阿司匹林對(duì)TNF-α誘導(dǎo)人早孕滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲的影響及機(jī)制*

蔡丹純， 王海臻， 廖丹丹， 鐘 梅， 高云飛， 盛 超

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院婦產(chǎn)科， 廣東 廣州 510515)

子癇前期(preeclampsia，PE)是一種以高血壓和蛋白尿?yàn)橹饕R床表現(xiàn)的嚴(yán)重危害母兒健康的妊娠期特發(fā)性疾病，在我國發(fā)病率為2%～8%，是圍生期母嬰死亡的主要原因之一[1]。目前主流觀點(diǎn)普遍認(rèn)為子宮螺旋動(dòng)脈重鑄障礙導(dǎo)致胎盤形成缺陷是PE發(fā)病的始動(dòng)因素[2-3]，而螺旋動(dòng)脈血管重鑄障礙的實(shí)質(zhì)是滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力下降[4]。滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力受基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)表達(dá)[5-6]及黏附分子表型轉(zhuǎn)化[7]等的影響。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2和MMP-9在PE孕婦胎盤組織中表達(dá)顯著降低，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能受損，螺旋動(dòng)脈重鑄不全[8]。

阿司匹林(aspirin)是環(huán)加氧酶抑制劑，可抑制前列腺素的合成，具有解熱、鎮(zhèn)痛和抗血小板聚集等作用，臨床應(yīng)用較廣泛。流行病學(xué)研究表明，對(duì)于有PE高危因素的孕婦從孕11～14周開始口服小劑量阿司匹林直至孕36周，可明顯降低PE的發(fā)生率[9-12]。Li等[13]發(fā)現(xiàn)，小劑量阿斯匹林可通過抑制環(huán)加氧酶1，降低暴露于缺氧環(huán)境下的原代滋養(yǎng)細(xì)胞中可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體1的表達(dá)和釋放，進(jìn)而對(duì)小劑量阿司匹林預(yù)防PE的發(fā)生做出了合理的解釋。然而，目前尚缺乏阿司匹林對(duì)于絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞功能影響的直接證據(jù)。本研究擬利用體外細(xì)胞模型，深入探討阿司匹林對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲的影響及調(diào)控機(jī)制，為阿司匹林預(yù)防PE的發(fā)生提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

選擇南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院2015年12月～2017年12月住院分娩的PE孕婦20例作為PE組，另以同期因社會(huì)因素行擇期剖宮產(chǎn)術(shù)的20例無合并癥的正常孕婦為正常對(duì)照(control)組。本研究取得了所有受試對(duì)象的知情同意，并且通過了南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。PE診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)妊娠期高血壓疾病學(xué)組2015年提出的妊娠期高血壓疾病診治指南[14]。所有研究對(duì)象均為單胎妊娠。正常對(duì)照組孕婦無吸煙、酗酒及長期服用藥物史，無高血壓、糖原病、心臟病、腎臟病等妊娠合并癥；既往未發(fā)生過反復(fù)自然流產(chǎn)、胎兒畸形、死胎和死產(chǎn)等，此次妊娠因社會(huì)因素行剖宮產(chǎn)術(shù)。

本研究所用的細(xì)胞系為永生化的人早孕滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo，由加拿大皇后大學(xué)Charles H.Graham教授惠贈(zèng)。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)和阿司匹林購自Sigma； CCK-8檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;蛋白提取試劑盒購自普利萊基因技術(shù)有限公司；抗細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)抗體購自Cell Signaling Technology；抗增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抗體購自Abcam；抗β-actin抗體購自武漢博士德公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG購自北京中杉金橋公司； MMP-2及MMP-9 ELISA試劑盒購自Abcam； MMP-2/MMP-9活性檢測(cè)試劑盒購自AnaSpec。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1標(biāo)本收集 在分娩前抽取孕婦肘靜脈血3 mL，室溫自凝30 min后，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離出血清，置于-80 ℃冰箱保存。胎盤娩出后5 min內(nèi)于胎盤母體面臍帶旁開2 cm左右處，避開機(jī)化灶、鈣化灶和出血灶迅速取胎盤組織4塊，每塊約1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm，部分置于10%甲醛固定，用于隨后組織形態(tài)觀察。

2.2HE染色觀察胎盤組織形態(tài) 胎盤組織經(jīng)固定、脫水、透明、石蠟包埋及切片，切片厚度為4 μm，常規(guī)HE染色，觀測(cè)胎盤子宮螺旋動(dòng)脈管徑的變化。

2.3細(xì)胞的培養(yǎng) 早孕滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，適時(shí)換液及傳代。

2.4CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長期的HTR-8/SVneo細(xì)胞，接種于96孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，之后給予TNF-α (0.5 μg/L)和不同濃度(0.1、1和10 mmol/L)的aspirin，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，處理24 h。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立空白組。各組細(xì)胞作用至規(guī)定時(shí)點(diǎn)后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)孔在450 nm波長處的吸光度(A) 值。細(xì)胞活力(%) =(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。

2.5Western blot檢測(cè)Cyclin D1及PCNA蛋白的表達(dá)水平 將對(duì)數(shù)期生長的HTR-8/SVneo細(xì)胞,分為4組：對(duì)照(control)組、TNF-α組、aspirin組和TNF-α+aspirin組，按3×106個(gè)接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，對(duì)4組細(xì)胞分別進(jìn)行如下處理： TNF-α組加入0.5 μg/L TNF-α; aspirin組加入0.1 mmol/L aspirin; TNF-α+aspirin組分別加入0.5 μg/L TNF-α和0.1 mmol/L aspirin;對(duì)照組加入與上述藥物等體積的PBS。處理24 h后裂解各組細(xì)胞提取總蛋白，用全自動(dòng)生化分析儀(Beckman)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)蛋白濃度取適量進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜后，將膜置于含5%脫脂奶粉的TBST中搖床上封閉2 h，用TBST洗膜10 min，共3次，分別用抗cyclin D1、PCNA及β-actin的Ⅰ抗按適當(dāng)比例4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗孵育2 h，TBST洗膜3次，化學(xué)發(fā)光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 4 ℃融化Matrigel，于冰上將Matrigel用PBS按照1∶8稀釋。把Transwell小室放入24孔板中，取50 μL稀釋好的Matrigel鋪在小室內(nèi)，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中2～3 h促膠凝固。Transwell上室中分別加入4個(gè)組的細(xì)胞懸液(1×105/L)200 μL，下室中加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，清洗膜，甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色5 min，顯微鏡下拍照，隨機(jī)取6個(gè)不同的視野(×200)觀察并記錄穿膜的細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算每組小室細(xì)胞的平均數(shù)。

2.7ELISA法檢測(cè)MMP-2及MMP-9水平 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)對(duì)照組、TNF-α組、aspirin組和TNF-α+aspirin組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2及MMP-9表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8MMP-2/MMP-9活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MMP-2及MMP-9活性水平 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)對(duì)照組、TNF-α組、aspirin組和TNF-α+aspirin組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2及MMP-9活性水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料均用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)符合正態(tài)性分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PE孕婦胎盤組織中子宮螺旋動(dòng)脈血管重鑄障礙

HE染色顯示，與對(duì)照組孕婦比較，PE組孕婦的胎盤組織子宮螺旋動(dòng)脈管徑變小，血管平滑肌增厚，提示螺旋動(dòng)脈血管重鑄障礙,見圖1。

Figure 1. Uterine spiral artery in preeclampsia (PE) placenta was narrow (×200).

2 孕婦血清中MMP-2及MMP-9濃度

采用ELISA法檢測(cè)對(duì)照組及PE組孕婦血清中MMP-2及MMP-9濃度，結(jié)果表明PE組MMP-2及MMP-9濃度明顯低于對(duì)照組(P<0.05),見圖2。

Figure 2. Serum levels of MMP-2 and MMP-9 were lower in preeclampsia (PE) women. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group.

3 阿司匹林對(duì)HTR-8/SVneo早孕滋養(yǎng)細(xì)胞活力的影響

CCK-8結(jié)果顯示，0.5 μg/L TNF-α體外刺激HTR-8/SVneo細(xì)胞后，細(xì)胞活力顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。不同濃度aspirin處理后對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生不同影響，與對(duì)照組相比，0.1 mmol/L aspirin處理組細(xì)胞活力顯著增加，而 1和10 mmol/L aspirin處理組細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)；同樣，與TNF-α單獨(dú)處理組相比，不同濃度aspirin(0.1、1和10 mmol/L)與TNF-α共同處理細(xì)胞后，0.1 mmol/L Aspirin處理可顯著提高細(xì)胞活力，而1和10 mmol/L aspirin處理不能明顯提高細(xì)胞活力,見圖3。我們認(rèn)為小劑量阿司匹林對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞起保護(hù)作用，于是在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用0.1 mmol/L作為處理濃度。

4 阿司匹林對(duì)TNF-α刺激下HTR-8/SVneo細(xì)胞cyclin D1及PCNA表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，TNF-α處理細(xì)胞后，cyclin D1及PCNA蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組；然而，TNF-α+aspirin共同處理細(xì)胞后，cyclin D1及PCNA蛋白表達(dá)水平顯著高于TNF-α組(P<0.05),見圖4。

Figure 3. Effects of aspirin and TNF-α on HTR-8/SVneo cell viability. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTNF-α group.

圖3阿司匹林對(duì)TNF-α刺激下HTR-8/SVneo細(xì)胞活力的影響

Figure 4. Effects of aspirin and TNF-α oncyclin D1 and PCNA protein levels in HTR-8/SVneo cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTNF-α group.

5 阿司匹林對(duì)TNF-α刺激下HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示，TNF-α組小室的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；TNF-α+aspirin組小室的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯高于TNF-α組(P<0.05)，見圖5。這表明TNF-α抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲，阿司匹林能逆轉(zhuǎn)這一作用。

6 阿司匹林對(duì)TNF-α刺激下HTR-8/SVneo細(xì)胞MMP-2及MMP-9表達(dá)的影響

ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2及MMP-9表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TNF-α處理細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2及MMP-9表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；然而，TNF-α+aspirin共同處理細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2及MMP-9表達(dá)水平顯著高于TNF-α組(P<0.05)，見圖6。

7 阿司匹林對(duì)TNF-α刺激下HTR-8/SVneo細(xì)胞MMP-2及MMP-9活性的影響

TNF-α處理細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2及MMP-9活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；然而，TNF-α+aspirin共同處理細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2及MMP-9活性顯著高于TNF-α組(P<0.05)，見圖7。

Figure 5. Effects of aspirin and TNF-α on HTR-8/SVneo cell invasion ability measured by Transwell assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTNF-α group.

討 論

PE是一種妊娠期特發(fā)性疾病，是圍生期母嬰死亡的主要原因之一，終止妊娠乃是唯一有效的治療方式。正常妊娠10周時(shí)，胎盤絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞沿螺旋動(dòng)脈逆行侵襲，逐漸取代血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管肌肉彈力層被纖維素樣物質(zhì)取代，致使管腔擴(kuò)大、阻力降低、血流增加, 此過程為生理性螺旋動(dòng)脈血管重鑄。PE孕婦子宮螺旋動(dòng)脈血管內(nèi)滋養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量極少，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)子宮螺旋動(dòng)脈的重鑄極其不足，引起管腔狹窄，胎盤發(fā)育不完善[15-16]。因此子宮螺旋動(dòng)脈重鑄障礙導(dǎo)致胎盤形成缺陷可能是PE發(fā)病的始動(dòng)因素[2-3]，而其實(shí)質(zhì)是滋養(yǎng)細(xì)胞生理侵襲能力下降[4]。

Figure 6. Effects of aspirin and TNF-α on MMP-2 and MMP-9 levels in HTR-8/SVneo cell culture supernatants analyzed by ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTNF-α group.

Figure 7. Effects of aspirin and TNF-α on MMP-2 and MMP-9 activity in HTR-8/SVneo cell culture supernatants analyzed by MMP-2/MMP-9 activity assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTNF-α group.

Roberge等[11]采用薈萃分析方法發(fā)現(xiàn)，對(duì)于有PE高危因素的孕婦從孕16周前開始口服小劑量阿司匹林直至孕34～36周，可明顯降低早發(fā)型PE和胎兒宮內(nèi)生長受限的發(fā)生率，然而超過孕16周后口服阿司匹林不能預(yù)防PE和胎兒宮內(nèi)生長受限的發(fā)生。該流行病學(xué)研究結(jié)果中阿司匹林起預(yù)防作用的有效時(shí)間(孕16周前)與生理性螺旋動(dòng)脈血管重鑄完成的時(shí)間(孕13～18周)基本相符，因此猜測(cè)阿司匹林可能是通過改善滋養(yǎng)細(xì)胞的功能進(jìn)而起到預(yù)防PE的作用。目前越來越多的學(xué)者認(rèn)識(shí)到，PE是母親對(duì)妊娠的一種過度炎癥反應(yīng)[17-18]。因此本實(shí)驗(yàn)中，我們利用TNF-α刺激HTR-8/SVneo細(xì)胞體外模擬PE炎癥環(huán)境，探討阿司匹林對(duì)絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲的影響。

阿斯匹林為乙酰水楊酸類藥物, 它作用于前列腺素合成過程中的第1個(gè)合成酶——環(huán)加氧酶, 使脂肪酸環(huán)加氧酶不可逆地乙酰化而失活，進(jìn)而抑制PGI2和TXA2的合成，因此在臨床上被廣泛應(yīng)用于抑制血小板聚集并阻止血栓形成[19]。近年來通過對(duì)阿司匹林的深入研究，學(xué)者發(fā)現(xiàn)阿司匹林不僅可以預(yù)防血栓形成，同時(shí)對(duì)細(xì)胞功能也有顯著的影響。Cao等[20]以顱骨缺損的迷你豬為模型，發(fā)現(xiàn)阿司匹林局部給藥可抑制TNF-α和干擾素的產(chǎn)生，進(jìn)而提高嚙齒類動(dòng)物的顱骨修復(fù)，提示阿司匹林可促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化。Xu等[21]利用TNF-α體外刺激滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，阿司匹林可通過抑制PGF1α的表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞取代內(nèi)皮細(xì)胞血管重塑的能力。本研究采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)小劑量(0.1 mmol/L)阿司匹林可促進(jìn)HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖，然而大劑量(1和10 mmol/L)阿司匹林可明顯抑制細(xì)胞活性。研究表明，大劑量阿司匹林可抑制多種細(xì)胞生長增殖。Law等[22]證實(shí)阿司匹林可抑制P70核糖體蛋白S6激酶(p70S6K)活性，從而延長細(xì)胞周期，抑制角朊細(xì)胞Balb/MK生長。Goel等[23]發(fā)現(xiàn)阿司匹林可上調(diào)MMR蛋白表達(dá)，從而降低人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480生長速率，抑制細(xì)胞增殖。

Cyclin D1是一個(gè)重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，通過結(jié)合細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4、磷酸化并失活視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白，在G1到S過渡的細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[24-25];PCNA存在于正常增殖細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞內(nèi), 與細(xì)胞DNA合成密切相關(guān)，對(duì)細(xì)胞增殖起著重要作用。本研究中，阿司匹林處理滋養(yǎng)細(xì)胞后，cyclin D1及PCNA蛋白表達(dá)明顯增加，提示阿司匹林可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖。另外，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNF-α+aspirin組滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力較TNF-α組明顯增加；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2及MMP-9表達(dá)水平、MMP-2/MMP-9活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MMP-2及MMP-9活性，發(fā)現(xiàn)TNF-α+aspirin組MMP-2及MMP-9表達(dá)水平及活性均較TNF-α組明顯上升。這些結(jié)果提示阿司匹林可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力，從而改善螺旋動(dòng)脈重鑄異常情況。