附子雙酯型二萜生物堿對代謝酶的影響及心肌毒性研究進展*

孫 燕，王 雨，劉京華，王斯維，王小瑩

（天津中醫(yī)藥大學，天津 300193）

附子是毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaelii Debx.）的子根加工品，是一類重要的有毒植物，廣泛分布于北半球的山區(qū)或較冷地區(qū)[1]。根據(jù)炮制方法不同，主要有鹽附子、黑順片、白附片。附子具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛的功效，主治亡陽欲脫、腎陽不足、寒濕痹痛等，現(xiàn)代廣泛應用于治療各種疾病，包括炎癥、疼痛、神經(jīng)、腫瘤和心血管疾病。附子中主要成分是二萜生物堿，其既是生理活性成分，也是毒性成分。二萜類生物堿主要有3種：單酯型二萜生物堿、雙酯型二萜生物堿和醇胺型二萜類生物堿。毒性最大的成分是雙酯型二萜生物堿，其包括烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿。雙酯型二萜生物堿的毒性主要是由于C8位的乙酰基，C13位的羥基，C1、C6、C16、C18 位的甲氧基和 C14 位的苯甲酰酯基[2]。文章將主要對雙酯型二萜生物堿對代謝酶的影響，心肌毒性及配伍減毒作一綜述。

1 雙酯型二萜生物堿的代謝途徑及其對代謝酶的影響

研究表明雙酯型二萜生物堿在體內(nèi)主要通過肝微粒體中的細胞色素450酶系（CYP450）代謝，毒性較大的雙酯型二萜生物堿在CYP450酶的作用下，代謝成毒性較小的單酯型二萜生物堿，達到減毒的效果，但是目前大量研究表明雙酯型二萜生物堿能抑制CYP450酶的活性，從而減輕其對自身的代謝作用，產(chǎn)生毒性。

1.1 雙酯型二萜生物堿的代謝途徑 CYP450酶是機體內(nèi)催化Ⅰ相代謝反應(氧化、還原、水解反應）非常重要的氧化酶，CYP450酶參與了超過90%藥物的代謝過程，在藥物代謝和解毒過程中，CYP450酶是重要的Ⅰ相代謝酶[3]，且被美國食品藥品管理局（FDA）認定為藥物相互作用的重要原因。有多種亞型酶，在肝臟中含量最豐富，尤其是在肝微粒體中最多。

CYP3A是肝臟中最多的CYP450代謝亞型酶，它參與了目前所有使用藥物45%～60%的藥物代謝。CYP3A 的 4 個亞型：CYP3A3、CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7在人類肝臟中表達，而CYP3A1和CYP3A2主要在大鼠肝臟中表達[4-6]，表明人和鼠有不同的代謝特征。

Tang等[7]發(fā)現(xiàn)烏頭堿在人肝微粒體中產(chǎn)生6種代謝物，烏頭堿主要通過CYP3A4/5和CYP2D6代謝，而CYP2C8、CYP2C9和CYP2C19發(fā)揮次要作用，CYP1A2和CYP2E1不參與烏頭堿代謝。Ye等[8-9]應用人肝微粒體，發(fā)現(xiàn)次烏頭堿在體外產(chǎn)生11種代謝產(chǎn)物，其中包括中烏頭堿，代謝酶CYP3A4和CYP3A5發(fā)揮主要作用，CYP2C19、CYP2D6和CYP2E1發(fā)揮次要作用，而CYP1A2和CYP2C8作用較少。并在人肝微粒體中發(fā)現(xiàn)了9種中烏頭堿的代謝物，其主要的代謝酶是 CYP3A4和 CYP3A5，而 CYP2C8、CYP2C9和CYP2D6發(fā)揮次要作用。

Wang等[10]在大鼠肝微粒體中發(fā)現(xiàn)了6種烏頭堿的代謝產(chǎn)物，其主要的代謝酶是CYP3A1和CYP3A2，而CYP1A1和CYP1A2發(fā)揮次要作用。次烏頭堿在大鼠肝微粒體中被代謝成7種產(chǎn)物，CYP3A 是主要代謝酶，CYP2C、CYP2D、CYP2E1、CYP1A2也參與其中；中烏頭堿在大鼠肝微粒體中的代謝產(chǎn)物共有6種，CYP3A起主要作用，CYP2C、CYP2D也參與代謝[11-12]。

1.2 雙酯型二萜生物堿對CYP450酶的抑制作用 李晗等[13]應用CYP3A4基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細胞（HepG2）和人結(jié)直腸腺癌細胞（LS174T），加入不同濃度的烏頭堿、次烏頭堿和中烏頭堿，檢測烏頭類生物堿對CYP3A4的活性以及mRNA和蛋白表達水平的影響，結(jié)果表明烏頭堿、次烏頭堿、中烏頭堿均能抑制CYP3A4的活性以及mRNA和蛋白的表達。

睪酮（Tes）和丁螺環(huán)酮（BP）是敏感的 CYP3A底物（由FDA認定），他們分別能檢測CYP3A在體外和體內(nèi)的活性。Tes[14]主要由CYP3A代謝成6β-羥基睪酮（6β-OH-Tes）。BP 被代謝成 1-（2-嘧啶基）哌嗪（1-PP）、6’-羥基丁螺環(huán)酮（6’-OH-BP）[15]。Wu等[16]通過給予SD大鼠不同濃度的生川烏和炮制川烏，離體實驗中，檢測大鼠肝微粒體中Tes和其代謝產(chǎn)物6β-OH-Tes的水平，來評價CYP3A的活性，檢測大鼠肝組織中CYP3A蛋白和CYP3A1、CYP3A2 mRNA表達水平；在體實驗中，檢測給藥后不同時間點血漿中BP和它的代謝物1-PP、6’-OH-BP的水平，來評價CYP3A的活性；結(jié)果表明生川烏和炮制川烏能顯著降低體內(nèi)外CYP3A的活性、CYP3A蛋白和 CYP3A1、CYP3A2 mRNA表達水平。

由以上可知，雙酯型二萜生物堿在人肝微粒體中主要經(jīng)CYP3A4/5和CYP2D6代謝，而CYP2C9、CYP2C8、CYP2C19和CYP2E1發(fā)揮次要作用，但是雙酯型二萜生物堿能抑制CYP3A4/5的表達及活性，從而減少了有毒生物堿在體內(nèi)的代謝，如圖1所示。

2 雙酯型二萜生物堿對心肌細胞的毒性機制

圖1 雙酯型二萜生物堿對人CYP450酶的影響

雙酯型二萜生物堿對心肌毒性的主要機制包括：抑制CYP2J3的表達水平，促進氧化損傷，誘導細胞凋亡，縫隙連接蛋白Cx43異常以及鈉離子（Na+）、鉀離子（K+）、鈣離子（Ca2+）濃度的改變而影響細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。

2.1 抑制代謝酶CYP2J3的表達 CYP2J3屬于細胞色素P450酶家族，其在心肌中的表達量最高，CYP2J3參與內(nèi)源性物質(zhì)花生四烯酸的代謝，生成環(huán)氧二十碳三烯酸（EETs），EETs是一種內(nèi)源性心血管活性物質(zhì)，具有心肌保護作用。Xiao等[17]應用大鼠胚胎心室肌細胞（H9c2）給予不同劑量的附片注射液孵育4 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，附片注射液組細胞活力和自發(fā)搏動率下降，半胱天冬酶-3/7（Caspase-3/7）、乳酸脫氫酶（LDH）和細胞凋亡率顯著升高，且呈劑量依賴性；CYP2J3的mRNA表達水平隨附片注射液濃度的升高而顯著降低，說明附子通過降低CYP2J3 mRNA的表達水平，促進細胞凋亡，從而損傷心肌。

2.2 促進氧化損傷 Skrupskii等[18]發(fā)現(xiàn)烏頭堿誘導心律失常時，心臟磷脂中的多烯脂肪酸的比例減少，而飽和脂肪酸增多，說明發(fā)生了脂質(zhì)過氧化反應，而丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一。張琦等[19]應用心衰大鼠模型分別給予單酯型烏頭堿和雙酯型烏頭堿，檢測心肌組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性和MDA含量，結(jié)果表明心衰大鼠模型組較假手術(shù)組中SOD活性降低，MDA增多；而單酯型烏頭堿和雙酯型烏頭堿組比模型組中的SOD活性更低，MDA含量更高。提示其毒性機制與心肌氧化損傷有關(guān)。

2.3 誘導細胞凋亡 有研究表明，雙酯型二萜生物堿可以導致細胞凋亡，但對其機制的研究甚少。Gao等[20]應用H9c2細胞給予不同濃度的烏頭堿，結(jié)果表明烏頭堿能抑制心肌細胞活力，提高活性氧（ROS）水平，降低ATP含量，下調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體γ激活劑1α（PGC-1α）和B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）的表達，上調(diào)細胞色素 C、Caspase-3和B淋巴細胞瘤-2相關(guān)蛋白X（Bax）的表達。PGC-1α能刺激線粒體生物合成與能量代謝，其表達降低說明線粒體的生物合成減少。同時從線粒體釋放的細胞色素C增多，進而激活Caspase-3促進細胞凋亡。細線粒體途徑是經(jīng)典的凋亡途徑之一，而胞色素C的釋放是啟動線粒體介導的細胞凋亡途徑的關(guān)鍵[21]。

還有研究表明，烏頭堿能夠增加大鼠心臟組織中 LDH、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酸激酶（CK）的含量并且使心肌組織產(chǎn)生病理損傷，且具有濃度依賴性；烏頭堿還能降低心肌細胞中Bcl-2/Bax比率，促進半胱天冬酶-9（Caspase-9）和Caspase-3的表達，增加磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（p-Erk）/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（Erk），p-p38/p38 的比率，p-Erk、Erk、p-p38、p38都屬于有絲分裂激活蛋白激酶（MAPK）家族，p38是MAPK的亞型，p38 MAPK的磷酸化可以誘導細胞凋亡[22]。給予烏頭堿的同時加入p38MAPK的抑制劑SB203580，能明顯降低烏頭堿所致的凋亡反應，由此可推測烏頭堿通過p38 MAPK通路誘導凋亡反應[23]。

2.4 抑制縫隙連接蛋白（Cx）43的表達 縫隙連接是相鄰細胞間一種獨特的連接通道，它是細胞間親水小分子直接進行細胞質(zhì)交換的唯一通道，這一過程稱為縫隙連接通訊[24]。它可以允許分子量＜1 000的水溶性物質(zhì)通過，如：氨基酸、第二信使分子等。縫隙連接通道是一種蛋白12聚體復合物，由相鄰細胞膜上的2個連接小體對接而成，而每個連接小體又由6個縫隙連接蛋白單體拼合而成[25]。心肌細胞中的縫隙連接蛋白主要包括Cx40、Cx43、Cx45，其中Cx43在心室肌上表達最多。Cx43表達水平和功能的改變參與了心律失常的發(fā)生[26]。有研究表明，烏頭堿能誘導心肌細胞Cx43蛋白脫磷酸化，且在Ser368位點發(fā)生了顯著的脫磷酸化[27]，次烏頭堿能降低心肌細胞Cx43的表達量，增加心肌細胞發(fā)生心律失常的易感性[28]。

2.5 促進Na+內(nèi)流 Na+通道是所有動物中電信號的主要啟動鍵，而電信號則是神經(jīng)活動和肌肉收縮等一系列生理過程的控制基礎(chǔ)。烏頭堿一直被認為是一種典型的神經(jīng)毒素，選擇性作用于電壓依賴性Na+通道的神經(jīng)毒素結(jié)合受體Ⅱ的α亞基，延長Na+通道的開放[29]。烏頭堿可以作用于電壓依賴性Na+通道，抑制Na+從激活狀態(tài)到非激活狀態(tài)的構(gòu)象變化，從而使膜持續(xù)去極化[30-31]，大量Na+流入細胞質(zhì)，最終引起心律失常。

2.6 抑制K+通道 K+通過細胞膜上的K+通道，進入胞漿與相應的位點結(jié)合或激活某些分子，來完成多種生命活動。研究表明，烏頭堿能抑制大鼠心肌細胞的瞬時外向K+電流，增加內(nèi)向整流K+電流的水平，延長了動作電位時程（APD）[32]。K+通道基因Kv4.3廣泛分布于心臟，Kv4.3 mRNA表達的變化可以引起瞬時外向K+電流的改變，有研究表明，烏頭堿可以降低乳鼠心肌細胞的Kv4.3 mRNA表達水平，從而延長APD，導致心律失常[33]。超速延遲整流K+電流是延遲整流K+電流中的一種，烏頭堿還能抑制心肌細胞的超速延遲整流K+電流，并呈現(xiàn)濃度和時間依賴性，延長APD[34]。

2.7 導致Ca2+超載 Ca2+是機體各項生理活動不可缺少的離子，眾所周知，鈣超載在心功能障礙的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[35]。研究發(fā)現(xiàn)[36]，次烏頭堿能引起心肌細胞L-型鈣通道α1C mRNA高表達，α1C不僅是L-型鈣通道構(gòu)成Ca2+進入孔道的主要結(jié)構(gòu)，也是細胞內(nèi)Ca2+濃度增加時Ca2+-CaM復合物反饋性調(diào)節(jié)L-型鈣通道的位點[37]，雷諾定受體或蘭尼堿受體（RyR2）是一種Ca2+通道，位于肌質(zhì)網(wǎng)中。α1C mRNA高表達的同時，鈣調(diào)蛋白和RyR2 mRNA的表達水平也升高，說明Ca2+進入胞質(zhì)后激活肌質(zhì)網(wǎng)RyR2，使肌質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+進入胞質(zhì)中（以鈣釋鈣的機制）[38]。

心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶（SERCA）在心肌細胞鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，該酶激活時過多的Ca2+被排出細胞。Na+-Ca2+交換體（NCX）是 Ca2+雙向轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，主要負責心肌細胞內(nèi)外的Na+、Ca2+雙向交換。細胞內(nèi)Na+增多時，可刺激NCX，使Ca2+內(nèi)流。Zhou等[39]研究發(fā)現(xiàn)，烏頭堿能增加心肌細胞中L-型鈣通道的活化和失活時間，降低SERCA的表達，導致Ca2+排出減少，增加NCX的表達水平，使Ca2+內(nèi)流增加，造成鈣超載。L-型鈣通道阻滯劑硝苯地平和RyR通道的抑制劑釕紅能顯著改善烏頭堿所致的心律失常反應[40-41]。具體的鈣超載機制如圖2所示。

3 與CYP450酶有關(guān)的附子配伍減毒研究

藥對是中醫(yī)臨床常用相對固定的兩味藥的配伍組合，配伍既能照顧復雜病情，又能增效減毒，因而被廣泛采用。古代醫(yī)家因附子有大毒，因此常和其他藥物配伍使用，從而達到增效減毒的作用。附子-甘草、附子-人參，這2個藥對能促進CYP450酶的表達，改善心肌的氧化損傷、抑制細胞凋亡、降低鈣超載，同時也是從古至今臨床應用最多的藥對，尤其是附子-甘草。

圖2 附子導致鈣超載的作用機制

3.1 附子與甘草配伍研究 甘草為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）或脹果甘草（Glycyrrhiza inflate Batal.）的根及根莖。古代醫(yī)家經(jīng)常用甘草配伍附子，來緩解附子的毒性，這種配伍方法直至現(xiàn)在一直廣泛用于臨床?，F(xiàn)代研究表明附子與甘草配伍后比單用附子其烏頭堿含量明顯降低，說明配伍后起到減毒增效的作用[42]。研究表明與單用烏頭相比，烏頭配伍甘草能顯著增加CYP3A的表達水平，從而促進烏頭類生物堿的代謝[43]。甘草次酸和甘草苷目前被認為是甘草解毒的主要有效成分。將烏頭堿和次烏頭堿分別與甘草次酸、甘草苷兩兩配伍，結(jié)果表明較烏頭堿組相比，各配伍組能顯著改善心肌細胞的存活率、琥珀酸脫氫酶（SDH）、Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶的活性，保護心肌損傷[44]，甘草次酸和甘草苷還能增加Cx43的基因表達水平[45]，降低RyR2和Kv4.3 mRNA 的表達，改善 K+、Ca2+濃度[46-47]。

3.2 附子與人參配伍研究 人參為五加科植物人參（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根和根莖，是“補氣之圣藥”。從古至今附子-人參是最常用的藥對之一，如參附湯等?，F(xiàn)代常用于治療心力衰竭等心血管疾病。馬增春等[48]研究發(fā)現(xiàn)，附子-人參配伍應用時，雙酯型二萜生物堿的含量顯著降低，而單酯型二萜生物堿的含量顯著升高，說明人參促進了附子的代謝，達到減毒效果。附子-人參配伍還能有效升高SOD，降低MDA、LDH水平，降低Caspase-3和Bax蛋白表達水平，提高Bcl-2的蛋白和基因水平，說明人參抑制了附子對心肌細胞產(chǎn)生的毒性作用[49]。

4 總結(jié)

附子在臨床上被廣泛使用，具有回陽救逆的功效，且效果顯著，但同時也具有較大毒性，應用不當會導致嚴重的毒性反應，尤其是對心臟的毒性。因此，對于其毒性反應知識的了解顯得格外重要。本文總結(jié)了雙酯型二萜生物堿對心肌毒性反應的機制和對代謝酶的作用，并且列出了臨床上常用的配伍減毒中藥，但其作用機制較為復雜。文章對雙酯型二萜生物堿的心肌毒性相關(guān)研究進行綜述，希望為科研工作者提供有益的參考依據(jù)。