蒼術(shù)酮對(duì)急性肺損傷小鼠保護(hù)作用的研究

陳天陽(yáng)，劉廷亮，侯天祿，平 鍵，胡毅翔，成 揚(yáng)，陳建杰

(1.上海市浦東新區(qū)傳染病醫(yī)院，上海 201299；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心，上海 200127；4.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與安全性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310013)

急性肺損傷是一種由直接因素或間接因素導(dǎo)致的急性缺氧性呼吸功能不全，其重癥表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征[1]，并且病死率較高。目前尚無(wú)治療急性肺損傷的特效藥物和手段，臨床主要以支持治療為主，因此，探索尋找新的藥物來(lái)治療急性肺損傷是非常緊要的。從傳統(tǒng)中草藥中尋找新的有效成分，或者在已知的有效成分中探索尋找新的藥理作用是一個(gè)重要方向[2]。蒼術(shù)用于治療呼吸道疾病已經(jīng)數(shù)千年[3],其所含化學(xué)成分較復(fù)雜，藥理活性較廣泛，但蒼術(shù)提取物及其活性成分對(duì)急性肺損傷的作用和機(jī)制尚不明確。本研究觀察了蒼術(shù)提取物蒼術(shù)酮對(duì)急性肺損傷小鼠肺組織病理、肺指數(shù)以及生存率的影響，旨在為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1動(dòng)物 雄性SPF級(jí)ICR小鼠，體質(zhì)量(22±2)g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(浙)2014-0001。

1.2藥物 中藥蒼術(shù)購(gòu)自華東藥業(yè)公司(上海)，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)鑒定，標(biāo)本(編號(hào)：y20141022)存放在浙江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系。

1.3蒼術(shù)酮的提取與分離 采用HA121的超臨界液體萃取儀(華安儀器廠，江蘇，中國(guó))進(jìn)行超臨界二氧化碳萃取。取蒼術(shù)飲片100 g粉碎成粉末，置于萃取釜內(nèi)，在350 bar壓力、50 ℃條件先動(dòng)態(tài)提取60 min，乙醇(99.9%)作為改性劑，流速為5 mL/min。超臨界二氧化碳流速設(shè)定為15 g/min，靜態(tài)萃取時(shí)間設(shè)定為30 min。去除溶劑，得到的產(chǎn)物濃度為5.8%。用于體外研究的超臨界二氧化碳萃取物溶于磷酸鹽緩沖液，濃度為1 mg/mL。將超臨界二氧化碳萃取物(50 g)用于硅膠柱，使用石油醚(沸點(diǎn)60～90 ℃)和乙酸乙酯(30∶1→1∶1，V/V)進(jìn)行分離。首先制備色譜柱：稱(chēng)取硅膠40 g，將硅膠與洗脫劑按比例混合(20∶1)，攪拌除去空氣泡，徐徐傾入色譜柱中，不能留有氣泡，然后加入石油醚將附著在管壁的硅膠洗下，使色譜柱面平整，平衡1 h后加入供試品進(jìn)行洗脫。將萃取物溶于石油醚中，沿著色譜柱管壁緩慢加入，當(dāng)液面下降至與柱表面相平時(shí)，即從色譜柱頂端沿管壁緩慢加入洗脫劑石油醚，打開(kāi)底閥，控制流速為1 mL/min，當(dāng)流過(guò)色譜柱的一個(gè)空體積后即用標(biāo)號(hào)的試劑瓶開(kāi)始收集。得到化合物4(6 mg)、化合物3(2 mg)、化合物5(50 mg)、化合物6(4 mg)、化合物1(10 mg)和化合物2(13 mg)。采用紫外光譜、質(zhì)譜分析、1H和13C核磁共振光譜鑒定，上述化合物分別為α-姜黃烯(6 mg)、蒼術(shù)醇(2 mg)、蒼術(shù)酮(50 mg)、蒼術(shù)呋喃烴(4 mg)、蒼術(shù)內(nèi)酯I(10 mg)、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(13 mg)。將蒼術(shù)酮低溫(-18 ℃)避光保存，備用。

1.4試劑與儀器 甲型流感A/PR/8/34病毒(H1N1亞型)和A/深圳/203/2001(H3N2亞型)由浙江省疾病預(yù)防控制中心保存；利巴韋林，上?，F(xiàn)代哈森(商丘)藥業(yè)有限公司；HA121超臨界液體萃取儀，江蘇華安儀器廠產(chǎn)品。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1實(shí)驗(yàn)一 取144只雄性SPF級(jí)ICR小鼠，體質(zhì)量(22±2)g，隨機(jī)選擇24只作為正常組，其余小鼠在乙醚麻醉下通過(guò)鼻內(nèi)接種甲型流感病毒誘導(dǎo)感染制作病毒性肺炎模型，然后隨機(jī)分為模型組、利巴韋林組、蒼術(shù)酮高劑量組、蒼術(shù)酮中劑量組和蒼術(shù)酮低劑量組，每組24只。造模2 h后，蒼術(shù)酮高、中、低劑量組分別給予40 mg/kg、20 mg/kg、10 mg/kg蒼術(shù)酮灌胃，利巴韋林組給予50 mg/kg利巴韋林灌胃，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，均每日1次，共5 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后每組隨機(jī)取10只小鼠處死，切除全肺并稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率。肺指數(shù)=小鼠肺質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量，肺指數(shù)抑制率=(模型組肺指數(shù)-干預(yù)組肺指數(shù))/模型組肺指數(shù)×100%。然后將肺組織固定在10%中性福爾馬林緩沖溶液中固定處理，石蠟包埋，切成4 μm切片，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行脫蠟和水化，切片進(jìn)行HE染色，鏡下觀察肺組織病理變化。

1.5.2實(shí)驗(yàn)二 另取120只雄性SPF級(jí)ICR小鼠，體質(zhì)量(22±2)g。造模、分組及干預(yù)同實(shí)驗(yàn)一，每組20只。灌胃5 d后繼續(xù)觀察，統(tǒng)計(jì)第15天各組小鼠的存活情況，并計(jì)算存活時(shí)間。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率比較 模型組肺指數(shù)明顯高于正常組(P<0.05)，利巴韋林組和蒼術(shù)酮各組肺指數(shù)均明顯低于模型組(P均<0.05),且利巴韋林組和蒼術(shù)酮高劑量組明顯低于蒼術(shù)酮低劑量組(P均<0.05)；利巴韋林組和蒼術(shù)酮高劑量組肺指數(shù)抑制率明顯高于蒼術(shù)酮低劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率比較

注：①與模型組比較，P<0.05；②與蒼術(shù)酮低劑量組比較，P<0.05。

2.2各組小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn) HE染色顯示，與模型組比較，各給藥組肺組織肺泡明顯，細(xì)胞相對(duì)較完整，炎性滲出減少，肺細(xì)胞間隔增厚較輕，細(xì)支氣管上皮柱狀細(xì)胞脫落減少。各組染色表現(xiàn)見(jiàn)圖1～6。

2.3各組小鼠生存情況 正常均存活；模型組存活3只(15%)，存活時(shí)間(7.9±2.8)d；利巴韋林組存活10只(50%)，存活時(shí)間(11.1±3.1)d；蒼術(shù)酮低劑量組存活6只(30%)，存活時(shí)間(9.3±3.6)d；蒼術(shù)酮中劑量組存活11只(55%)，存活時(shí)間(11.2±3.3)d；蒼術(shù)酮高劑量組存活14只(70%)，存活時(shí)間(12.4±2.6)d。利巴韋林組和蒼術(shù)酮各組小鼠生存率明顯高于模型組，存活時(shí)間顯著長(zhǎng)于模型組，且蒼術(shù)酮高劑量組生存率明顯高于蒼術(shù)酮低劑量組，存活時(shí)間顯著長(zhǎng)于蒼術(shù)酮低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

圖1 正常組小鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×200)

圖2 模型組小鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×200)

圖3 利巴韋林組小鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×200)

圖4 蒼術(shù)酮低劑量組小鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×200)

圖5 蒼術(shù)酮中劑量組小鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×200)

圖6 蒼術(shù)酮高劑量組小鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×200)

3 討 論

甲型流感病毒感染后，會(huì)引起紅細(xì)胞凝集和單核細(xì)胞浸潤(rùn)，造成肺部大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)而損傷正常細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，從而引起病毒性肺炎，表現(xiàn)為支氣管上皮細(xì)胞脫落，管壁血管擴(kuò)張充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血、大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)[4]。目前，甲型流感病毒造成的急性肺損傷病死率很高，但是尚無(wú)可行、有效的治療方法[5-6]。

蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù)Atractylodeslancea(Thunb.)DC.或北蒼術(shù)Atractylodeschinensis(DC.)Koidz.的干燥根莖[7]，味辛、苦，性溫，具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒的功效，其作為許多中藥方劑的組成部分，自古以來(lái)廣泛應(yīng)用于臨床?，F(xiàn)代藥理作用顯示蒼術(shù)具有抗炎、降血糖、抗缺氧、抗菌、抗病毒、保肝等作用[8]。蒼術(shù)屬植物的化學(xué)成分主要有揮發(fā)油、苷、糖、黃酮及甾醇、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等，揮發(fā)油由一系列倍半萜和聚乙烯炔類(lèi)及少量酚類(lèi)和倍半萜內(nèi)酯等組成，倍半萜主要成分為β-桉葉醇(β-Eudesmol)、茅術(shù)醇(Hinesol)和蒼術(shù)酮(Atractylon)等[9]，其中蒼術(shù)酮具有抗流感病毒的作用[10]。為此本實(shí)驗(yàn)觀察了蒼術(shù)酮對(duì)甲型流感病毒誘導(dǎo)的肺損傷保護(hù)作用，探討其用于臨床甲型流感病毒感染治療的價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，模型組肺指數(shù)明顯高于正常組，利巴韋林組和蒼術(shù)酮各組肺指數(shù)均明顯低于模型組,且利巴韋林組和蒼術(shù)酮高劑量組明顯低于蒼術(shù)酮低劑量組；各給藥組肺組織肺泡明顯，細(xì)胞相對(duì)較完整，炎性滲出減少，肺細(xì)胞間隔增厚較輕，細(xì)支氣管上皮柱狀細(xì)胞脫落減少；利巴韋林組和蒼術(shù)酮各組小鼠存活時(shí)間顯著長(zhǎng)于模型組，生存率明顯高于模型組，且蒼術(shù)酮高劑量組存活時(shí)間顯著長(zhǎng)于蒼術(shù)酮低劑量組，生存率明顯高于蒼術(shù)酮低劑量組。提示蒼術(shù)酮對(duì)甲型流感病毒所誘導(dǎo)的急性肺損傷具有保護(hù)作用，能夠明顯減輕肺部炎癥，可延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間，提高生存率，且呈劑量依賴(lài)性，為其臨床應(yīng)用提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。