蟲草素通過ERK1/2、Ezrin和Akt信號(hào)通路抑制膽囊癌細(xì)胞SNU-308的增殖和遷移*

劉特思， 呂 游， 閆文帝， 王 雪， 劉小慶， 樸英實(shí), 2， 林貞花, 2， 任香善, 2△

(1延邊大學(xué)腫瘤研究中心，2延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，3吉林市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 延吉 133002)

膽囊癌是一種來源于膽囊上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差、早期癥狀不典型，臨床上大多數(shù)患者確診時(shí)已為中晚期[1]。目前，膽囊癌治療方法有限，外科手術(shù)切除是唯一有效的根治方法[2]，因此尋找一種高效、低毒且副作用小的治療藥物迫在眉睫。

近年來，中醫(yī)中藥治療在腫瘤治療中的作用越來越受到重視。蟲草素(cordycepin)是分離提取自冬蟲夏草和蛹蟲草等多種蟲草的核苷類似物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌抗炎和抗腫瘤等[3-5]多種生物活性。研究證實(shí)，蟲草素可通過抑制mRNA合成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)[6]。目前，尚未有文獻(xiàn)闡明蟲草素抑制膽囊癌SNU-308細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制。

本研究旨在探究蟲草素對(duì)膽囊癌SNU-308細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用，并闡明其相關(guān)機(jī)制，為蟲草素在臨床上治療膽囊癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞系和試劑

1.1細(xì)胞系 膽囊癌細(xì)胞SNU-308購(gòu)自韓國(guó)細(xì)胞株銀行。

1.2主要試劑 蟲草素購(gòu)自Sigma-Aldrich，用DMSO配制成濃縮液，分裝保存于-20 ℃冰箱；抗FasL、Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素C (cytochrome C，Cyto C)、cleaved caspase-3、LC3、beclin 1、Akt、p-Akt、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal regulated kinase1/2，ERK1/2)、p-ERK1/2、Ezrin和p-Ezrin抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology；抗β-actin抗體購(gòu)自Abcam；抗Fas抗體購(gòu)自Proteintech；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和Opti-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD；Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)購(gòu)自Gene Copoeia；Ezrin小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)試劑購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司；Lipo 3000購(gòu)自Invitrogen。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) SNU-308細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素)培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.2MTT實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SNU-308細(xì)胞，以每孔10 000個(gè)接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)設(shè)置0、5、10、20和40 μmol/L蟲草素用藥組，每組設(shè)置6個(gè)平行孔。在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48和72 h后每孔加入MTT(5 g/L)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸取上清，加入200 μL DMSO充分振蕩，用全波長(zhǎng)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)吸光度(A)值。

2.3平板集落形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SNU-308細(xì)胞，常規(guī)消化細(xì)胞，以每孔500個(gè)的細(xì)胞密度接種于6孔板中，次日更換為完全培養(yǎng)液及含5、10和20 μmol/L蟲草素的培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，用PBS緩沖液清洗2次，4%多聚甲醛固定，Giemsa染液染色，自然干燥后，進(jìn)行拍照并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.4Annexin V/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SNU-308細(xì)胞接種于35 mm 培養(yǎng)皿，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右融合時(shí)，分別給予對(duì)照組和用藥組細(xì)胞0、5、10和20 μmol/L的蟲草素工作液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；陽(yáng)性對(duì)照組加入10 μmol/L的H2O2處理2 h。常規(guī)消化收集細(xì)胞，進(jìn)行Annexin V-FITC和PI染色，用C6流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.5Western blot實(shí)驗(yàn) 分別給予對(duì)照組和用藥組細(xì)胞0、5、10和20 μmol/L的蟲草素處理48 h，提取細(xì)胞總蛋白，取40 μg蛋白行8%～10% SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉中封閉1 h，分別加入I抗 [Fas (1∶1 000)、FasL (1∶1 000)、Bax (1∶1 000)、Bcl-2 (1∶1 000)、Cyto C (1∶1 000)、cleaved caspase-3 (1∶1 000)、LC3 (1∶1 000)、beclin 1 (1∶1 000)、p-Akt (1∶1 000)、Akt (1∶1 000)、p-ERK1/2 (1∶2 000)、ERK1/2 (1∶1 000)、p-Ezrin (1 ∶1 000)、Ezrin (1∶2 000)和β-actin (1∶3 000) ] 4 ℃過夜，加HRP標(biāo)記的 II 抗室溫孵育1 h，ECL顯色發(fā)光檢測(cè)。

2.6免疫熒光染色 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SNU-308細(xì)胞，接種于8孔細(xì)胞培養(yǎng)載玻片，用20 μmol/L的蟲草素處理24 h，4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X-100處理10 min，3% BSA封閉30 min，加入抗LC3抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜，再加山羊抗兔IgG(H+L) (1∶500)室溫孵育1 h，DAPI 染細(xì)胞核，封片后拍照觀察。

2.7細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合后，用不含血清的培養(yǎng)液饑餓處理細(xì)胞6～8 h。用200 μL的滅菌槍頭呈“1”字形進(jìn)行劃痕，PBS清洗后，更換為0、5、10和20 μmol/L的蟲草素工作液，繼續(xù)培養(yǎng)，在0 h、24 h和48 h進(jìn)行拍照，記錄劃痕寬度。

2.8細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SNU-308細(xì)胞，制備2×108/L的細(xì)胞懸液，取100 μL接種于Transwell小室中，待細(xì)胞貼壁后，上室分別加入含1% FBS的0和20 μmol/L蟲草素工作液，24孔板下室加入600 μL含10% FBS的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)18 h，4%多聚甲醛固定，蘇木素染色，自來水脫色，無水乙醇脫水后，取出小室，棉簽擦凈未遷移的細(xì)胞，切下小室薄膜，拍照觀察。

2.9Ezrin基因沉默對(duì)SNU-308細(xì)胞遷移的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SNU-308細(xì)胞接種于35 mm 培養(yǎng)皿，待細(xì)胞生長(zhǎng)至30%～50%融合后，用2 mL Opti-MEM培養(yǎng)基、5 μL Lipo 3000和5 μL Ezrin siRNA(50 nmol/L)混合液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，做后續(xù)Western blot實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)。

2.10Akt和ERK1/2抑制劑對(duì)SNU-308細(xì)胞遷移的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SNU-308細(xì)胞，分別用5 nmol/L的ERK1/2抑制劑GDC-0994和5 μmol/L的Akt抑制劑Akti-1/2處理48 h，做劃痕愈合實(shí)驗(yàn)，分別在0 h、24 h和48 h拍照。另取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分別用5和10 nmol/L的GDC-0994及1和5 μmol/L的Akti-1/2處理細(xì)胞，后續(xù)Western blot實(shí)驗(yàn)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究所有數(shù)據(jù)用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示；多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用LDS-t檢驗(yàn)；2個(gè)獨(dú)立樣本間的比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 蟲草素顯著抑制膽囊癌SNU-308細(xì)胞活力和集落形成能力

不同濃度的蟲草素作用于膽囊癌細(xì)胞SNU-308 24 h、48 h和72 h后發(fā)現(xiàn)，與0 μmol/L組相比，各用藥組均可顯著抑制膽囊癌細(xì)胞的活力，且在同一時(shí)點(diǎn)，隨藥物濃度增加其抑制效果更加顯著(P<0.05)，見圖1A；與0 μmol/L組相比，分別加入5、10和20 μmol/L蟲草素處理細(xì)胞7 d后，SNU-308細(xì)胞的集落形成能力明顯降低(P<0.05，P<0.01)，見圖1B，結(jié)果提示，蟲草素可抑制膽囊癌細(xì)胞的活力和集落形成能力。

Figure 1. Cordycepin inhibited the growth of SNU-308 cells. A: the cell viability was measured by MTT assay; B: the representative images of colony formation treated with cordycepin in SNU-308 cells were showed and quantitatively analyzed. Mean±SD.n=3.* P<0.05，** P<0.01vs0 μmol/L group.

2 蟲草素誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞SNU-308凋亡

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，經(jīng)5、10和20 μmol/L的蟲草素處理48 h后，與對(duì)照組相比SNU-308細(xì)胞的凋亡率明顯增加(P<0.05，P<0.01)，見圖2A;Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在線粒體途徑中，抑凋亡因子Bcl-2表達(dá)下調(diào)，促凋亡因子Bax表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞色素C表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；而在死亡受體途徑中，死亡受體Fas及其配體FasL和cleaved caspase-3的蛋白水平均上調(diào)(P<0.05)，見圖2B，提示蟲草素通過內(nèi)外源性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤生長(zhǎng)。

3 蟲草素誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞SNU-308自噬

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)20 μmol/L蟲草素處理的SNU-308細(xì)胞的胞漿中，其自噬相關(guān)蛋白LC3綠色熒光顆粒數(shù)量明顯增多，熒光強(qiáng)度也明顯增強(qiáng)，見圖3A；Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3和beclin 1的蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，蟲草素作用于膽囊癌細(xì)胞48 h后，beclin 1的表達(dá)上調(diào)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增高(P<0.05)，見圖3B,說明蟲草素可誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞自噬。

Figure 2. Cordycepin induced the apoptosis of SNU-308 cells. A: the SNU-308 cells treated with cordycepin were stained with Anne-xin V-FITC/PI and their apoptosis was analyzed by flow cytometry; B: the effects of cordycepin on the levels of apoptotic proteins in the SNU-308 cells were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,** P<0.01vs0 μmol/L group.

Figure 3. Cordycepin induced the autophagy in the SNU-308 cells. A: immunofluorescent staining of LC3 in green was observed in the SNU-308 cells treated with 20 μmol/L cordycepin. DAPI was used to stain the nuclei (×1 800). B: the effect of cordycepin on the levels of autophagy proteins in the SNU-308 cells was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.* P<0.05vs0 μmol/L group.

4 蟲草素抑制膽囊癌細(xì)胞SNU-308的遷移能力

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5、10和20 μmol/L蟲草素處理SNU-308細(xì)胞24 h和48 h后，與對(duì)照組相比，藥物處理組細(xì)胞的橫向遷移距離明顯縮短(P<0.05)，見圖4A；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20 μmol/L蟲草素處理SNU-308細(xì)胞18 h后，其縱向細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制(P<0.05)，見圖4B，結(jié)果提示，隨著時(shí)間和濃度的增加蟲草素可抑制SNU-308細(xì)胞的遷移。

5 蟲草素通過調(diào)控Akt、ERK1/2和Ezrin的磷酸化水平抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖和遷移

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)5、10和20 μmol/L的蟲草素作用于膽囊癌細(xì)胞48 h 后，p-Akt在20 μmol/L時(shí)的蛋白水平低于對(duì)照組(P<0.05)，而Akt表達(dá)無明顯差異；p-ERK1/2在用藥后的蛋白水平明顯降低(P<0.05)，ERK1/2的表達(dá)無明顯差異；p-Ezrin在20 μmol/L時(shí)的蛋白水平低于對(duì)照組(P<0.05)，而Ezrin表達(dá)無明顯變化，見圖5A，提示蟲草素抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖和遷移可能與調(diào)控Akt、ERK1/2及Ezrin磷酸化水平相關(guān)。當(dāng)SNU-308細(xì)胞用5 nmol/L的ERK1/2抑制劑GDC-0994及5 μmol/L的Akt抑制劑Akti-1/2處理48 h后，膽囊癌細(xì)胞的遷移能力明顯受到抑制，見圖5B。

6 Ezrin基因沉默可抑制膽囊癌細(xì)胞的遷移

Ezrin基因沉默48 h后，膽囊癌細(xì)胞的遷移能力明顯受到抑制(P<0.05)，見圖6B。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ezrin基因沉默后，p-Akt的蛋白水平下降，而p-ERK1/2的蛋白水平并無改變；GDC-0994處理后p-Ezrin的蛋白水平下降；但Akti1/2處理后p-Ezrin的蛋白水平無明顯變化，見圖6A、C。以上結(jié)果說明Akt是Ezrin的下游因子，而ERK1/2是Ezrin的上游因子，3者共同參與抑制膽囊癌SNU-308細(xì)胞的遷移過程。

Figure 4. Cordycepin inhibited the migration ability of the SNU-308 cells. A: wound healing assays were used to detect the migration length of SNU-308 cells treated with cordycepin(×40); B: migration assay of SNU-308 cells(×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

討 論

膽囊癌是惡性程度最高的胃腸道腫瘤[7]。多項(xiàng)研究證明，蟲草素可作為一種新型抗腫瘤藥物，對(duì)乳腺癌、肝癌和肺癌等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[8-10]。本研究結(jié)果顯示，蟲草素有效抑制了膽囊癌SNU-308細(xì)胞的活力及其集落形成能力，提示蟲草素可抑制膽囊癌的異常生長(zhǎng)。

凋亡和自噬是細(xì)胞程序性死亡的2種死亡方式，可共同作用于腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡。Yu等[11]證明蟲草素通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬來抑制非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)蟲草素可誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞凋亡，Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，蟲草素處理后，激活內(nèi)外源性凋亡途徑，可見Bax和Cyto C表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下降；Fas和FasL表達(dá)升高；cleaved caspase-3的蛋白水平上調(diào)，說明蟲草素可通過內(nèi)外源性途徑共同誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化，細(xì)胞胞漿中LC3-II累積增多，LC3-II/LC3-I的比值上調(diào)[12]。免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SNU-308細(xì)胞經(jīng)蟲草素處理后，胞漿內(nèi)LC3綠色熒光顆粒明顯增多，Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)LC3-II/LC3-I的比值增高，而另一自噬標(biāo)識(shí)蛋白beclin 1的表達(dá)上調(diào)，說明蟲草素誘導(dǎo)SNU-308細(xì)胞的自噬。以上結(jié)果提示，蟲草素可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬來抑制膽囊癌細(xì)胞的異常生長(zhǎng)。

Tao等[13]研究證實(shí)，蟲草素對(duì)人肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移具有強(qiáng)烈的抑制作用。本研究結(jié)果也顯示，蟲草素可有效抑制膽囊癌細(xì)胞的遷移能力。

Akt信號(hào)通路和ERK1/2信號(hào)通路是腫瘤研究中的經(jīng)典信號(hào)通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和自噬等多種生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，p-Akt和p-ERK1/2在膽囊癌中呈高表達(dá)[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，蟲草素可明顯下調(diào)Akt和ERK1/2的磷酸化水平，提示蟲草素抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖和遷移與調(diào)控該信號(hào)通路相關(guān)。此外有研究表明，Ezrin與腫瘤細(xì)胞的遷移關(guān)系密切[16]，且Ezrin在膽囊癌中呈高表達(dá)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)蟲草素也可下調(diào)Ezrin的磷酸化水平，提示蟲草素可通過調(diào)控Ezrin來抑制膽囊癌細(xì)胞的遷移。

Figure 5. The effects of cordycepin on the protein levels of p-Akt, Akt, p-ERK1/2, ERK1/2, p-Ezrin and Ezrin in the SNU-308 cells. A: the expression level of p-Akt, Akt, p-ERK1/2, ERK1/2, p-Ezrin and Ezrin after treated with cordycepin in SNU-308 cells determined by Western blot; B: wound healing assays were used to detect the effect of ERK1/2 inhibitor GDC-0994 and Akt inhibitor Akti-1/2 (×40). Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group;△P<0.05vscontrol group.

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Akt、ERK1/2及Ezrin在遷移中的作用機(jī)制及3者之間的相互關(guān)系，本研究分別觀察了GDC-0994、Akti-1/2和Ezrin基因沉默對(duì)SNU-308細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERK1/2和Akt信號(hào)通路及Ezrin均參與了蟲草素抑制細(xì)胞遷移的過程。Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Ezrin是ERK1/2的下游因子，是Akt的上游因子，綜上，蟲草素通過調(diào)控ERK1/2，Ezrin和Akt信號(hào)通路共同參與抑制膽囊癌細(xì)胞SNU-308的增殖和遷移過程。

綜合以上研究結(jié)果，我們將蟲草素對(duì)膽囊癌細(xì)胞的增殖和遷移的分子機(jī)制做一概述。蟲草素通過激活Fas/FasL系統(tǒng)，繼而激活外源性細(xì)胞凋亡途徑，促使細(xì)胞產(chǎn)生凋亡；與此同時(shí)，蟲草素活化內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑中的凋亡因子，其中Bax被激活，抑凋亡因子Bcl-2被抑制，線粒體膜通道打開，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體中釋放，促使下游caspase家族蛋白活化，caspase-3切割活化形成cleaved caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，蟲草素促進(jìn)beclin 1與早期細(xì)胞自噬體膜結(jié)合，在Agt4的幫助下，LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化，后者與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)自噬小體的形成，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，與細(xì)胞凋亡共同促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的死亡，抑制其增殖。綜上所述，蟲草素可直接或間接作用于ERK1/2、Ezrin和Akt信號(hào)通路，抑制其磷酸化，進(jìn)而抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖和遷移，有望在臨床上用于膽囊癌的治療。

Figure 6. The effects of Ezrin siRNA on the migration of the SNU-308 cells. A: the effects of Ezrin siRNA on the protein levels of Ezrin, p-ERK1/2,ERK1/2,p-Akt and Akt in the SNU-308 cells were determined by Western blot; B: wound healing assay was used to detect the effect of Ezrin siRNA (×40); C: the effects of GDC-0994 and Akti-1/2 on the protein levels of p-Ezrin and Ezrin. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNeg siRNA group.