)光固定明膠改性組在第3及第7天OD值明顯增高，細胞增殖明顯較未改性 PEEK強，表明通過光固定明膠改性后PEEK可明顯促進細胞增殖。通過SEM觀察第3及第7天細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)通過光固定明膠改性后細胞鋪展形態(tài)及基質(zhì)的分泌都明顯增強，細胞鋪展可表明光固定明膠改性后對于細胞的早期粘附增強，細胞早期粘附是細胞功能化并最終組織化的重要標志，細胞增殖與新生骨的形成密切相關(guān)[12]，細胞基質(zhì)為細胞間信息交流的一種方式，有效的細胞基質(zhì)的分泌是細胞開始分化的標志。堿性磷酸酶（ALP）是細胞早期分化的標志，通過 ALP定量測試表明光固定明膠改性后PEEK對于細胞的早期分化具有一定的促進作用可促進新生骨的形成。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明：光固定明膠可固定于聚醚醚酮（PEEK）表面，并改變PEEK的表面親水性。細胞增殖、細胞形態(tài)、基質(zhì)分泌及 ALP等細胞學(xué)研究表面，光固定明膠修飾于PEEK表面可明顯增強其生物活性，為細胞生長提供良好的生物微壞境。