原花青素B1與B2抑制脂多糖誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)作用的比較*

王 青， 宋麗娟， 李艷花， 楊智超， 王 婧， 劉建春， 姜維佳， 馬存根△

(1山西中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點(diǎn)研究室, 山西 太原 030024；2山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科， 山西 太原 030001；3大同大學(xué)腦科學(xué)研究所， 山西 大同 037009)

原花青素(proanthocyanidins/procyanidins，PC)是廣泛存在于葡萄籽、松樹(shù)皮、蓮房、蘋(píng)果、藍(lán)莓、黑枸杞和薔薇果等植物組織器官中的、由不同數(shù)目黃烷-3-醇類(lèi)化合物(兒茶素、表兒茶素或沒(méi)食子酸)縮合而成的多酚類(lèi)化合物。根據(jù)縮合數(shù)量的多少，將其二至四聚體稱(chēng)為原花青素低聚體(oligomeric proanthocyanidins，OPCs)，五聚體以上的稱(chēng)為原花青素高聚體(polymeric proanthocyanidins，PPCs)。PC由于其強(qiáng)大的抗氧化活性而被人們發(fā)現(xiàn)和研究，其對(duì)氧自由基有很強(qiáng)的清除能力，抗氧化能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于維生素C和維生素E。除此之外，藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，PC在防治腫瘤、心血管疾病、抗炎及調(diào)節(jié)免疫等方面具有顯著功效[1]，且相對(duì)于PPCs和OPCs具有更強(qiáng)的生物活性。

目前的研究主要關(guān)注PC的作用機(jī)制，而其效應(yīng)主要通過(guò)哪些成分起作用尚不知道。OPCs中研究最多的是PC二聚體。組成二聚體的單體，由于分子構(gòu)象和鍵合部位的不同，存在著多種異構(gòu)體，其中關(guān)于原花青素B1 (PC-B1)和B2 (PC-B2)的研究最為廣泛。它們是由C4→C8鍵合的同分異構(gòu)體，是活性較強(qiáng)的二聚體，能透過(guò)血腦屏障，順利到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，都具有強(qiáng)大的抗氧化和抗炎的作用[2-3]。但作為同分異構(gòu)體，它們的藥理活性的區(qū)別和對(duì)比研究卻很少，只有Shilpi等[4]報(bào)道PC-B2具有更強(qiáng)的抗惡性腫瘤活性。本研究以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2炎癥模型為研究對(duì)象，試圖從抗炎方面觀察比較PC-B1和PC-B2活性的強(qiáng)弱，為其作用于神經(jīng)炎癥提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料與儀器

CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Molecular Devices)；垂直電泳槽、小型濕法轉(zhuǎn)膜儀和基礎(chǔ)通用電源(Bio-Rad)；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon)。DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；BV-2細(xì)胞(武漢大學(xué)細(xì)胞庫(kù))；脂多糖和Lysis細(xì)胞裂解液(Sigma)；胎牛血清(Gibco)；MTT(碧云天)；MMK-1(Tocris Bioscience)；PVDF膜(Milipore)；BCA和ECL(Thermo)；抗β-actin、p-NF-κB p65(S536)和NF-κB p65抗體(Bioworld)；白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) ELISA測(cè)定試劑盒(R&D)；DAPI(碧云天)；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔 II 抗(Abcom)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1MTT實(shí)驗(yàn) 高糖DMEM培養(yǎng)液(含10% 胎牛血清)培養(yǎng)BV-2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×108/L，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，隔夜培養(yǎng)后，各孔分別加入濃度為2.5、5、10、20、30、50和100 mg/L的PC-B1和PC-B2，孵育24 h、48 h和72 h后，各孔加入5%的MTT 10 μL，37 ℃孵育4 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO溶解，在490 nm處檢測(cè)，測(cè)定其吸光度。空白對(duì)照(0 mg/L)組加入的是等體積的含有10% 胎牛血清的高糖DMEM。

2.2ELISA法檢測(cè)IL-1β和TNF-α 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV-2細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×108/L，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，培養(yǎng)12 h后，加入1 mg/L的 LPS 孵育6 h，再分別加入5、10、20和50 mg/L的PC-B1和PC-B2。設(shè)空白對(duì)照(control)組、LPS組、LPS+PC-B1組和LPS+PC-B2組，每組3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)18 h，用ELISA法檢測(cè)IL-1β和TNF-α的水平。

2.3Transwell趨化實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV-2細(xì)胞懸液，接種于35 mm培養(yǎng)皿，設(shè)空白組和LPS組，LPS作用6 h后，2組細(xì)胞用含有10% 胎牛血清的高糖DMEM重懸，且細(xì)胞數(shù)分別調(diào)整為5×108/L。LPS組被0、20和20 mg/L的PC-B1和PC-B2孵育1 h后，再分別取200 μL細(xì)胞置于Transwell小室上室。設(shè)空白組、LPS組、LPS+PC-B1組和LPS+PC-B2組，下室以20 μmol/L的MMK-1為趨化劑。在CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)液，用PBS洗3次，甲醇固定10 min，5 mg/L的DAPI室溫孵育20 min后，PBS洗3次，正置熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.4Western blot 實(shí)驗(yàn) BV-2細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿，用1 mg/L的LPS孵育6 h后，分別再加入20 mg/L的PC-B1和PC-B2, 培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，用RAPI裂解液，提取BV-2細(xì)胞總蛋白，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。蛋白上樣量為20～40 μg，行10% SDS-PAGE分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入I 抗4 ℃過(guò)夜，TBST洗3次，室溫孵育 II 抗2 h，ECL法檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。單因素方差分析(one-way ANOVA)后，用Dunnett’s test比較實(shí)驗(yàn)組與單一對(duì)照組間的差異；用SNK-q檢驗(yàn)多組間多重比較差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PC-B1與PC-B2對(duì)BV-2細(xì)胞活力的影響

不同濃度的PC-B1和PC-B2分別孵育BV-2細(xì)胞24 h、48 h和72 h，中、高濃度(30、50和100 mg/L)的藥物可顯著促進(jìn)BV-2細(xì)胞增殖；隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，低濃度的藥物(10和20 mg/L)亦能顯著促進(jìn)BV-2細(xì)胞活力(P<0.05或P<0.01),見(jiàn)圖1。這表明PC-B1和PC-B2的給藥濃度在100 mg/L之內(nèi)對(duì)BV-2細(xì)胞的活力隨濃度的增加而增強(qiáng)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度的確定提供了依據(jù)。

Figure 1. The viability of BV-2 cells incubated with proanthocyanidins B1 and B2 (PC-B1 and PC-B2) for 24 h, 48 h and 72 h. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

2 PC-B1與PC-B2對(duì)BV-2細(xì)胞炎癥因子分泌的影響

與空白組相比，LPS孵育BV-2細(xì)胞后，使細(xì)胞上清液中IL-1β和TNF-α的濃度顯著升高(P<0.01);不同濃度的PC-B1和PC-B2孵育BV-2細(xì)胞后，與LPS組相比較，2種藥物均可顯著抑制IL-1β和TNF-α的分泌，其中20 mg/L的藥物濃度效應(yīng)最強(qiáng)(P<0.01),見(jiàn)圖2。

3 PC-B1與PC-B2對(duì)BV-2細(xì)胞趨化能力的影響

用甲酰肽受體2(formyl peptide receptor 2，F(xiàn)PR2)特異性的激動(dòng)劑MMK-1作為趨化劑，考察BV-2細(xì)胞的趨化行為。結(jié)果表明，MMK-1可誘導(dǎo)LPS刺激的BV-2細(xì)胞趨化(P<0.05)。前期實(shí)驗(yàn)證明PC-B1和PC-B2最佳作用濃度是20 mg/L，因此趨化實(shí)驗(yàn)采用20 mg/L的PC-B1和PC-B2孵育BV-2細(xì)胞，結(jié)果表明，與LPS組相比較，PC-B1和PC-B2均可顯著減少M(fèi)MK-1誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞趨化(P<0.05),見(jiàn)圖3。

4 PC-B1與PC-B2對(duì)BV-2細(xì)胞NF-κB磷酸化的影響

經(jīng)LPS刺激后，BV-2細(xì)胞中NF-κB p65的S536磷酸化增加(P<0.05)，而PC-B1和PC-B2(20 mg/L)可顯著下調(diào)其磷酸化水平(P<0.05),見(jiàn)圖4。

Figure 2. The inhibitory effects of proanthocyanidins B1 and B2 (PC-B1 and PC-B2) on secretion of IL-1β and TNF-α in BV-2 cells induced by LPS. Mean±SEM.n=3.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsLPS group.

圖2原花青素B1和B2對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞炎癥因子IL-1β和TNF-α釋放的影響

討 論

神經(jīng)炎癥主要由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)，小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞，識(shí)別異物和有害刺激后，其細(xì)胞膜表面與免疫和炎癥相關(guān)的受體表達(dá)急劇增加，如FPR2、晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)和CD36等[5-6]，具有促進(jìn)宿主防御和修復(fù)以及神經(jīng)毒性的雙重作用[7]。異常激活的小膠質(zhì)細(xì)胞，可通過(guò)釋放大量的炎癥因子，趨化更多的炎癥細(xì)胞進(jìn)入中樞，引發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)炎癥，從而對(duì)正常的神經(jīng)組織造成損傷，加重神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展[8]。LPS可誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞FPR2表達(dá)增加，F(xiàn)PR2是G蛋白偶聯(lián)受體中趨化受體家族中的一員，具有復(fù)雜的功能，能通過(guò)與不同起源和高度結(jié)構(gòu)多樣性的配體結(jié)合介導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)[9-10]。其激動(dòng)劑MMK-1可通過(guò)FPR2趨化和激活中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和T細(xì)胞，促進(jìn)IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌，促進(jìn)細(xì)胞趨化，發(fā)揮促炎的作用[9-10]。因此本研究以MMK-1為趨化劑，考察藥物對(duì)細(xì)胞趨化行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMK-1可以顯著趨化LPS刺激的BV-2細(xì)胞，而PC-B1與PC-B2可拮抗此效應(yīng)，表明PC-B1與PC-B2可通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞表面的受體功能，減少免疫細(xì)胞的趨化，進(jìn)而緩解炎癥。

此外，研究表明，經(jīng)LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞與原代小膠質(zhì)細(xì)胞非常相似，可激活NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控NO生成，促進(jìn)炎癥因子IL-1β和TNF-α的分泌，與T細(xì)胞和神經(jīng)元相互作用，并能刺激其它的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎因子[11]。NF-κB信號(hào)通路完全激活與NF-κB p65的磷酸化是分不開(kāi)的，因此本研究采用LPS激活BV-2細(xì)胞的體外神經(jīng)炎癥模型，考察了NF-κB p65中與細(xì)胞趨化和炎癥因子分泌相關(guān)的S536的磷酸化[12]，結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，有NF-κB的參與，且PC-B1和PC-B2可以抑制NF-κB信號(hào)通路的活化。

Figure 4. The inhibitory effect of proanthocyanidins B1 and B2 (PC-B1 and PC-B2) on phosphorylation of NF-κB in LPS-induced BV-2 cells. Mean±SEM.n=3.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsLPS group.

PC-B1與PC-B2均為單一組分，是PC的主要成分。研究它們的藥理活性，一方面可以明確PC發(fā)揮作用的主要活性成分；另一方面，作為同分異構(gòu)體，研究PC-B1和PC-B2的藥理活性，有利于通過(guò)其生物學(xué)效應(yīng)，找到它們相應(yīng)的作用靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，PC-B1和PC-B2均具有較強(qiáng)的抑制LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用，它們都可以顯著抑制IL-1β和TNF-α的分泌、BV-2細(xì)胞的趨化和NF-κB磷酸化。體外實(shí)驗(yàn)證明了PC-B1和PC-B2可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨碌纳窠?jīng)炎癥，它們都是PC發(fā)揮藥理活性的主要成分，提示PC-B1和PC-B2可能通過(guò)抗神經(jīng)炎癥發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。下一步實(shí)驗(yàn)可通過(guò)對(duì)炎癥相關(guān)功能蛋白的篩選來(lái)研究它們可能的作用靶點(diǎn)，明確它們抑制小膠質(zhì)細(xì)胞異常活化的機(jī)制，以期為其成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床防治藥物提供可靠依據(jù)。