TPT對HL—60細胞增殖凋亡作用

劉芳怡　李麗娟

摘 要：目的： 拓撲替康對HL-60白血病細胞增殖凋亡的作用；方法： 應(yīng)用 MTT光吸收法分別檢測0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L的TPT分別作用于HL-60細胞后12小時、24小時、36小時、48小時細胞增殖情況，計算增殖抑制率，畫出生長曲線反映拓TPT對HL-60白血病細胞增殖作用的影響。結(jié)果：采用MTT法檢測在同一濃度TPT在不同時間點對HL-60細胞的抑制作用隨時間的延長而增強。結(jié)論：拓撲替康對HL-60細胞具有增殖抑制作用。

關(guān)鍵詞：TPT 細胞增殖 凋亡

中圖分類號：R733.7 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1003-9082（2018）06-0-02

拓撲替康（TPT）是一種拓撲異構(gòu)酶抑制劑，作用位點比較獨特，拓撲異構(gòu)酶是一種細胞核內(nèi)酶，無多藥耐藥現(xiàn)象，有較好的選擇性特點。急性白血病 （acute leukemia）是一種惡性血液系統(tǒng)疾病，特點是造血干細胞功能大部分喪失，幼稚細胞不斷克隆，白血病患者的造血干細胞和正常的造血干細胞存在類似似的特點。白血病是血液系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率越來越高，死亡率也很高，這就嚴(yán)重影響了國民健康。

一、材料與方法

1.材 料

1.1細胞株

人源性白血病細胞系HL-60細胞，由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供。

1.2實驗藥物

TPT（注射用鹽酸拓撲替康）：四季青有限公司。

2.方法

2.1細胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2飽和濕度下的恒溫箱中進行常規(guī)培養(yǎng)，平均2-3天換液一次，細胞生長良好，取倍增期的細胞進行實驗。

2.2實驗分組

選取生長狀態(tài)良好、在倍增期的HL-60細胞進行實驗分組，共分為兩組：對照組和實驗組，對照組不加用任何濃度的拓撲替康，實驗組分別加用0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L及0.8?mol/L濃度的拓撲替康，選取作用時間為12h、24h、36h和48h。

2.3TPT對HL-60細胞增殖抑制作用的檢測

2.3.1TPT作用前后細胞的改變

加入拓撲替康前在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)及特性，并照相；同理加入拓撲替康后也于顯微鏡下觀察HL-60細胞所發(fā)生形態(tài)變化，并照相。

2.3.2四甲基偶氮唑鹽光吸收法

用新鮮配制RPMI1640培養(yǎng)基把細胞配制成單個細胞懸液，在96孔培養(yǎng)板中接種，每孔5×104個細胞200?l量，并設(shè)置平行孔。

向?qū)嶒灲M中分解加入0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L的拓撲替康，在對照組應(yīng)加入同等量的生理鹽水。加藥后經(jīng)過12h、24h、36h、48h分別作用后，每孔加入20?l的MTT溶液，不棄去培養(yǎng)基的條件下，放入37℃和5%CO2孵育箱內(nèi)孵育4小時，等待檢測。將每組每孔細胞均勻輕輕細細吹打，混勻，移入1.5mlEP管中，離心，再在每孔中加入二甲基亞砜150?l，輕輕搖蕩10min，使其完全得到溶解。然后將混合液再次置入96孔板中，將96孔板放入酶標(biāo)儀中，選擇波長490nm處，檢測各孔的光吸收值，記錄結(jié)果并把結(jié)果打印。根據(jù)該結(jié)果計算增殖抑制率，抑制率=（1-實驗組值/對照組值）×100%來實現(xiàn)的，根據(jù)增殖抑制率的結(jié)果得出細胞的最適作用濃度和最適作用時間。

二、結(jié)果

不同濃度的TPT在不同時間點對HL60細胞生長抑制的MTT結(jié)果。

分別采用0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L的TPT研究在不同時間點（12h、24h、36h、48h）對HL-60細胞的抑制作用，MTT結(jié)果顯示各濃度值的抑制細胞增殖作用均隨作用時間的延長而增強。

三、討論

近年來，隨著分子診斷學(xué)、分子藥理學(xué)和分子腫瘤學(xué)共同的迅猛發(fā)展，各種醫(yī)學(xué)技術(shù)的提高，也促使在白血病[1]等惡性血液病的治療方面也已進入到綜合治療時代，體外實驗證實，拓撲替康抗腫瘤活性表現(xiàn)在對急性T淋巴母細胞白血病JM細胞株、乳腺癌細胞株[2，3]和動物移植性模型轉(zhuǎn)接腫瘤的治療方面[4]。

拓撲替康這種新型的抗腫瘤藥物，現(xiàn)已廣泛推廣使用在臨床，它的臨床作用機制和其它喜樹堿藥物是相似的，因此具有喜樹堿類藥物共同的藥理作用，它是細胞內(nèi)一種特異性的拓撲異構(gòu)酶Ⅰ抑制劑已被確定。在細胞周期中，拓撲替康于DNA復(fù)制前期就特異性地與DNA單鏈斷端上的拓撲異構(gòu)酶Ⅰ發(fā)生特異性結(jié)合，阻止了拓撲異構(gòu)酶Ⅰ修復(fù)單鏈斷端，破壞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致腫瘤細胞死亡。拓撲替康具有廣譜抗腫瘤活性[5，6]，在治療非霍淋巴瘤、腸癌、肺癌和卵巢癌[7，8]等各種惡性腫瘤中，拓撲替康已顯示出了有較好的療效。在白血病細胞中，我們不難發(fā)現(xiàn)，拓撲替康靶酶-Topo-Ⅰ要比正常血液細胞中的含量高出來很多，我們還發(fā)現(xiàn)，拓撲替康與柔紅霉素、氨甲蝶呤、長春新堿等化療藥物[9]沒有報道稱發(fā)生過交叉耐藥現(xiàn)象，這就提示我們拓撲替康非?？赡茉谥委熌退幍哪[瘤細胞方面顯示較好的療效，這就不難得出結(jié)論，也有很多報道證實了拓撲替康在難治性白血病和急性早幼粒白血病的臨床治療方面療效好，同時療效佳在治療急性白血病、骨髓增生異常綜合征（MDS）和慢性粒細胞白血?。–MML）等臨床治療方面療效也有體現(xiàn)[10，11]。也有體外實驗證實，拓撲替康抗腫瘤活性表現(xiàn)在對急性T淋巴母細胞白血病JM細胞株、乳腺癌細胞株[12，13]和動物移植性模型轉(zhuǎn)接腫瘤的治療方面[14，15]?；A(chǔ)研究也表明，拓撲替康對多種移植性鼠、人腫瘤有效，有學(xué)者專門對耐藥的HT-29人結(jié)腸癌細胞株的拓撲替康藥物治療進行了研究，發(fā)現(xiàn)拓撲替康竟然能誘導(dǎo)腫瘤變小甚至消退，并且延緩腫瘤生長。另外，在對拓撲替康治療較敏感的腫瘤中，其持續(xù)性服藥進行治療的抗癌活性明顯比進行藥物沖擊性治療療效要優(yōu)越。國內(nèi)有文獻對移植性探鼠體內(nèi)這種動物模型的卵巢癌細胞進行了詳細細致的觀察，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)對探鼠進行局部注射拓撲替康后，卵巢癌的腫瘤體積較不進行拓撲替康治療的腫瘤體積變小，用拓撲替康治療后的腫瘤進行計算其抑制率的計算，結(jié)果可達75%。

本實驗檢測了利用MTT法得到的對細胞的增殖抑制率，并用抑制率數(shù)據(jù)繪制出了細胞增殖曲線，通過上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)了拓撲替康對HL-60細胞具有增殖抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物治療腫瘤的作用力度是和藥物濃度的大小和作用時間的長短不可分開的，濃度較大時間也長的藥物抑制腫瘤作用也強，但毒副反應(yīng)也隨之增多，當(dāng)然抗腫瘤作用也與特定藥物性質(zhì)有密切關(guān)系的。本研究通過MTT法探討了拓撲替康對HL-60細胞的增殖抑制的時間和濃度方面進行了實驗。檢測所得的數(shù)據(jù)顯示：同一時間點不同濃度的TPT（0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L）對HL-60細胞的抑制作用，隨著濃度的升高，拓撲替康的抑制作用顯得越來增強。TPT對 HL-60細胞增殖抑制作用，是其促進HL-60細胞凋亡的結(jié)果，但TPT誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡的具體機制，仍需進一步探討。

參考文獻

[1]李雪芬，程永貴，陸賽君，金麗.IA和MA方案治療急性髓系白血病臨床觀察 The response of acute myeloid leukemia（AML） to IA and MA regimen in the treatment.浙江臨床醫(yī)學(xué)，2002，4（7）：50-55.

[2]唐波，彭志紅，姜軍等.肼苯噠嗪與三苯氧胺協(xié)同抗雌激素受體α陰性乳腺癌的研究[J ] .中華實驗外科雜志，2005 ，22 （5） ：538-539

[3]王育生，張陽，呂申，等.拓撲替康對人乳腺癌細胞抗癌作用的研究[J].腫瘤研究與臨床，2002， 14（4）： 225

[4]Giles FJ， Faderl S， Thomas DA， et al. Randomized phaseI/II Study of troxacitabine combined with hcytarabine，idarubicin，or Topotecan inpatients with refractory myeloid leukemias. J Clin Oncol， 2003， 21（6）：1050-1056

[5]Rak J，Yu JL.Oncogenes and tumor angiogenesis： the question of vascular “supply”and “demand”. Semin Cancer Biol， 2004， 14（2）：93-103.

[6]Vaupel P， Mayer A. Hypoxia and anema： effects on tumor biology and treatment resistance. Transfus Clin Biol， 2005，12（1）：5-8.

[7]夏曙，于世英，袁響林，等.氧對肺腺癌細胞A549細胞p糖蛋白和多藥耐藥相關(guān)蛋白表達的影響.華醫(yī)學(xué)雜志，2004，84（8）：663-666.

[8]張春，譚天秩，匡安仁，等. 99Tcm-VIP-ASON對結(jié)腸癌HT29細胞的反義抑制研究.華核醫(yī)學(xué)雜志[J]，2003，23（3）：148-151.

[9]顧蘭兵等，MEA方案治療急性髓系白血病24例療效觀察.社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志[J] 2007，5（23）：20-22.

[10]Acs G，Zhang PJ，McGrath CM， et al. Hypoxia-inducible erythroprotein signaling in squmous dysplasia and aquamous cell carcinoma of the uterine cervix and its potential role in cervical carcinogensis and tumor progresssios [J]. Am J Patho， 2003，162（6）：1789-1806

[11]劉庭波，呂聯(lián)煌.c-myc反義寡脫氧核苷酸誘導(dǎo)人髓系白血病細胞系HL-60細胞凋亡.國實驗血液學(xué)雜志，2001，9（1）： 34-38

[12]Dore BT， U skokoricMR， Momparier RL， et al. Interaction of retinoic acid and vitam in D3 analogs on HL-60 myeloid leukem ic cells. L eukem ia Res， 1993， 17 （9） ：749-757

[13]唐波，彭志紅，姜軍等.肼苯噠嗪與三苯氧胺協(xié)同抗雌激素受體α陰性乳腺癌的研究[J ] .中華實驗外科雜志，2005 ，22 （5） ：538-539

[14]王育生，張陽，呂申，等.拓撲替康對人乳腺癌細胞抗癌作用的研究[J].腫瘤研究與臨床，2002， 14（4）： 225

[15]楊謹(jǐn)，肖菊香，李蓉.國產(chǎn)鹽酸拓撲替康治療晚期卵巢癌的療效觀察[J].西安交通人學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2006，27（ 3）： 208