十二指腸潰瘍中幽門螺桿菌定植與菌群結(jié)構(gòu)的關(guān)系

陳 霞, 夏晨梅, 戴再友, 李倩倩, 金玲肖, 林佩麗, 張忠臣, 鐘海兵,顏海帆, 王國平, 戴 麗, 鐘玉芬, 吳忠標(biāo)

1.溫嶺市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科, 浙江 溫嶺 317500；2.溫嶺市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科, 浙江 溫嶺 317500；3.溫嶺市第一人民醫(yī)院內(nèi)鏡中心, 浙江 溫嶺 317500；4.溫嶺市第一人民醫(yī)院泌尿外科, 浙江 溫嶺 317500

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是引起十二指腸潰瘍的重要因素[1]，并會引起胃內(nèi)嚴(yán)重的并發(fā)癥。一項(xiàng)研究表明，在日本，94%的胃潰瘍患者和98%的十二指腸潰瘍患者與H.pylori的感染有關(guān)[2]。此前的研究[3]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)菌群定植在胃和十二指腸不同潰瘍類型間存在變化。Hp陽性的十二指腸潰瘍菌群多樣性明顯高于胃竇潰瘍，且螺桿菌屬在十二指腸潰瘍中并非唯一的優(yōu)勢菌屬。

十二指腸潰瘍是臨床上常見的消化性疾病，通常發(fā)生在十二指腸球部。胃及十二指腸內(nèi)微環(huán)境的組成也是近年來的研究熱點(diǎn)，Stearns等[4]對4名健康人的口腔相關(guān)菌群，胃、十二指腸和結(jié)腸黏膜相關(guān)菌群，以及糞便相關(guān)菌群進(jìn)行了 16S rRNA 基因高通量測序,分析了健康人十二指腸粘膜優(yōu)勢菌群為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)等。但還沒有學(xué)者對十二指腸黏膜由于感染Hp引起的潰瘍及非Hp感染引起的潰瘍菌群結(jié)構(gòu)的差異、Hp含量及其他菌群含量對潰瘍形成的影響進(jìn)行研究。

本研究針對十二指腸潰瘍Hp陽性患者及陰性患者的十二指腸黏膜菌群豐度、菌群結(jié)構(gòu)、生物多樣性等進(jìn)行分析研究。比較Hp引起的潰瘍及非Hp感染引起的潰瘍菌群結(jié)構(gòu)的差異，分析Hp定植對十二指腸黏膜菌群的影響，明確除Hp外的菌群是否對十二指腸粘膜有影響，以期為研究黏膜菌群與潰瘍疾病的相關(guān)性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

研究對象為 2017 年 11 月～2018 年 3 月就診于溫嶺市第一人民醫(yī)院十二指腸球部潰瘍但無胃潰瘍確診患者。治療階段時，對患者進(jìn)行健康教育，告知所患疾病的病因、臨床表現(xiàn)及疾病的發(fā)展等，告誡患者遵從醫(yī)囑的重要性。每位研究對象在胃鏡檢查前進(jìn)行13C 尿素呼氣試驗(yàn)檢查(13C 使用 75 mg 劑量)。其中十二指腸潰瘍且Hp陽性5例定為 A 組，十二指腸潰瘍且Hp陰性 5 例定為 B 組。該研究已通過溫嶺市第一人民醫(yī)院倫理委員會審核。

病例入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡 30～55 歲，男女不限；②因不同程度十二指腸潰瘍等就診；③近 2 周內(nèi)未使用抗生素、鉍劑、H2受體拮抗劑或 PPI 制劑。④未進(jìn)行過Hp根除治療。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重心、肝、腎功能損害者；②妊娠或哺乳期婦女；③有食管、胃腸手術(shù)史者；④患者不能正確表達(dá)自己的主訴，如精神病、嚴(yán)重神經(jīng)官能癥者；⑤患者同時服用非甾體抗炎藥或酗酒；⑥對青霉素藥物過敏者。

本研究共納入 10 位十二指腸潰瘍患者。經(jīng)過13C 呼氣試驗(yàn)及Hp分離培養(yǎng)篩選，十二指腸潰瘍Hp陽性組 5 例，平均年齡為 38.6 歲，男女比例為 2∶3；十二指腸潰瘍Hp陰性組 5 例，平均年齡為 47.6 歲，男女比例為 3∶2。兩組患者間年齡及性別無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2 標(biāo)本采集

經(jīng)胃鏡下確診為十二指腸潰瘍無胃潰瘍的患者，采集胃竇小彎處黏膜及十二指腸球部潰瘍周邊 2～3 cm 的球部部位各一塊。采集的粘膜組織標(biāo)本、胃竇小彎黏膜標(biāo)本置于Hp分離培養(yǎng)保存，十二指腸球部黏膜置于含 TE 緩沖液(500 μL)的樣品管中。

1.3 Hp分離及鑒定

對用于Hp分離培養(yǎng)的標(biāo)本進(jìn)行研磨接種培養(yǎng)，三氣培養(yǎng)96 h觀察結(jié)果，陰性樣本培養(yǎng)時間延至 11 d。根據(jù)菌落形態(tài)、生化反應(yīng)(尿素酶、氧化酶、觸酶)判定培養(yǎng)結(jié)果。

1.4 樣本 DNA 的提取及質(zhì)控

胃黏膜樣品采用博邁德公司的DNA提取試劑盒提取總基因組 DNA，并測序，具體的操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。用 DNA 純化試劑盒純化并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳定性檢測和測定濃度后 -20℃ 保存。

1.5 16S rRNA 基因建庫及測序

針對所有胃黏膜樣品的 16S rRNA基因 V3-V4 區(qū)，選用上游引物5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGC-WGCAG-3’ 和下游引物5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTA-CTAATCC-3’ 進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為(20 μL)： HiFi Buffer(2×)10 μL，模板為10 ng。擴(kuò)增條件：95℃，3 min； 95℃，30 s，60℃，30 s，72℃，30 s，25 個循環(huán)；72℃，5 min。PCR 產(chǎn)物測序前處理：磁珠純化：取上步20 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入16 μL磁珠(磁珠要提前30 min放入室溫)，吹打混勻，室溫放置 5 min；將離心管放在磁架上 1～2 min 待液體變清，吸棄上清，勿碰到磁珠；緩慢加入200 μL 80%乙醇，洗滌，30 s后吸棄乙醇，重復(fù)一次；室溫放置數(shù)分鐘，揮發(fā)乙醇；待磁珠中心干裂即可加入 40 μL 水進(jìn)行洗脫，用移液器吹打混勻，室溫靜置 5 min；將離心管放在磁架上 1～2 min 待液體變清，吸取上清至新的潔凈離心管中，得到純化后的一次PCR產(chǎn)物；最后，將總PCR產(chǎn)物經(jīng) Illumina MiSeq 測序儀進(jìn)行測序。

1.6 測序數(shù)據(jù)分析

通過 CASAVA v1.8.2軟件分析測序結(jié)果的原始圖像數(shù)據(jù)，并在初步質(zhì)量分析后獲得測序數(shù)據(jù)。用 Pandaseq v2.7比較每兩個序列并根據(jù)重疊區(qū)域的末端進(jìn)行組裝。使用 Trimmomatic v0.30去除引物和接頭序列，以及兩端質(zhì)量小于 20 的堿基和長度小于 400 bp的序列。使用 Usearchv 8.0將剩余序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比較，并移除嵌合序列以獲得最終驗(yàn)證的數(shù)據(jù)。操作分類單元(OTU)是聚類序列最小單元，通過 UCLUST 方法進(jìn)行聚類，參數(shù)相似度設(shè)置為 97%，并獲得OTU列表和OTU代表序列。根據(jù)OTU聚類的結(jié)果， ACE、 Chao1、Shannon和 Simpson 用于分析粘膜樣品的豐度和多樣性。使用 QIIME v1.7平臺，基于 UniFrac 距離進(jìn)行主成分分析。使用 UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean)聚類方法，基于 weighted unifrac 和unweighted unifrac 距離矩陣，將樣品進(jìn)行聚類。得到 weighted unifrac 樣本聚類樹。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，通過 Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)比較每個門或?qū)俚闹形粩?shù)豐度，百分率的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05 判斷差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性分析

本次測序共得到 760 312 條 Reads，有效 Reads 數(shù)為 730 818 條，所有序列按 97%相似度進(jìn)行 OTU 分類，共得到 25 624 個 OTU。其中A組有 18 782 個OTU，B 組有 13 969 個 OTU，文本覆蓋率為 96 %。計(jì)算 ACE、Chao1 物種豐度指數(shù)及 Shannon、Simpson 多樣性指數(shù)。兩組指數(shù)分析統(tǒng)計(jì)如圖 1 。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由圖1A、B可知， A組ACE指數(shù)均值為10 750.3， B 組為7 284.4，A 組 Chao1 指數(shù)均值為 10 222.5， B組為 6 950.8，兩組之間 ACE 指數(shù)和 Chao1指數(shù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明Hp感染后反而增加了十二指腸潰瘍黏膜中定植細(xì)菌的物種總數(shù)。而由圖1C、D 可知， A 組 Shannon 指數(shù)均值為 8.6， B組Shannon指數(shù)均值為 7.1，A組 Simpson 指數(shù)均值為 0.98， B組 Simpson 指數(shù)均值為 0.95，兩組之間 Shannon 指數(shù)和 Simpson 指數(shù)差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。統(tǒng)計(jì)顯示， A 組菌群多樣性均數(shù)比 B 組略高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 α多樣性比較Fig.1 Comparison of α diversity.注：A: ACE指數(shù); B: Chao1指數(shù); C: Shannon指數(shù); D:Simpson指數(shù)。*表示在P<0.05水平上差異顯著。

2.2 β多樣性分析

采用 QIIME，計(jì)算得到 UniFrac 距離, 并經(jīng)過 QIIME 對 UniFrac 距離進(jìn)行主成分分析 (principal coordinate analysis)，得到物種的 weighted 的 UniFrac 聚類結(jié)果，得到 PCoA 分析圖，如圖2。

圖2 PCoA分析圖Fig.2 PCoA analysis diagram.A：PC1與PC2 為第一和第二主坐標(biāo)得到的 PCoA 圖；B：PC1與PC3 為第一和第三主坐標(biāo)得到的 PCoA 圖；C：PC2與PC3 為第二和第三主坐標(biāo)得到的 PCoA圖。

使用 UPGMA聚類方法，基于 weighted unifrac 和 unweighted unifrac 距離矩陣，將樣品進(jìn)行聚類。得到 weighted unifrac 樣本聚類樹，如圖3。

圖3 Weighted unifrac 樣本聚類樹Fig.3 Weighted unifrac sample clustering tree.

從圖2可以看出，兩組間的相似性較大，基本是聚類在一起的，但從圖3可以看出，進(jìn)化譜系中 A 組樣本中有較顯著的微生物群落差異。而 B 組樣本中微生物群落差異很小。說明Hp的定植在一定程度上改變了原有的微生物群落。

2.3 菌群種系分布

每個樣本在門水平下主要的物種分布柱狀圖如圖4A，在屬水平下主要的物種分布柱狀圖如圖4B,從門水平上看，兩組的優(yōu)勢菌門均為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和梭桿菌門(Fusobacteria)。

經(jīng)過非參數(shù)檢驗(yàn)分析，A組中厚壁菌門(Firmicutes)及Candidate_division_TM7 占的比例顯著比B組大(P<0.05)(圖5A、B)。

從屬水平上看，優(yōu)勢菌屬種類上 A 組與 B 組相差不多。共同的優(yōu)勢菌屬為普雷沃氏菌屬(Prevotella)、奈瑟菌屬(Neisseria)和鏈球菌屬(Streptococcus)等。在 A 組中可以發(fā)現(xiàn)Hp含量不高，有些樣品Hp含量甚至少于10%。說明Hp可在十二指腸黏膜中定植，但不是唯一的優(yōu)勢菌群。

經(jīng)過非參數(shù)檢驗(yàn)分析， A 組中纖毛菌屬(Leptotrichia)占的比例顯著比 B組大(P<0.05)(圖5C)。

圖4 菌群種系分類分布圖Fig.4 Classification map of flora germline.A：兩組十二指腸黏膜菌群主要種系門水平分布圖；B：兩組十二指腸黏膜菌群主要種系屬水平分布圖。

圖5 兩組具有差異的種系比較Fig.5 Comparison of the two groups with different phylogeny.A：厚壁菌門含量的比較；B：Candidate_division_TM7 菌門含量的比較；C：纖毛菌屬含量的比較。*表示在P<0.05水平上差異顯著。

3 討論

十二指腸潰瘍的致病機(jī)理有很多，其中Hp感染是主要因素[2]。Hp是 1983年澳大利亞學(xué)者 Marshall 和 Warren 首次分離發(fā)現(xiàn)的，人們認(rèn)為它定植在人胃黏膜內(nèi)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，Hp也可定植在十二指腸黏膜內(nèi)。但Hp在十二指腸黏膜內(nèi)并不是絕對的優(yōu)勢菌群，與此前的研究結(jié)果一致[3]。

Maldonadocontreras等[6]研究表明Hp定植只能解釋胃微生物群 28%的菌群變化，而 44%與宿主因素有關(guān)。宋陽等[7]通過蒙古沙鼠為實(shí)驗(yàn)動物建立定植模型發(fā)現(xiàn)Hp的定植會引起胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的改變。菌群的種類和數(shù)量上都會受到Hp定植的影響。胃內(nèi)主要菌種的主導(dǎo)地位不會受到影響。在十二指腸黏膜中，菌群的物種數(shù)量上也受到Hp定植的影響。從 α 多樣性角度看， A 組 ACE 指數(shù)及 Chao1 指數(shù)均值均比 B 組高，兩組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明Hp感染后增加了十二指腸潰瘍黏膜中定植細(xì)菌的物種總數(shù)。從 β 多樣性分析來看， PCoA 分析圖結(jié)果顯示， A 組和 B 組樣本參雜在一起，沒有明顯的分組聚類情況，說明十二指腸潰瘍菌群結(jié)構(gòu)比較相似。但進(jìn)化譜系中 A 組樣本中有較顯著的微生物群落差異。而 B 組樣本中微生物群落差異很小。說明Hp的定植在一定程度上改變了原有的微生物群落。

十二指腸的優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和梭桿菌門(Fusobacteria)，與 Stearns等[4]的研究結(jié)果一致。擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)是腸道菌群的主要組成部分[8]，說明十二指腸離腸道較為接近，因此會受腸道菌群的影響；且十二指腸球部pH較高，比較適宜其他菌群的生長。 A 組中厚壁菌門(Firmicutes)及 Candidate_division_TM7菌門占的比例顯著比 B 組大(P<0.05)，且細(xì)菌的豐度 A 組也大于 B 組(P<0.05)。已有研究表明，Hp感染患者胃內(nèi)厚壁菌門的含量低于Hp陰性的健康人群[6]。但在本研究中，Hp感染的十二指腸粘膜內(nèi)的厚壁菌門(Firmicutes)卻比非Hp感染引起的十二指腸潰瘍粘膜中含量多，說明當(dāng)發(fā)生Hp感染時，十二指腸粘膜環(huán)境與胃粘膜環(huán)境的菌群變化不一樣。

Candidate_division_TM7菌門普遍存在于世界各地的各種環(huán)境中[9]，以及許多人體部位，包括皮膚[10]、遠(yuǎn)端食道[11]、腸道[12]和口腔[13]中。但很難評估這些生物在健康和疾病中的特性，因?yàn)檫@個細(xì)菌門未被純培養(yǎng)出來，人們對它知之甚少。 Hong等[14]研究發(fā)現(xiàn)，使用 5 -氟尿嘧啶(5-Fu)誘導(dǎo)腸粘膜炎發(fā)生后會降低糞便和/或盲腸內(nèi)容物中變形菌門(Proteobacteria)、Tenericutes、Cyanobacteria 和 Candidate_division_TM7的比例。本研究中，在Hp感染的粘膜中 Candidate_division_TM7的比例較高，在非Hp感染引起的十二指腸潰瘍粘膜中含量較少，說明微生物積極參與了潰瘍形成的過程。Hp感染并定植在十二指腸黏膜之后，破壞了黏膜，其他細(xì)菌在Hp的協(xié)同作用下更容易入侵黏膜，從而導(dǎo)致Hp感染的十二指腸黏膜細(xì)菌數(shù)量比無Hp感染的十二指腸黏膜細(xì)菌物種數(shù)量多。

通過屬水平的優(yōu)勢菌群可以看出，十二指腸潰瘍的黏膜中普雷沃氏菌屬占的比例很高，而普雷沃氏菌屬在動物腸道里通常是優(yōu)勢菌群[15]，進(jìn)一步說明十二指腸黏膜的菌群受腸道菌群的影響。兩組患者都患有十二指腸潰瘍，兩組共同的優(yōu)勢菌屬為普雷沃氏菌屬(Prevotella)和奈瑟菌屬(Neisseria)。普雷沃氏菌屬(Prevotella)是近年來從類桿菌屬中分出的一個新菌屬，包括 20 種，是臨床上較常見的一種條件致病菌[16]，而奈瑟菌屬中也存在致病菌。說明造成十二指腸潰瘍的原因除了Hp感染外可能存在其他的細(xì)菌感染。

同時， A 組中纖毛菌屬(Leptotrichia)占的比例顯著大于B組(P<0.05)。纖毛菌屬(Leptotrichia)通常在口腔和泌尿生殖道中定殖[17]。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為其不致病，但近些年的報(bào)道顯示纖毛菌屬(Leptotrichia)也是一種條件致病菌，與感染相關(guān)[18]。纖毛菌屬(Leptotrichia)的細(xì)胞表面有適合黏附的突出結(jié)構(gòu)，當(dāng)粘膜屏障破裂時，經(jīng)常通過該屏障擴(kuò)散到血流中[17]。在陰性潰瘍患者及健康人[4]中，纖毛菌屬(Leptotrichia)在十二指腸粘膜中含量較低，而在Hp定植的情況下，纖毛菌屬含量增高，推測可能與Hp一起參與了潰瘍的形成。

本研究還存在一定的不足之處，樣本量較小，且十二指腸潰瘍黏膜中的未知菌屬還不能確定。因此需要通過宏基因組測序等方法來鑒定。截至目前，采用基于宏基因組學(xué)策略的高通量測序技術(shù)開展十二指腸黏膜菌群的報(bào)道還比較少，本研究希望能為以后的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

在存在潰瘍的十二指腸黏膜中，Hp感染增加了黏膜內(nèi)的其他物種細(xì)菌的定植，且幽門螺桿菌(Hp)不是唯一優(yōu)勢菌群。同時，Hp的定植對十二指腸粘膜菌群結(jié)構(gòu)有一定的影響，十二指腸粘膜環(huán)境與胃黏膜環(huán)境對Hp感染發(fā)生時菌群變化不一樣。造成十二指腸潰瘍的原因除了Hp感染外可能存在其他細(xì)菌的感染。纖毛菌屬(Leptotrichia)可能與Hp一起參與潰瘍的形成。