人工表達(dá)β2腎上腺素受體的β激動(dòng)劑多殘留檢測(cè)

胡夢(mèng)華，王晶，余秋穎，張浩，樊劍鳴，王方雨

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州河南 450002）(2.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，鄭州河南 450001）

β腎上腺素受體激動(dòng)劑（俗稱“瘦肉精”）的違禁添加一直是威脅我國(guó)人群健康的問題之一，嚴(yán)重影響畜類食品安全和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1]。尤其近年來添加劑的混合使用以及新型結(jié)構(gòu)類似物的出現(xiàn)增加了檢測(cè)的難度，因此開發(fā)一種β受體激動(dòng)劑多殘留快速檢測(cè)技術(shù)成為了迫切需求。受體分析法是一種針對(duì)結(jié)構(gòu)功能相似的目標(biāo)物的類特異性快速檢測(cè)方法，可實(shí)現(xiàn)β受體激動(dòng)劑類藥物的多殘留檢測(cè)以及對(duì)未知物的篩查[2]。作為受體分析法的核心識(shí)別元件，體外表達(dá)的β2腎上腺素受體（β2adrenergic receptor，β2AR）的活性和純度一直是研究焦點(diǎn)?，F(xiàn)有的研究表明，在大腸桿菌[3]、酵母[4]、昆蟲細(xì)胞[5]、哺乳動(dòng)物細(xì)胞[6]和無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)[7]等均能得到具有一定活性的受體蛋白，但表達(dá)量及蛋白活性在不同的表達(dá)系統(tǒng)中具有差異性。

分子對(duì)接技術(shù)是根據(jù)配體與受體作用的“鎖鑰原理”（lock and key principle），模擬它們的相互作用，使兩者結(jié)合形成低能構(gòu)象，是藥物虛擬篩選的重要手段[8]。實(shí)驗(yàn)表明，通過分子對(duì)接技術(shù)，可對(duì)多種乙酰膽堿酯酶與不同農(nóng)藥分子的敏感性進(jìn)行了虛擬篩選[9]；利用構(gòu)建的GPCRs模型可以捕捉結(jié)合口袋的關(guān)鍵化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[10]；可用于篩選抗HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶活性化合物[11]，在中藥研究方面也有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[12,13]。

本研究利用分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)β2AR受體蛋白的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，基于優(yōu)化后的分子結(jié)構(gòu)人工合成基因，利用常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，將成功構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，將誘導(dǎo)表達(dá)的受體蛋白利用組氨酸標(biāo)簽蛋白純化磁珠進(jìn)行蛋白純化，并對(duì)純化后受體蛋白進(jìn)行活性鑒定，為建立基于受體分析法的β激動(dòng)劑快速檢測(cè)技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞

pET32a質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；JM109感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自Takara公司。

1.2 試劑和材料

T4連接酶和ExTaq酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XholⅠ購(gòu)自美國(guó)NEB公司；小提質(zhì)粒試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海索寶生物科技有限公司；組氨酸標(biāo)簽蛋白純化磁珠購(gòu)自海貍生物科技有限公司；辣根過氧化物酶（horse radish peroxidate，HRP）標(biāo)記的克倫特羅來自Sigma公司；羊抗鼠二抗、His鼠源單克隆抗體購(gòu)自Qiagen公司。磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS，0.01 mol/L）；PBST 洗液（PBS∶Tween20=2×103∶1），包被緩沖溶液（carbonate buffered saline，CBS，0.05 mol/L NaHCO3/Na2CO3緩沖液），封閉液（PBST∶BSA＝100∶1），終止液（2 mol/L H2SO4）；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)別。

1.3 方法

1.3.1 分子對(duì)接

對(duì)接所需的β受體激動(dòng)劑分子結(jié)構(gòu)均從ZINC上下載，β2AR蛋白分子結(jié)構(gòu)（2RH1），從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載。依據(jù)2RH1的分子結(jié)構(gòu)，對(duì)接口袋設(shè)定為包含Asp113、Asn312、Ser203、Phe193、Phe289、Phe290、Val114、Val117、Trp109、Tyr308、Tyr316、Tyr199、Trp286和Thr118殘基的區(qū)域，Threshold定義為0.50，Bloat定義為10A。以上述蛋白的對(duì)接區(qū)域作為受體，以β受體激動(dòng)劑類小分子藥物作為配體，借助SYBYL軟件中FlexX方法進(jìn)行對(duì)接工作，對(duì)接前先對(duì)β2AR進(jìn)行系列優(yōu)化：提取出配體分子對(duì)側(cè)鏈的修補(bǔ)、主鏈末端的處理，加氫、刪除水分子、指定原子類型、加電荷和能量?jī)?yōu)化等均按 SYBYL默認(rèn)值進(jìn)行系列優(yōu)化；利用SYBYL軟件的蛋白質(zhì)對(duì)接下面的Define來生成對(duì)接活性口袋，其它條件按SYBYL默認(rèn)值。以對(duì)接結(jié)果中總評(píng)分值（Total Score）為最終判斷對(duì)接結(jié)果的依據(jù)。

1.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

依據(jù)對(duì)接實(shí)驗(yàn)中β2AR受體蛋白的分子結(jié)構(gòu)，將人工合成并改造的β2AR基因PCR擴(kuò)增后與表達(dá)載體pET32a分別用NdeⅠ和XholⅠ進(jìn)行雙酶切，利用瓊脂糖凝膠電泳切膠回收目的片段和載體片段。在 T4連接酶的作用下，16 ℃連接過夜。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，驗(yàn)證讀碼框的正確性。序列正確的重組質(zhì)粒命名為pET32a-β2AR1，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌。挑選氨芐陽(yáng)性的單菌落搖菌，用于目的蛋白的表達(dá)。

1.3.3 表達(dá)條件的優(yōu)化及鑒定

將篩選出的BL21大腸桿菌菌液二次活化后1∶100接入加入氨芐抗性的LB培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min，振蕩培養(yǎng)3 h，至細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期（OD=0.6～0.9）。取出一部分菌液作為陰性對(duì)照，余下的菌液按終濃度為1 mmol/L，0.8 mmol/L，0.6 mmol/L和0.4 mmol/L加入誘導(dǎo)劑IPTG，37 ℃，誘導(dǎo)14 h后，將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液超聲破碎，將破碎后菌液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)的情況。

1.3.4 蛋白純化及活性鑒定

在2 mL EP管中加入1 mL菌液上清，組氨酸標(biāo)簽蛋白純化磁珠400 μL，4 ℃環(huán)境下，在搖床上結(jié)合反應(yīng)1 h，在磁力架上進(jìn)行磁性分離，保存分離液，并用濃度10 mmol/L～500 mmol/L的咪唑洗脫液洗脫受體蛋白，收集不同濃度咪唑洗脫液并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。將含有受體蛋白的洗脫液用透析液進(jìn)行梯度透析，得到純化蛋白。CBS包被純化后受體蛋白，5%BSA封閉液封閉過夜，ELISA檢測(cè)目的蛋白的活性。

1.3.5 多殘留檢測(cè)曲線建立

純化蛋白1∶1稀釋后包被在酶標(biāo)板，50 μL/孔。加入梯度稀釋的克倫特羅、萊克多巴胺和非諾特羅3種β受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品（0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL），50 μL/孔。同時(shí)加入 1∶500 稀釋的 HRP-克倫特羅，50 μL/孔。37 ℃，30 min，PBST洗板，加入顯色液，100 μL/孔，顯色10 min，加入終止液，50 μL/孔，終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)各孔OD值。

1.3.6 交叉反應(yīng)率的測(cè)定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，得到3種β受體激動(dòng)劑的IC50值，計(jì)算3種β受體激動(dòng)劑的交叉反應(yīng)率（CR）。

計(jì)算公式：CR=[IC50(克倫特羅)/IC50(β受體激動(dòng)劑)]

2 結(jié)果與分析

2.1 分子對(duì)接結(jié)果

圖1 β2AR與β受體激動(dòng)劑類藥物分子對(duì)接模型圖Fig.1 Modeling diagram of β2AR and β adrenergic receptor agonists by molecular docking

表1 分子對(duì)接結(jié)果Table 1 Result of molecular docking

β2AR蛋白分子結(jié)構(gòu)（2RH1）與15種β受體激動(dòng)劑進(jìn)行分子對(duì)接后，以總評(píng)分值（Total Score）作為判斷對(duì)接結(jié)果的依據(jù)，分子對(duì)接圖如圖1所示，分子對(duì)接結(jié)果如表1所示，β2AR受體蛋白在分子結(jié)構(gòu)上能與多種β受體激動(dòng)劑結(jié)合，并且其結(jié)合能力具有差異性。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.2 Double enzyme digestion of recombinant expression plasmid

用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XholⅠ對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-β2AR1進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖2所示，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切之后出現(xiàn)兩個(gè)條帶，在1500 bp左右出現(xiàn)目的條帶為β2AR基因片段，與預(yù)期片段大小相符，另一條為載體pET32a基因片段。

2.3 表達(dá)條件的優(yōu)化及鑒定

圖3 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE image of recombinant expression plasmid

將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌，挑選Amp陽(yáng)性的單菌落搖菌，分別標(biāo)記為 1號(hào)菌，2號(hào)菌，3號(hào)菌和4號(hào)菌，誘導(dǎo)溫度設(shè)置為37 ℃，IPTG的濃度設(shè)置為 1 mmol/L，0.8 mmol/L，0.6 mmol/L和 0.4 mmol/L，將誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液超聲破碎后，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，誘導(dǎo)后的1號(hào)和2號(hào)菌在47 ku左右條帶明顯，3號(hào)和4號(hào)菌誘導(dǎo)后有目的蛋白的表達(dá)，但是條帶不明顯。

2.4 蛋白純化及活性鑒定

2.4.1 表達(dá)蛋白的純化

圖4 不同咪唑濃度洗脫蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE image of purified porcine β2AR protein eluted with different imidazole concentration

選取誘導(dǎo)表達(dá)較好的1號(hào)，2號(hào)菌液，經(jīng)超聲破碎、離心后留取上清，加入400 μL的磁珠進(jìn)行蛋白的純化，用不同濃度的咪唑洗脫液經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后如圖4所示，菌液均在濃度為300 mmol/L咪唑洗脫液下純化出蛋白。

2.4.2 純化蛋白的活性鑒定

將純化后的受體蛋白采用 ELISA方法進(jìn)行其活性鑒定，受體蛋白與辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的克倫特羅、萊克多巴胺及非諾特羅均能夠特異性結(jié)合，結(jié)果如表 2所示，pET32a-β2AR1表達(dá)的受體蛋白與三種激動(dòng)劑的結(jié)合力最高的是IPTG為1 mmol/L，OD值分別為0.45、0.32、0.36。

2.4.3 多殘留檢測(cè)曲線建立

圖5 不同激動(dòng)劑的檢測(cè)曲線圖Fig.5 Testing curve of different β receptor agonists

包被純化后的蛋白，ELRA方法檢測(cè)受體蛋白對(duì)三種激動(dòng)劑的檢測(cè)能力，測(cè)得OD值以B/B0為縱坐標(biāo)，以每種β受體激動(dòng)劑濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，建立檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如圖5所示，R2均大于0.9，受體蛋白對(duì)克倫特羅、萊克多巴胺及非諾特羅均表現(xiàn)出一定檢測(cè)能力，尤其對(duì)克倫特羅的檢測(cè)能力最高。

2.4.4 交叉反應(yīng)率測(cè)定

3種β受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式和R2值分別列出，計(jì)算它們的IC50值，得到交叉反應(yīng)率。結(jié)果如表3所示，萊克多巴胺和非諾特羅與克倫特羅的交叉反應(yīng)率分別為5.45%和66.16%。說明本次實(shí)驗(yàn)中表達(dá)的受體蛋白對(duì)β受體激動(dòng)劑有一定的檢測(cè)能力。

表2 表達(dá)蛋白活性鑒定結(jié)果Table 2 Result of molecular docking

表3 交叉反應(yīng)率測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination of 3 β adrenergic agonists of by ELRA

3 討論

目前針對(duì)動(dòng)物源性食品中多種β受體激動(dòng)劑殘留量檢測(cè)，主要包括確證分析法和快速檢測(cè)法兩類。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測(cè)定方法，屬于確證分析方法[14～16]。具有耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等缺點(diǎn)。基于免疫學(xué)技術(shù)的快速檢測(cè)方法[17～20]只能針對(duì)特定的β受體激動(dòng)劑進(jìn)行檢測(cè)，因此不能滿足市場(chǎng)對(duì)快速檢測(cè)的需求?；谑荏w分析法的快速檢測(cè)雖能對(duì)β受體激動(dòng)劑類藥物進(jìn)行檢測(cè)，目前還處在研究階段[21,22]。

近年來，分子對(duì)接技術(shù)在藥物[23]、化學(xué)[24]及其他領(lǐng)域[25]得到迅速發(fā)展，隨著 GPCRs模型的建立及β2AR蛋白分子結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)，對(duì)它們的研究?jī)?nèi)容也更加廣泛[26]?；谶@些研究，本實(shí)驗(yàn)對(duì)β2AR蛋白與β受體激動(dòng)劑的相互作用進(jìn)行分析，利用分子對(duì)接技術(shù)實(shí)現(xiàn)β2AR基因的人工改造。

由于天然的β2AR在生物體內(nèi)的含量低且難于分離，為了獲取純度高、活性好的β2AR，近年來人們嘗試幾乎所有的體外表達(dá)系統(tǒng)，均表達(dá)出具有一定活性的受體蛋白。本次實(shí)驗(yàn)在大腸桿菌成功表達(dá)的β2AR受體蛋白雖比以往其他系統(tǒng)表達(dá)的蛋白活性低，但比較其他大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究[3]，本實(shí)驗(yàn)得到了活性較高的受體蛋白。并且利用分子對(duì)接技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)β2AR基因的改造，為β2AR基因的人工改造提供新的思路，為實(shí)現(xiàn)β受體激動(dòng)劑的快速檢測(cè)奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)β2AR基因進(jìn)行改造，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出具有活性的β2AR受體蛋白，ELISA進(jìn)行其活性鑒定結(jié)果顯示，β2AR受體蛋白與克倫特羅、萊克多巴胺及非諾特羅均能夠特異性結(jié)合，OD值分別為0.45、0.32、0.36，與分子對(duì)接結(jié)果基本一致。多殘留檢測(cè)曲線顯示，該β2AR受體蛋白具有一定的檢測(cè)β受體激動(dòng)劑的能力，這為β2腎上腺素受體在β受體激動(dòng)劑的快速檢測(cè)方面提供新的思路。