柱前衍生RP-HPLC法測定肽藻營養(yǎng)粉中游離氨基酸的含量

歐陽道福，楊澤銳，郁曉藝，吳曉春

（完美（廣東）日用品有限公司，完美（中國）有限公司，廣東中山 528402）

肽藻營養(yǎng)粉由南瓜粉、大豆肽、薏苡仁粉、低聚果糖、乳清蛋白、螺旋藻、玉米粉、植脂末、麥芽、蓮子粉、乙基麥芽酚、三氯蔗糖為原料，經(jīng)混合、分裝制成的具有增強免疫力功能的保健食品，其含有豐富的多肽類及游離氨基酸類成分。氨基酸是構(gòu)成人體蛋白質(zhì)的組成部分，也是機體合成抗體、激素、酶類以及其他組織的原料。而且作為一種人體可直接吸收的營養(yǎng)成分，它的含量和成分能夠部分地反映出食品的營養(yǎng)價值，游離氨基酸不僅可以維護新陳代謝、生長、免疫，還可以呈現(xiàn)出酸、甜、苦、澀及鮮等味道，賦予了食品豐富的味覺層次[1]。然而對于肽藻營養(yǎng)粉中游離氨基酸的種類及其含量的研究目前并未見文獻報道。

目前文獻資料及國標中主要采用氨基酸分析儀法和高效液相色譜法[2～6]測定氨基酸的含量。氨基酸分析儀法具有操作簡便，無需單獨進行柱前衍生等優(yōu)點，但在運用過程中-有硬件配置復雜、用途專一、靈活性差、購買及維護成本高、分析時間很長、破壞氨基酸的固有結(jié)構(gòu)等缺點；近年來高效液相色譜已廣泛用于氨基酸的測定，其無需特殊反應裝置，具有高效、簡便、快速、準確和價格低廉等優(yōu)點，已成為檢測氨基酸的首選方法。

本研究參考GB/T 22729-2008海洋魚低聚肽粉[7]中游離氨基酸高效液相色譜儀測定法建立了柱前自動衍生化 RP-HPLC法同時測定肽藻營養(yǎng)粉多種游離氨基酸的方法，以期為肽藻營養(yǎng)粉及其同類產(chǎn)品中游離氨基酸種類的確定及其質(zhì)量控制提供參考，同時確定肽藻營養(yǎng)粉中游離氨基酸的種類及其具體含量，為其增強免疫力保健功能的物質(zhì)基礎提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

游離氨基酸混合對照品（1 nmol/μL），（批號：BCBT8196）：美國安捷倫科技有限公司；完美餐牌肽藻營養(yǎng)粉（批號為 164227-1、164227-2、164227-3、164227-4、164227-5、164227-6）：完美（中國）有限公司；純化水、超純水：超純水系統(tǒng)制備；三氯乙酸、冰醋酸、三水合乙酸鈉、三乙胺、3-巰基丙酸、硼酸、四氫呋喃：分析純，廣州化學試劑廠；甲醇、乙腈：色譜純，美國默克公司。

1.2 儀器與設備

Sartorius CPA225D電子天平：德國賽多利思公司；Agilent 1260高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；Elma P180H型超聲波清洗器：德國艾爾瑪公司；AnkeLXJ-IIB離心機：上海安亭科學儀器廠；MILLI-Q超純水系統(tǒng)：德國默克公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Hypersil ODS；柱溫40 ℃；檢測器為二極管陣列檢測器，檢測波長為 0～24 min為338 nm，24 min以后切換為262 nm；流動相A：醋酸鈉-三乙胺緩沖液（pH 7.20±0.05），加入0.5%四氫呋喃調(diào)節(jié)峰型；流動相B：醋酸鈉緩沖液（pH 7.20±0.05）-乙腈-甲醇（20∶40∶40），梯度洗脫，洗脫程序為 0～27 min，92%～40% A；27～31.5 min，40%～0% A；31.5～32 min，0% A；32～34 min，0%～100% A；34～35.5 min，100%～92% A；流速為1.0 mL/min。

1.3.2 溶液的配制

1.3.2.1 硼酸緩沖液的配制

稱取2.44 g硼酸至100 mL燒杯中，加水溶解，加200 g/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至10.2±0.1，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.2.2 OPA衍生劑的配制

稱取100 mg OPA到10 mL容量瓶中，加1 mL乙腈，130 μL 3-巰基丙酸，以0.4 mol/L硼酸緩沖液定容至刻度，搖勻。

1.3.2.3 FOMC-Cl衍生劑的配制

稱取50 mg FOMC-Cl到10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻。

1.3.2.4 對照品溶液的配制

取游離氨基酸混合對照品（1 nmol/μL）直接過0.45 μm水相濾膜，即得。1.3.2.5 供試品溶液的制備

精密稱取肽藻營養(yǎng)粉樣品1 g于25 mL容量瓶中，加入20 mL 5%三氯乙酸溶液，超聲20 min，定容至25 mL，靜置2 h，4000 r/min離心30 min，取上清液過0.45 μm水相濾膜，即為供試品溶液。

1.3.3 衍生方法

利用自動進樣器進行在線自動衍生：衍生程序如表1所示：

表1 柱前衍生化步驟Table 1 The steps of precolumn derivatization

注：樣品瓶1放置OPA衍生劑；樣品瓶2放置FOMC-Cl衍生劑；樣品瓶3放置水（瓶蓋不加墊片）；樣品瓶4放置0.4 mol/L硼酸。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的選擇

比較了以下兩種流動相：流動相1：流動相A：醋酸鈉-三乙胺緩沖液（pH 7.20±0.05），加入0.3%四氫呋喃調(diào)節(jié)峰型；流動相 B：醋酸鈉緩沖液（pH 7.20±0.05）-乙腈-甲醇（20∶40∶40）（國標 GB/T 22729-2008中使用的流動相）；流動相2：流動相A：醋酸鈉-三乙胺緩沖液（pH 7.20±0.05），加入0.5%四氫呋喃調(diào)節(jié)峰型；流動相 B：醋酸鈉緩沖液（pH 7.20±0.05）-乙腈-甲醇（20∶40∶40）。

兩種流動相條件均梯度洗脫，洗脫程序為 0～27 min，92%～40% A；27～31.5 min，40%～0% A；31.5～32 min，0% A；32～34 min，0%～100% A；34～35.5 min，100%～92% A；流速為1.0 mL/min；色譜柱為Agilent Hypersil ODS；柱溫40 ℃；檢測器為二極管陣列檢測器，檢測波長為0～24 min為338 nm，24 min以后切換為262 nm。

在此條件下，由圖1可知，兩種流動相條件下均能使17種氨基酸進行有效分離，但是流動相1中峰2的峰型較差，且各成分保留時間相對偏后，分析時間較長，因此選擇流動相2作為最終流動相。

圖1 不同流動相考察結(jié)果圖Fig.1 HPLC chromatograms with different mobile phase

2.1.2 色譜柱的選擇

圖2 不同色譜柱考察結(jié)果圖Fig.2 HPLC chromatograms with different type of column

本研究系統(tǒng)考察了三種不同型號（Agilent Hypersil ODS，5 μm，4.0×250 mm；Agilent Extend ODS，5 μm，4.6×250 mm；Waters Symmestry ODS，5 μm，4.6×250 mm）色譜柱的效果，結(jié)果如圖2所示，Symmestry和Extend的柱子分離度和脯氨酸（17號峰）的峰型均不理想，綜合分析Hypersil柱子的分離度和峰型均達到最佳狀態(tài)。

2.1.3 柱溫的選擇

圖3 不同柱溫考察結(jié)果圖Fig.3 Figures of HPLC chromatograms with different column temperature

溫度的微小變化能引起流動相密度改變，進而改變對分析物的溶解能力，所以調(diào)節(jié)柱溫可以調(diào)節(jié)目標化合物的分離效果。本研究考察了三種不同柱溫條件下色譜的分離情況，結(jié)果如圖3所示，35 ℃下13和14號峰分離度為1.37，45 ℃下3號峰出現(xiàn)裂峰，峰型不好，綜合分析40 ℃條件下分離度和峰型均達到最佳狀態(tài)，因此最終選擇柱溫為40 ℃。

2.1.4 衍生方式的選擇

氨基酸極性較強，為提高其在反相液相色譜柱上的保留，常常需要將氨基酸進行柱前衍生。柱前自動衍生-HPLC法測定氨基酸的含量時，由于衍生試劑或衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，導致手工操作很難保證衍生過程的快速、及時、均一。本方法采用帶全自動衍生功能的自動進樣器按預先設定的程序，以OPA和FOMC-Cl為衍生試劑進行在線衍生，衍生后直接進樣分析，有效消除了離線衍生由于進樣時間不同和手工操作速度慢、不均一造成的誤差，不僅提高了準確性，而且簡化了操作過程并降低了工作強度[8～10]。

2.1.5 色譜條件確認

根據(jù)“2.1.1～2.1.4”考察所得結(jié)果，精密吸取混合對照品溶液、空白溶劑試液以及供試品試液各1 μL，按照“1.3.3”項在線衍生處理后，以“1.3.1”項色譜條件進行分析，結(jié)果見圖 4。結(jié)果表明，在此色譜條件下，各氨基酸成分可以有效分離，空白溶劑在與混合對照品溶液色譜圖相同保留時間處不出現(xiàn)相同色譜峰，而供試品在與混合對照品溶液色譜圖相同保留時間處出現(xiàn)相同色譜峰。說明該方法專屬性性好，陰性無干擾。氨基酸 17個衍生物色譜峰的分離度及理論塔板數(shù)見表2。由表2可知，各氨基酸衍生物的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于10000。（注：在空白溶劑色譜圖上，與5號對照品相同位置處出現(xiàn)一個色譜峰，但其信噪比僅為6.1，低于定量限，故可忽略不計）。

圖4 各溶液高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of different solutions

2.2 線性關系與定量限考察

分別將“1.3.2.4”項下的混合氨基酸標準品稀釋為0.025、0.063、0.125、0.200、0.500、1.000 nmol/μL，在線衍生之后進行色譜分析，以各氨基酸的峰面積為縱坐標，相應的氨基酸含量為橫坐標繪制工作曲線，并求出回歸方程、線性相關系數(shù)以及線性范圍，并以信噪比 S/N=10時的質(zhì)量濃度作為定量限，測得各氨基酸的定量限。結(jié)果見表 3。結(jié)果表明，在下述濃度范圍內(nèi)，各氨基酸與各自峰面積呈良好的線性關系。

表2 氨基酸對照品各衍生物分離度及理論塔板數(shù)Table 2 Resolution and theoretical plate number for peaks of reference substances derivatives

表3 線性關系及定量限考察結(jié)果Table 3 The result of linearity and the limit of quantitation

2.3 精密度、重復性以及加樣回收率實驗

表4 精密度、重復性以加樣回收率考察結(jié)果Table 4 The result of precision epeatability and recovery(n=6)

取“1.3.2.4”項下的混合氨基酸標準品，在線衍生之后進行色譜分析，連續(xù)進樣6次，測定17種氨基酸衍生物進樣精密度；精密稱取樣品（164227-1）6份，每份約1 g，按照“1.3.2.5”項下制備供試品溶液，在線衍生之后進行色譜分析，計算各種氨基酸含量及RSD，作為重復性實驗結(jié)果；精密稱取已知含量的樣品（164227-1）6份，精密加入“1.3.2.4”項下的混合氨基酸標準品各1 mL，按照“1.3.2.5”項下制備供試品溶液，在線衍生之后進行色譜分析，計算回收率和RSD。結(jié)果見表4。結(jié)果表明，17種氨基酸的精密度均小于2%，說明儀器精密度良好；重復性實驗中，除了異亮氨酸外（RSD值為10.20%），其余各種氨基酸的RSD均小于10%，結(jié)果表明該方法重復性好；各氨基酸回收率在 85%～115%之間（除胱氨酸略高外），RSD基本均小于5%。

2.4 樣品含量測定

取6個批次肽藻營養(yǎng)粉樣品各1 g，按“1.3.2（5）”項下的方法操作制備供試品溶液，每個樣品平行2份，按照“1.3.3”項在線衍生處理后，以“1.3.1”項色譜條件進行分析，計算各供試品中17個游離氨基酸的含量以及總量，由測定結(jié)果（表 5）可知，樣品中至少含有14種氨基酸，其中6種為人體必需氨基酸。氨基酸總量均在500 mg/100 g以上，亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸的含量均達到 50 mg/100 g以上，可見該營養(yǎng)粉中的氨基酸資源非常豐富，為其增強免疫力保健功能的物質(zhì)基礎提供了數(shù)據(jù) 支撐。

表5 6批次肽藻營養(yǎng)粉中17種游離氨基酸含量Table 5 Contents of 17 kings of free amino acids in peptide nutrition powder (n=2)

3 結(jié)論

本研究通過綜合考察建立了一種利用高效液相色譜測定肽藻營養(yǎng)粉中游離氨基酸含量的方法，同時也確認了肽藻營養(yǎng)粉中的游離氨基酸種類及其含量，該方法專屬性強，準確性高，重復性好，適用于肽藻營養(yǎng)粉中游離氨基酸的質(zhì)量控制，對于其他同類型產(chǎn)品也有一定借鑒參考意義。