廣東沿海兩地海水魚總汞與甲基汞的相關(guān)性分析

陳霄，張文鳳，黃偉雄，楊杏芬，耿予歡

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.廣東省疾病預(yù)防控制中心，廣東廣州 511430）

汞是一種對人類和其他動植物都具有相當(dāng)大毒害作用的重金屬元素，對神經(jīng)系統(tǒng)、腎和肝臟等可產(chǎn)生不可逆的損害作用[1]，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）把汞列為十大引起重大公共健康問題的化學(xué)物質(zhì)之一[2]，一旦汞被生物體吸收并沿食物鏈傳遞，就會對生命安全造成極大的威脅。甲基汞和無機(jī)汞對日本鵪鶉鳥的口服半數(shù)致死劑量（median lethal dose，LD50）分別為18 mg/kg和42 mg/kg[3]。汞在人體內(nèi)的半衰期為60～120 d，在魚體中的半衰期可以長達(dá)2年，魚類是食物的主要污染物之一[4]。

歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）的相關(guān)研究結(jié)果表明，在人們的日常食品中，海水魚是汞污染程度最嚴(yán)重的一類動物源食品[5]。世界各國對魚類總汞和甲基汞含量都有著嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，并且隨著研究的逐步深入，各組織對食品中汞的限量標(biāo)準(zhǔn)和健康指導(dǎo)值也在不斷修訂中。我國對食品中汞含量的限量值依次經(jīng)過GB 2762-1994（魚類總汞≤0.3 mg/kg，甲基汞≤0.2 mg/kg）、GB 2762-2005（魚類甲基汞≤0.5 mg/kg，食肉魚類甲基汞≤1.0 mg/kg）、GB 2762-2012（水產(chǎn)動物及其制品甲基汞≤0.5 mg/kg，肉食性魚類及其制品甲基汞≤1.0 mg/kg）和 GB 2762-2017[6]（與GB 2762-2012汞限量保持一致）的改變。根據(jù)人體的毒理學(xué)實驗和流行病學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，美國環(huán)保局（United States Environmental Protection Agency，USEPA）設(shè)定的甲基汞的每日可耐受限值（口服參考劑量）為0.1 μg/kg bw，而聯(lián)合國糧農(nóng)組織與世界衛(wèi)生組織聯(lián)合食品專家委員會（JECFA）設(shè)定的人體對甲基汞的暫定每周可耐受劑量的限值為 1.6 μg/kg bw[7]，這些限值對人群經(jīng)膳食攝入甲基汞起到了一定的健康指導(dǎo)作用。

汞在魚類等水生生物中主要以甲基汞的形態(tài)存在[5]。甲基汞是毒性最大、最易通過食物鏈積累、傳遞和生物放大的汞形態(tài)。魚類汞濃度的高低還能夠客觀地反映當(dāng)?shù)睾Ｓ颦h(huán)境受汞污染的水平。但是，由于水生生物可以富集水中的甲基汞，其體內(nèi)甲基汞的含量可達(dá)到環(huán)境水體的104～106倍[8]，繼而通過食物鏈的生物放大作用[9,10]，最終傳遞反饋給人類。甲基汞在人體腸道內(nèi)能迅速吸收分并布到全身，進(jìn)而侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)[11]，從而危害人體健康。食用海洋魚類是沿海居民體內(nèi)汞的主要暴露途徑[12,13]，因此，本研究旨在以華南沿海兩個有代表性的漁村為研究區(qū)域，針對當(dāng)?shù)刂鳟a(chǎn)海水魚品種對其汞形態(tài)的分布特征進(jìn)行描述和分析，研究海水魚總汞和甲基汞含量比例的特異性，擬為日后的風(fēng)險監(jiān)測提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集、運(yùn)輸與保存

1.1.1 海水魚采樣方案的設(shè)計

（1）確定重點海水魚品種。于2016年9～10月在粵西（湛江）和粵東（汕尾）各選取一個漁村作為研究區(qū)域，按照當(dāng)?shù)睾Ｋ~產(chǎn)量統(tǒng)計來確定樣品代表性，對當(dāng)?shù)貪O民和普通人群開展問卷調(diào)查和入戶調(diào)查，從而由海水魚產(chǎn)量的高低排序確定重點采集品種。

（2）樣品采集。經(jīng)調(diào)查統(tǒng)計，確定重點海水魚品種為20種。于2016年11月在研究區(qū)域當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)貿(mào)市場、水產(chǎn)品批發(fā)市場、漁港市場等流通環(huán)節(jié)，采集了卵形鯧鲹、多鱗鱚和黃鰭鯛等20種共133尾海魚，其中，粵東82尾，粵西51尾（詳情見表1）。

表1 海水魚信息表Table 1 Information of the 20 species of marine fish involved in this study

注：a樣品來自粵西地區(qū)流通環(huán)節(jié)；b樣品來自粵東地區(qū)流通環(huán)節(jié)；c信息來源于網(wǎng)站 http∶//fishbase.cn/；d信息來源于網(wǎng)站http∶//www.fao.org/。

1.1.2 海水魚樣品運(yùn)輸、預(yù)處理和保存

海水魚樣品在0 ℃下冷鏈運(yùn)輸至實驗室，洗凈樣品后，取其肌肉組織（＞100 g/份），勻漿，分裝于塑料瓶或密實袋中，添加標(biāo)簽，-20 ℃保存[14]。1個月內(nèi)完成樣品預(yù)處理及相關(guān)目標(biāo)物的檢測。

1.2 儀器設(shè)備與試劑

DMA-80直接測汞儀，意大利Milestone公司；液相色譜-在線紫外消解-原子熒光光譜聯(lián)用儀（HPLC-online UV reduction-AFS），北京普析通用儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司；超聲波清洗機(jī)，德國 Elma公司；超純水處理系統(tǒng)，美國Millipore公司；電子天平，瑞士Mettler Toledo公司。

汞標(biāo)準(zhǔn)液（1000 μg/mL），中國計量科學(xué)研究院；甲基汞標(biāo)準(zhǔn)液（63.6 μg/mL），中國計量科學(xué)研究院；魚蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（DORM-4，總汞0.412±0.036 mg/kg，甲基汞 0.355±0.028 mg/kg），加拿大國家研究院；金槍魚肌肉組織標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（ERM-CE464，總汞5.24±0.10 mg/kg，甲基汞5.50±0.17 mg/kg），歐洲委員會聯(lián)合研究中心；硝酸（HPLC級），德國 Merck公司；甲醇（HPLC級），德國Merck公司；L-半胱氨酸（＞98.0%），上海阿拉丁生化科技有限公司；鹽酸（優(yōu)級純），廣州化學(xué)試劑廠；乙酸銨、氫氧化鉀、硼氫化鉀、氫氧化鈉等固體藥品（優(yōu)級純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.3 海水魚樣品總汞的測定

使用DMA-80直接測汞儀測定海水魚樣品總汞的含量。為扣除背景干擾，樣品舟空載時的信號響應(yīng)值(即吸光度值)不高于 0.0005。準(zhǔn)確稱量 0.2 g(精確到0.0001 g)海水魚組織于樣品舟(鎳舟)中，置于DMA-80直接測汞儀進(jìn)行總汞的測定，每個樣品平行測定三次，該方法測得的值為汞的絕對值。

1.4 海水魚樣品甲基汞的測定

參考《食品中總汞及有機(jī)汞的測定》[15]中的食品中甲基汞的測定方法，并稍作改變，測定海水魚樣品甲基汞的含量。準(zhǔn)確稱量1.0 g(精確到0.0001 g)海水魚組織于15 mL離心管中，加入10 mL 5 mol/L HCl，超聲輔助萃取60 min，于4 ℃下8000 r/min冷凍離心15 min，取上清液2 mL于5 mL刻度試管中，滴加6 mol/L NaOH溶液將pH調(diào)至2～7，加入10 g/L L-半胱氨酸溶液0.10 mL，用超純水定容至5 mL，上機(jī)測試前用0.22 μm水系濾膜過濾，每個樣品平行測定三次。

HPLC-online UV reduction-AFS聯(lián)機(jī)測樣時的工作參數(shù)：(1)HPLC 條件：普析 C18 (4.6×150 mm，5 μm)；流動相60 mmol/L乙酸銨溶液(含5%甲醇和1g/L L-半胱氨酸)，流速 1.0 mL/min；進(jìn)樣量 100 μL。(2)online UV reduction條件：紫外燈開；泵速調(diào)至40 r/min；載流10%鹽酸溶液；氧化劑為水；還原劑0.5%氫氧化鉀+0.2%硼氫化鉀混合溶液。(3)AFS工作參數(shù)：負(fù)高壓270 V；總電流60 mA；氬氣作為載氣和屏蔽氣，流量分別為300和500 mL/min。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)表達(dá)采用均數(shù)（±標(biāo)準(zhǔn)偏差，即±SD），運(yùn)用SPSS22和Excel 2013作為統(tǒng)計分析軟件，數(shù)據(jù)之間的差異采用非參數(shù)檢驗（Kolmogorov-Smirnov test和Mann-Whitney test等），以p＜0.05作為具有統(tǒng)計學(xué)差異的判斷標(biāo)準(zhǔn)，以相關(guān)系數(shù)表示海水魚總汞含量與甲基汞占總汞比例之間的關(guān)聯(lián)，鑒于測定的樣品數(shù)量有限，用spearman相關(guān)參數(shù)r和p（雙尾）來評估相關(guān)關(guān)系的顯著性。采用Excel 2013或Origin 8.5軟件繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與方法檢出限

2.1.1 總汞標(biāo)準(zhǔn)曲線

將1000 μg/mL的汞標(biāo)準(zhǔn)液，用2%的硝酸逐級稀釋成汞濃度分別為0.5、1、2、5、10、15、20 和25 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，以及25、50、100、150、200、300、400和500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列。以吸光度Y為縱坐標(biāo)，汞含量X為橫坐標(biāo)，繪制0～25 ng/mL和25～500 ng/mL兩條測定總汞的工作曲線，并計算相關(guān)系數(shù)R2。工作曲線的回歸方程分別為Y=0.04427831X-0.00044677X2（R2=0.9999）、Y=9.256885e-4+8.129776e-4X-1.5061e-7X2（R2=0.9999）。以2%的硝酸為空白，進(jìn)行10次空白分析，以3倍的空白相對標(biāo)準(zhǔn)偏差計算儀器的檢出限，總汞的檢出限為0.02 ng/mL，定量范圍為0.02～500 ng/mL。

2.1.2 甲基汞標(biāo)準(zhǔn)曲線

將原濃度為63.6 μg/mL的甲基汞標(biāo)準(zhǔn)液用流動相60 mmol/L乙酸銨溶液（含5%甲醇和1 g/L L-半胱氨酸）逐級稀釋，得到濃度為 0.5、1、2、3、4、5、6和7 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，甲基汞濃度X為橫坐標(biāo)，繪制0～7 ng/mL測定甲基汞的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：Y=12651.047852X-663.160217（R2=0.9998）。以信噪比的3倍計算檢出限，甲基汞的檢出限為0.08 ng/mL，定量范圍為0.08～100 ng/mL。

2.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度

本研究采用測定魚蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) DORM-4和金槍魚肌肉組織標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)ERM-CE464兩種生物標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)的方法來反映方法的準(zhǔn)確度和精密度，進(jìn)行方法的質(zhì)量控制，平行測定3個樣品，甲基汞和總汞的測定結(jié)果見表 2。結(jié)果表明，采用此方法總汞和甲基汞的測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)參考值吻合，相對誤差小于3%，樣品測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于 3%，說明了所選方法適用于當(dāng)前樣品總汞和甲基汞的測定，其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，精密度良好。

表2 標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)測定結(jié)果Table 2 Results of standard reference materials

2.3 海水魚總汞的含量分布特征分析

粵西某漁村和粵東某漁村海水魚肌肉中總汞（T-Hg）含量的分布情況分別見圖1和圖2。由圖1可以看出，粵西漁村海水魚 T-Hg含量范圍為11.32～156.00 ng/g，平均值（±SD）為53.84（±32.60）ng/g，中位值為49.95 ng/g，經(jīng)K-W非參數(shù)檢驗，11種海水魚的T-Hg含量存在顯著差異（p=0.0001），同品種不同個體海水魚 T-Hg含量均無顯著差異（p＞0.05），這可能與同一時期所采集的同品種海水魚的尺寸大小趨同有關(guān)。此外，海水魚 T-Hg含量可能還與魚齡、食性、生長環(huán)境等密切相關(guān)[16,17]。食性是影響汞在水生生物體內(nèi)富集的主要因素之一[18]，不同食性魚類汞濃度的差異主要是由食物源引起的[19]。經(jīng)多獨立樣本的K-W檢驗（H檢驗），在這些海水魚中，食性對粵西地區(qū)海水魚總汞含量的影響是顯著的（χ2=9.20，p=0.0100），并且海水魚總汞含量按食性的大小排序為：肉食性魚類（61.36±26.74 ng/g，N=32）＞雜食性魚類（48.21±39.73 ng/g，N=19），但是樣品量較少增加了這個排序的不確定度，并且海底環(huán)境也可能是這一排序的影響因素。有研究表明，經(jīng)污染源排入水體中的汞主要沉積在底泥中[20]，致使生活在水體底層的魚類接觸到較高濃度的汞，底棲性魚類魚肉甲基汞含量與水體底泥汞含量呈明顯正相關(guān)[21]，長期食用含汞沉積物的底棲動物更趨向于成為海底環(huán)境中甲基汞的歸宿。因此，以藻類及小型底棲動物為主的雜食性魚類如黃鰭鯛，要比肉食性魚類如多鱗鱚、二長棘鯛等的總汞含量高。

圖1 粵西海水魚肌肉中總汞(T-Hg)的含量分布Fig.1 Total mercury(T-Hg) content in marine fish muscle from western Guangdong

由圖2可以看出，粵東某漁村海水魚T-Hg含量范圍為 15.35～201.68 ng/g，平均值（±SD）為 72.32（±48.70） ng/g，中位值為59.33 ng/g，經(jīng)K-W非參數(shù)檢驗，18種海水魚 T-Hg含量存在顯著差異（p=0.0000），除帶魚（p=0.0069）之外，同品種不同個體海水魚T-Hg均無顯著差異（p＞0.05），這可能與同一時期所采集的同品種海水魚的尺寸大小趨同有關(guān)。其中，海鰻的T-Hg含量最高，達(dá)到201.68 ng/g。一般而言，食物鏈中肉食性魚類的營養(yǎng)級較高，體內(nèi)也更容易蓄積高濃度的汞[22,23]。帶魚和海鰻都屬于兇猛肉食性魚類，其體內(nèi)汞含量受魚齡的影響十分明顯，相對于其他魚類食物鏈等級較高，因此富集汞含量也較高，這一點與相關(guān)研究結(jié)論一致[24]。魚體中的汞主要是通過食物攝取進(jìn)入體內(nèi)，而通過魚腮上皮細(xì)胞從水中直接吸收的汞占魚體汞含量的很少一部分[25]。魚類體內(nèi)汞的含量與食物種類及其能量轉(zhuǎn)換效率密切相關(guān)[26,27]，因此，同一水體環(huán)境海水魚汞含量的差異與其攝食習(xí)慣和生理特征有很大關(guān)系。經(jīng)多獨立樣本的K-W檢驗（H檢驗），在這些海水魚中，食性對粵東地區(qū)海水魚總汞含量的影響是顯著的（χ2=18.24，p=0.0001），并且該區(qū)域海水魚總汞含量按食性的大小排序與粵西的一致：肉食性魚類（81.21±48.98 ng/g，N=58）＞雜食性魚類（69.51±47.59 ng/g，N=24），這一點也與相關(guān)研究結(jié)論一致[28]。

圖2 粵東海水魚肌肉中總汞(T-Hg)的含量分布Fig.2 Total mercury(T-Hg) content in marine fish muscle from eastern Guangdong

粵東和粵西兩個漁村的海水魚樣品總汞含量均低于總汞限量較嚴(yán)格的歐盟標(biāo)準(zhǔn) 0.5 mg/kg，其中海鰻T-Hg含量最高，達(dá)到201.68 ng/g。經(jīng)非參數(shù)檢驗，粵東和粵西兩個漁村的海水魚樣品 T-Hg含量的總體分布無顯著差異（Z=0.99，p=0.2795），其平均水平存在顯著差異（Z=-2.00，p=0.0453），以粵東海水魚總汞含量更高。

粵東和粵西兩個漁村的相同海水魚品種有卵形鯧鲹、多鱗鱚、黃鰭鯛、舌鰨、馬鮫魚、二長棘鯛、藍(lán)圓鲹、鯔魚和石斑魚。對這9種海水魚進(jìn)行兩獨立樣本的K-S檢驗。兩地區(qū)的多鱗鱚T-Hg含量的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-1.55，p=0.0453），兩地區(qū)的鯔魚T-Hg含量的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-1.49，p=0.0235），其余均不具有統(tǒng)計學(xué)意義。這說明了多鱗鱚和鯔魚兩種海魚的T-Hg含量表現(xiàn)出了地域差異。

2.4 海水魚甲基汞占總汞的比值分布特征分析

圖3 粵西海水魚肌肉中甲基汞與總汞比值(MeHg/T-Hg)分布Fig.3 Proportion of MeHg to T-Hg (MeHg/T-Hg) in marine fish muscle from western Guangdong

粵西某漁村的海水魚肌肉甲基汞（MeHg）與總汞（T-Hg）的比值分布情況見圖3。該區(qū)域海水魚MeHg含量范圍為11.05～158.30 ng/g，平均值（±SD）為45.40（±31.86）ng/g，中位值為39.71 ng/g；該區(qū)域海水魚中MeHg/T-Hg的比值范圍為49.40%～99.80%，平均值（±SD）為83.39（±13.50）%，中位值為83.80%，該結(jié)果與浙江沿海海產(chǎn)品中汞形態(tài)的分布情況一致[29]。粵西11種不同品種海水魚MeHg/T-Hg比值存在顯著差異（p＜0.05）。

圖4 粵東海水魚肌肉中甲基汞與總汞比值(MeHg/T-Hg)分布Fig.4 Proportion of MeHg to T-Hg (MeHg/T-Hg) in marine fish muscle from eastern Guangdong

粵東某漁村的海水魚肌肉MeHg與T-Hg比值的分布情況見圖 4。該區(qū)域海水魚 MeHg含量范圍為8.32～200.20 ng/g，平均值（±SD）為52.69（±44.30）ng/g，中位值為40.22 ng/g；MeHg/T-Hg的比值范圍為12.88%～99.27%，平均值（±SD）為72.93（±27.10）%，中位值為68.80%；其中，鯔魚肌肉的MeHg/T-Hg比值最低，平均值（±SD）僅為17.70（±4.80）%?；洊|18種不同品種海水魚的MeHg/T-Hg的比值差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。

粵西和粵東兩個漁村的海水魚 MeHg/T-Hg比值的總體分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=2.54，p=0.0000），其平均水平也有顯著差異（Z=-3.18，p=0.0015），以粵西海水魚MeHg/T-Hg比值更高。但是，將粵東和粵西兩個漁村的海水魚 MeHg/T-Hg比值的總體分布分別與正態(tài)分布（Normal）、均勻分布（Uniform）和指數(shù)分布（Exponential）等比較后發(fā)現(xiàn)，兩個總體分布與這些分布均有顯著差異（p＜0.05），未能確定海水魚MeHg/T-Hg比值樣本總體的分布類型。

粵東地區(qū)比粵西地區(qū)海水魚 MeHg/T-Hg比值范圍跨度更大，可能原因是魚體內(nèi)的汞形態(tài)分布情況可能存在地域差異[30～32]。本研究中，粵東地區(qū)采集的海水魚體長跨度大，而隨著魚體長（魚齡）的增大，MeHg在海水魚中的百分含量也隨之增大[24]。對粵東和粵西兩個漁村相同的9種海水魚進(jìn)行兩獨立樣本的K-S檢驗，發(fā)現(xiàn)兩地區(qū)海水魚MeHg/T-Hg比值的差異有統(tǒng)計學(xué)意義的品種有卵形鯧鲹（Z=-1.60，p=0.0117）、舌鰨（Z=-1.41，p=0.0366）、馬鮫魚（Z=-1.55，p=0.0165）和鯔魚（Z=-1.49，p=0.0235），其余 5種海水魚均不具有統(tǒng)計學(xué)意義。這說明了卵形鯧鲹、舌鰨、馬鮫魚和鯔魚這4種海水魚的MeHg/T-Hg比值表現(xiàn)出了地域差異，暗示了魚體汞形態(tài)分布情況存在地域差異現(xiàn)象。

2.5 海魚T-Hg含量與MeHg/T-Hg比值的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果表明，除了卵形鯧鲹（r=-0.6308，p=0.0156）、二長棘鯛（r=-0.7619，p=0.0280）和鯔魚（r=-0.8333，p=0.0053）等3種海魚，其余納入統(tǒng)計的17種海水魚的T-Hg含量與MeHg/T-Hg比值均不具有顯著相關(guān)性（p＞0.05），說明了 MeHg/T-Hg比值可能在一定的范圍內(nèi)變化，但是不受總汞含量分布的影響。

3 結(jié)論

綜上所述，運(yùn)用 DMA80直接測汞儀法和HPLC-online UV reduction-AFS法測定粵東和粵西漁村海水魚樣品總汞和甲基汞的含量，結(jié)果表明：（1）甲基汞是海水魚肌肉主要的汞形態(tài)，海水魚肌肉MeHg/T-Hg比值接近80%；（2）兩地區(qū)擁有T-Hg含量極大值的海水魚為海鰻（201.68 ng/g），擁有MeHg含量極大值的海水魚為藍(lán)圓鲹（200.20 ng/g），鯔魚肌肉的MeHg/T-Hg比值最低為17.70（±4.80）%，所有海水魚樣品MeHg含量均低于我國對食品甲基汞含量的限量值“魚類≤0.5 mg/kg，肉食性魚類≤1.0 mg/kg”；（3）兩地區(qū)海水魚總汞含量按食性的排序均呈現(xiàn)了以下規(guī)律：肉食性魚類＞雜食性魚類，并且該規(guī)律具有統(tǒng)計學(xué)意義；（4）海水魚汞形態(tài)分布情況可能存在地域差異和品種差異。