組學(xué)在花藥發(fā)育研究中的應(yīng)用進(jìn)展Ⅰ:轉(zhuǎn)錄組學(xué)

張?jiān)趯? 趙 海, 胡夢輝, 鄧麗君, 王 琦, 李九麗, 袁紅雨,2

1.信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 河南 信陽 464000;2.信陽師范學(xué)院, 河南省茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南 信陽 464000

開花植物中，花藥不僅為花粉的產(chǎn)生、發(fā)育及成熟提供了適宜的環(huán)境，并且花藥發(fā)育過程是直接決定植物育性的關(guān)鍵所在。因此研究植物的花藥發(fā)育，進(jìn)一步解析植物的生殖發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對于提高植物的抗逆能力、闡明植物雄性不育機(jī)制、培育新的作物品種以及最終提高糧食產(chǎn)量具有重要的理論意義與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

當(dāng)前，在花藥中單純研究某個(gè)基因或單一生物分子的變化，已經(jīng)很難滿足系統(tǒng)生物學(xué)越來越高的研究期望。因此，綜合多組學(xué)數(shù)據(jù)，從基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白和代謝水平全面深入地對生物過程進(jìn)行闡釋以更好地對生物系統(tǒng)進(jìn)行全面了解已成為研究的熱點(diǎn)。組學(xué)研究是隨著系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展迅速發(fā)展起來的，它的運(yùn)用為系統(tǒng)生物學(xué)提供了大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和先進(jìn)的技術(shù)方法，并且為系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展提供了新穎的研究思路，加速了系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展。

近年來，以轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)為代表的組學(xué)分析方法正逐步在植物花藥發(fā)育的研究上應(yīng)用，取得了很多突破性的研究成果。本系列文章較全面地介紹了轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)[1]在植物花藥和花粉發(fā)育、雄性不育和逆境脅迫中的研究成果，以及在非編碼RNA中的研究進(jìn)展，總結(jié)和評述了組學(xué)整合分析的發(fā)展趨勢,以期為花藥發(fā)育相關(guān)研究提供參考。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)的概念由 Velculescu等[2]首先提出，指某一特定生理?xiàng)l件下從RNA水平研究基因表達(dá)的情況，即生物樣本內(nèi)全部轉(zhuǎn)錄本的RNA序列的測序，是研究基因功能和細(xì)胞表型的一個(gè)重要手段。目前研究轉(zhuǎn)錄組學(xué)的主要研究方法有：表達(dá)序列標(biāo)簽、基因表達(dá)序列分析、基因芯片、cDNA-AFLP、高通量測序、逆轉(zhuǎn)錄PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、生物信息學(xué)等。在花藥中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究有利于闡明花藥發(fā)育過程中發(fā)生的生物過程的潛在機(jī)制，本文主要闡述了轉(zhuǎn)錄組學(xué)在植物花藥發(fā)育研究中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在研究花藥發(fā)育功能基因方面的應(yīng)用

前人在花藥發(fā)育關(guān)鍵基因上的認(rèn)識主要是通過功能基因敲除、誘變或RNA干擾技術(shù)收集的信息[2]。在擬南芥中，許多對花藥發(fā)育至關(guān)重要的基因已被闡明。在擬南芥花藥發(fā)育的早期階段，SPL和EMS1發(fā)揮著重要作用[3～10]，SPOROCYTELESS(SPL)/NOZZLE和ROX參與孢原細(xì)胞分化[3,4,11]，AtMYB103、DYT1、TDF1、AMS和MS1在絨氈層發(fā)育和細(xì)胞程序性死亡中起重要作用[5～9]。此外，ems1轉(zhuǎn)錄組的變化表明細(xì)胞和細(xì)胞的信號傳導(dǎo)能夠顯著影響絨氈層中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[12]。目前通過微陣列和序列合成技術(shù)已經(jīng)在許多植物中分析了花藥轉(zhuǎn)錄組。比如使用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法鑒定了170個(gè)小麥基因，用于花藥和花粉發(fā)育、花粉和雌蕊相互作用等的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小麥近三分之一的基因組經(jīng)歷了亞基因組分化，在鑒定出的基因中，那些參與編碼脂質(zhì)代謝途徑的酶基因占最大類別，表明脂質(zhì)代謝在小麥生殖發(fā)育中比較重要和特殊[13]。Ma等[14]通過分析擬南芥小孢子敗育的不育突變體(ams)早期花藥的轉(zhuǎn)錄組譜發(fā)現(xiàn)，與野生型花藥相比，1 368個(gè)基因在ams中差異表達(dá)，這影響到了代謝、運(yùn)輸、泛素化和應(yīng)激反應(yīng)。此外，他們還將ams轉(zhuǎn)錄組譜與其他兩種不育突變體，spl/nzz和ems1/exs的序列組合，顯示至少一種突變體中有3 058個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生改變。ams花藥轉(zhuǎn)錄組的分析及其與spl/nzz和ems1/exs花藥的比較揭示了重疊和不同的受調(diào)控基因組，包括編碼轉(zhuǎn)錄因子和其他蛋白質(zhì)的基因。Feng等[15]對dyt1和野生型花藥的比較轉(zhuǎn)錄組分析表明，dyt1是正常表達(dá)途徑所必需的，包括脂質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)、花粉層形成、細(xì)胞壁修飾、木質(zhì)素和類黃酮生物合成以及轉(zhuǎn)運(yùn)。已有的研究表明dyt1與絨氈層功能以及減數(shù)分裂和花粉形成的進(jìn)程緊密相關(guān)[16,17]。另外，他們通過轉(zhuǎn)錄組分析表明dyt1可能作為精確控制絨氈層功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的樞紐。此外，許多基因也在水稻中被鑒定和表征，揭示了基因功能的差異或新的基因功能。Deveshwar等[2]對水稻花藥發(fā)育的四個(gè)階段，即減數(shù)分裂前、減數(shù)分裂、單細(xì)胞花藥和三核花粉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組綜合分析，發(fā)現(xiàn)在至少一個(gè)花藥發(fā)育階段中表達(dá)的22 000個(gè)基因中，減數(shù)分裂時(shí)期數(shù)量最多，在三核花粉時(shí)期數(shù)量最低。此外，他們通過基因本體論和階段特異性基因分析揭示了那些編碼轉(zhuǎn)錄因子和蛋白質(zhì)折疊、分選和降解途徑的基因在減數(shù)分裂中占主導(dǎo)地位，而在三核花粉中，編碼細(xì)胞結(jié)構(gòu)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因比較豐富。

成熟花粉的發(fā)育和釋放取決于花藥的營養(yǎng)細(xì)胞層和生殖細(xì)胞層中諸多基因的精細(xì)協(xié)調(diào)，花粉的大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組分析研究有助于表征植物花粉發(fā)育過程中的基因表達(dá)譜[18]。在水稻中，使用44K水稻寡核苷酸微陣列平臺(tái)和57K水稻基因組陣列，通過激光顯微切割絨氈層，小孢子和花粉來研究發(fā)育中花粉的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)水稻中花粉優(yōu)先產(chǎn)生或階段特異性轉(zhuǎn)錄物的“U型”變化，其中在雙細(xì)胞階段優(yōu)先表達(dá)的基因數(shù)量最少[19](表1)。研究人員使用擬南芥8K基因芯片研究了擬南芥成熟花粉的轉(zhuǎn)錄組，他們分別在成熟花粉中鑒定了992個(gè)和1 587個(gè)差異表達(dá)的基因，估計(jì)擬南芥中花粉表達(dá)基因的總數(shù)在3 500～5 500之間[21,30]。Li等[18]通過對油菜花藥發(fā)育過程進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)和碳水化合物代謝在整個(gè)花藥發(fā)育過程中比較活躍；早期花藥優(yōu)先表達(dá)參與脂質(zhì)代謝的基因，這與花粉形成以及胚細(xì)胞和胞質(zhì)體生物合成相關(guān)，而晚期花藥表達(dá)與碳水化合物代謝相關(guān)的基因以形成花粉并在成熟花粉粒中積累淀粉，這揭示了花藥發(fā)育過程中早期和晚期花藥發(fā)育階段之間基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。

表1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在花藥發(fā)育研究中的應(yīng)用Table 1 Application of transcriptomics in anther development research.

2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在挖掘花藥抗逆基因方面的應(yīng)用

高溫對植物的生殖發(fā)育有很大的影響。在對熱應(yīng)激的擬南芥研究中，觀察到營養(yǎng)生殖組織中不同的反應(yīng)模式，在高溫脅迫下，數(shù)百個(gè)基因在花組織中被特異性的上調(diào)或下調(diào)[22](表1)。Gonzalez-Schain等[23]對N22品種水稻開花期間熱處理和對照處理的生殖組織進(jìn)行RNA測序，揭示了許多編碼轉(zhuǎn)錄因子家族的基因，以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝途徑基因的表達(dá)被抑制。另一方面還發(fā)現(xiàn)編碼熱激因子的基因被高度激活，而且許多基因主要在花藥發(fā)育的后期階段表達(dá)。

在低溫敏感小麥品種的冷處理早期，對小孢子胚胎發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄變化和調(diào)節(jié)的研究中確定了大量推定的轉(zhuǎn)錄物，這些轉(zhuǎn)錄物可能是誘導(dǎo)小孢子胚胎發(fā)生的特定基因，Honys等[20]首次了解了小RNA在小孢子重編程中對胚胎細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)節(jié)作用(表1)。水稻生殖階段的低溫脅迫通常會(huì)導(dǎo)致花藥發(fā)育異常，造成小穗育性降低和產(chǎn)量下降。之前僅在幼苗期使用水稻葉片進(jìn)行水稻冷響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組研究，忽略了對冷更敏感的孕穗期，更忽略了與產(chǎn)量高度相關(guān)的生殖器官，如花藥。鑒于該階段在水稻栽培中的重要意義，研究孕穗期耐低溫遺傳機(jī)制勢在必行。Bai等[24]使用RNA-Seq分析來研究冷處理后生育敏感階段兩種不同光溫敏雄性不育水稻花藥的轉(zhuǎn)錄組，鑒定了差異表達(dá)的基因，例如轉(zhuǎn)錄因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組分和參與代謝的基因，擴(kuò)展了對植物冷應(yīng)激反應(yīng)的理解。此外，與DNA復(fù)制和核糖體相關(guān)的差異表達(dá)基因也在已有研究中得到了很大程度的豐富，這意味著這些過程可能在水稻花藥對冷脅迫的反應(yīng)中起重要作用(表1)。

3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在解析雄性不育分子機(jī)制方面的應(yīng)用

雄性不育是開花植物中普遍存在的一個(gè)現(xiàn)象，其特征在于植物不能產(chǎn)生正常功能的雄配子，但雌蕊仍具有接受來自其他正常植物的可育花粉并產(chǎn)生種子的能力[31]。導(dǎo)致雄性不育的原因很多，如低溫、高溫、干旱、重金屬、鹽度等非生物脅迫會(huì)導(dǎo)致花藥中很多蛋白質(zhì)發(fā)生變化，進(jìn)而造成雄性不育[32]。雄性不育是對植物進(jìn)行遺傳改良和利用作物雜種優(yōu)勢進(jìn)行優(yōu)化生產(chǎn)的重要工具，也是探索花藥和花粉發(fā)育生物學(xué)中細(xì)胞質(zhì)機(jī)制和逆轉(zhuǎn)信號通路的經(jīng)典模型。

現(xiàn)有的測序技術(shù)，已經(jīng)產(chǎn)生了高質(zhì)量的水稻、擬南芥和玉米的花藥孢子體轉(zhuǎn)錄組。這些轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)有助于在不同領(lǐng)域進(jìn)行研究，包括發(fā)育基因活動(dòng)網(wǎng)絡(luò)、酶和代謝域的變化，通過數(shù)量調(diào)節(jié)、分泌調(diào)節(jié)、反義轉(zhuǎn)錄物調(diào)節(jié)和小RNA預(yù)測蛋白質(zhì)功能，促進(jìn)了雄性不育的研究[33]。Qu等[25]通過檢測油菜雄性不育系WSLA和雄性可育系WSLB，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因中有很大一部分涉及與開花相關(guān)的生物過程，包括花粉管萌發(fā)和生長、花粉壁組裝和修飾，以及花粉外壁形成和授粉。此外，與孢粉質(zhì)積累相關(guān)的一部分基因在WSLA中均上調(diào)表達(dá)，過量的孢粉素導(dǎo)致花粉壁形成缺陷，這導(dǎo)致WSLA雄性不育(表1)。Yang等[27]在棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育研究中鑒定了大量具有生物學(xué)意義的差異表達(dá)基因，特別是與光合作用、氧化還原反應(yīng)、α-亞麻酸代謝和類黃酮生物合成有關(guān)的基因。

4 在尋找調(diào)控類非編碼RNA方面的應(yīng)用

非編碼RNA(ncRNA)是一類廣泛存在于植物、不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子。植物中的ncRNA主要由小ncRNA和長鏈非編碼RNA(lncRNA)組成，小ncRNA包括miRNA(microRNA)和siRNA(small interfering RNA)。它們直接以RNA分子的形式存在于植物體內(nèi)，具有重要的調(diào)節(jié)功能，并參與細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育等生理過程。研究植物的ncRNA可以為深入了解植物的生長發(fā)育及系統(tǒng)進(jìn)化提供重要信息。

植物miRNA是20～24個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，它通過轉(zhuǎn)錄后降解或抑制翻譯來調(diào)控靶基因的表達(dá)[34]。許多研究表明，miRNA在植物花藥發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，miRNA已在許多作物中被鑒定和表征。在芥菜中已經(jīng)鑒定了細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)和保持系之間47個(gè)差異表達(dá)的miRNA，這些miRNA可能參與花藥發(fā)育過程中與CMS發(fā)生有關(guān)的調(diào)控途徑[28]。在甘藍(lán)型油菜中，參與花粉發(fā)育的54個(gè)保守的和8個(gè)新的miRNA家族被鑒定[26](表1)。在蘿卜花藥中也鑒定出162種已知的miRNA，其中分別發(fā)現(xiàn)28種已知的miRNAs和14種潛在的miRNAs在CMS和保持系之間的進(jìn)一步發(fā)育過程中差異表達(dá)[29]。在陸地棉中，16個(gè)保守miRNA家族中的6個(gè)在花藥發(fā)育過程中細(xì)胞核雄性不育(genic male sterility, GMS)突變體和野生型之間顯示出明顯的表達(dá)差異[35]。Zhang等[36]對三系雜交棉系統(tǒng)減數(shù)分裂階段的花蕾進(jìn)行小RNA和轉(zhuǎn)錄組測序聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)許多miRNA(DEMs)及其靶基因差異表達(dá)，進(jìn)一步分析顯示這可能與CMS和育性恢復(fù)有關(guān)。另外，對玉米fzt突變體中的雄性不育缺陷個(gè)體進(jìn)行分析，結(jié)果表明在玉米花藥成熟的最后階段必須有miRNA的存在，并且花藥壁缺陷表明miRNA在花藥發(fā)育早期可能具有關(guān)鍵的調(diào)控作用[37]。

另外，長鏈非編碼RNA(lncRNAs)是指長度大于200個(gè)核苷酸、缺少編碼蛋白質(zhì)功能的RNA。目前已經(jīng)有一些研究報(bào)道了在花藥發(fā)育過程中起調(diào)控作用的lncRNAs，例如玉米Zm401是一種主要在花藥絨氈層和小孢子中表達(dá)的花粉特異性lncRNA，Zm401表達(dá)水平顯著影響MZm3-3、ZmC5和ZmMADS2的表達(dá)，這對于花藥發(fā)育十分重要；Zm401沉默后導(dǎo)致MZm3-3上調(diào)，以及ZmMADS2和ZmC5下調(diào)，并造成絨氈層功能和小孢子發(fā)育異常，最終導(dǎo)致植物雄性不育[38]。此外在大白菜花粉發(fā)育中具有重要功能的BcMF11，是一種含有828個(gè)核苷酸的lncRNA。BcMF11在花粉發(fā)育的許多階段轉(zhuǎn)錄，當(dāng)降低其表達(dá)時(shí)，絨氈層降解會(huì)延遲，同時(shí)也導(dǎo)致小孢子分離和花粉粒發(fā)育中止[39,40]。在水稻中鑒定了一種與長日特異性雄性不育相關(guān)的lncRNA(LDMAR)，在長日照條件下，正?；ǚ郯l(fā)育需要足夠的LDMAR轉(zhuǎn)錄物表達(dá)，LDMAR的突變沉默會(huì)導(dǎo)致發(fā)育中的花藥細(xì)胞過早地程序性死亡，從而造成植物光敏感雄性不育[41]。

綜上所述，轉(zhuǎn)錄組學(xué)在花藥發(fā)育功能研究、抗逆基因篩選、雄性不育機(jī)制探究乃至表觀遺傳(調(diào)控類非編碼RNA)解析等方面發(fā)揮廣泛而重要的作用。除了對不同發(fā)育階段的花藥器官或組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄譜分析外，針對某一特定花藥發(fā)育關(guān)鍵基因的突變體的轉(zhuǎn)錄組分析策略得到廣泛地應(yīng)用，這對深入探究花藥發(fā)育的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制具有顯著的促進(jìn)作用；花藥是植物對環(huán)境脅迫最敏感的器官之一，利用轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)挖掘抗逆基因很早就已得到應(yīng)用，某些抗逆關(guān)鍵基因的挖掘和應(yīng)用，無疑將極大地推動(dòng)農(nóng)作物的遺傳改良和觀賞植物的推廣種植；雄性不育是作物育種的主要材料來源之一，其與轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的結(jié)合是探究雄性不育背后的分子機(jī)制的關(guān)鍵手段；非編碼RNA的調(diào)控作用是生物的表觀遺傳現(xiàn)象之一，盡管目前已經(jīng)鑒定了一些非編碼RNA參與調(diào)控某些花藥基因的表達(dá)，但是還有極其多的調(diào)控類非編碼RNA未得到鑒定，大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組學(xué)的應(yīng)用在一定程度上緩解了這個(gè)問題。

5 展望

技術(shù)的誕生和創(chuàng)新源于應(yīng)用的需求。自從第二代測序技術(shù)問世以來，測序技術(shù)的發(fā)展可謂日新月異。目前，由于基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)所展現(xiàn)的混合細(xì)胞群體的限制，人們已經(jīng)開始探索并應(yīng)用單細(xì)胞測序技術(shù)來研究單一或單種細(xì)胞的基因和表達(dá)信息。2019年中國科技協(xié)會(huì)在科協(xié)年會(huì)上發(fā)布了20個(gè)前沿科學(xué)問題和工程技術(shù)難題，其中就有“單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)”。世界上沒有兩片完全一樣的葉子，同理，世界上也沒有兩個(gè)完全一樣的細(xì)胞，即使在同一個(gè)組織中剛剛經(jīng)有絲分裂產(chǎn)生的兩個(gè)子細(xì)胞之間也是如此。就花藥發(fā)育而言，花藥從外到內(nèi)分別由外表皮、內(nèi)表皮、中間層、絨氈層和生殖細(xì)胞組成，每種細(xì)胞都有其特定的起源、分化和功能。先前的研究主要是利用某基因的組織表達(dá)模式來推斷某細(xì)胞群在花藥發(fā)育中的功能，未來單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的應(yīng)用將極大地促進(jìn)各類型細(xì)胞功能的精確鑒定，另外其在各類型細(xì)胞起源的追溯和花藥器官的重建方面也具有非常重要的應(yīng)用潛力。