水稻絨氈層發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子研究進展

張秋云，沈亞琦，蔣文翔，劉家林，王聯(lián)紅，賀浩華，2，3，胡麗芳，2，3

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點實驗室，南昌 330045；2.江西省超級稻工程技術(shù)研究中心，南昌 330045；3.雙季稻現(xiàn)代化生產(chǎn)協(xié)同中心，南昌 330045）

水稻（Oryza sativaL.）的雄性生殖器官正常發(fā)育對其繁衍具有重要意義［1］。雄性核不育水稻是雜交制種的便捷途徑［2］，雄性生殖器官花藥的最內(nèi)層壁細胞為絨氈層細胞，與小孢子發(fā)育緊密聯(lián)系，是雄性不育的關(guān)鍵因素。絨氈層的正常發(fā)育能保障花粉母細胞減數(shù)分裂周期完成，在其發(fā)育后期可分泌酶降解胼胝質(zhì)釋放小孢子，并為花粉粒的發(fā)育提供營養(yǎng)和所需的脂類物質(zhì)［3］。絨氈層發(fā)育依賴于基因的表達，基因的表達受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，確定轉(zhuǎn)錄因子的功能是了解水稻絨氈層發(fā)育相關(guān)基因表達的重要部分。

水稻絨氈層的發(fā)育過程簡述為分化形成和退化降解兩個部分，這兩個部分受到不同家族轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用。闡明絨氈層分化形成和退化降解的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可為進一步了解水稻雄性不育分子機理提供理論支撐。

1 絨氈層的發(fā)育過程及功能

水稻花藥絨氈層發(fā)育是一個連續(xù)的過程，主要分為2 個階段：①分化形成。在花粉母細胞形成期絨氈層初步形成，經(jīng)由次級壁細胞經(jīng)過兩次平周分裂形成于花藥壁的最內(nèi)層［4］。②退化降解。從花粉母細胞減數(shù)分裂初期至小孢子早期，絨氈層細胞質(zhì)開始濃縮、顏色加深；小孢子中期，絨氈層開始退化降解，在成熟花粉時期最終消失［5］。

絨氈層對花粉母細胞和小孢子發(fā)育的作用主要體現(xiàn)在3 個方面：①在花粉母細胞四分體時期，絨氈層會分泌胼胝質(zhì)降解酶，用以分解四分體之間的胼胝質(zhì)結(jié)構(gòu)，釋放小孢子細胞［6］。②從花粉母細胞時期開始，絨氈層為花粉合成營養(yǎng)物質(zhì)并運至藥室中，從而為花粉母細胞減數(shù)分裂和小孢子發(fā)育提供所需的營養(yǎng)［7］。③小孢子中期，絨氈層開始退化降解，合成花粉壁所需孢粉素等脂類物質(zhì)，并通過特殊結(jié)構(gòu)烏氏體運輸?shù)叫℃咦颖砻妫够ǚ郾诮Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從而保證花粉活力［8］。此外，絨氈層細胞能通過影響減數(shù)分裂基因的表達對小孢子母細胞發(fā)育和成熟發(fā)揮作用［9］。

2 調(diào)控水稻絨氈層發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子

水稻絨氈層的發(fā)育是一個短暫有序的過程，涉及不同的酶、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子［10，11］。轉(zhuǎn)錄因子在生物中廣泛存在，具有保守性，通過特定的DNA 結(jié)合域調(diào)控特定基因的表達，可以產(chǎn)生信號傳導(dǎo)分子，或參與細胞發(fā)育過程調(diào)節(jié)細胞周期［12］。研究發(fā)現(xiàn)影響水稻絨氈層發(fā)育的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子主要為bHLH 轉(zhuǎn)錄因子、PHD-finger 結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，此外還有MADS 轉(zhuǎn)錄因子、bZIP 轉(zhuǎn)錄因子、AGO 家族蛋白質(zhì)等，這些轉(zhuǎn)錄因子的功能可分為調(diào)控絨氈層的分化形成和退化降解兩方面（表1）。

表1 參與水稻絨氈層發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子

2.1 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子

目前分離出的參與水稻絨氈層發(fā)育的bHLH 轉(zhuǎn)錄因子包括UDT1（UNDEVELOPED TAPETUM 1）、TDR（TAPETUM DEGENERATION RETARDATION）、TIP2（TDR INTERACTING PROTEIN 2）和EAT1（ETER?NAL TAPETUM 1）。其中UDT1定位于7 號染色體，全長1 698 bp，包括4 個外顯子和3 個內(nèi)含子，編碼含有227 個氨基酸的蛋白質(zhì)。BLAST 功能域分析表明，在第59~118 個氨基酸區(qū)域，既有形成二聚體所需的HLH 結(jié)構(gòu)域，又具有DNA 結(jié)合所需的堿性結(jié)構(gòu)域，表明該蛋白為bHLH 轉(zhuǎn)錄因子。UDT1基因突變得到不育突變植株udt1，表現(xiàn)花藥白色且無可育花粉，氈層細胞持續(xù)空泡化，降解延遲。該基因在絨氈層細胞早期階段具有很高的轉(zhuǎn)錄活性。芯片分析表明，突變體udt1在絨氈層發(fā)育早期大多數(shù)Aps（天冬氨酸蛋白酶）和絲氨酸蛋白酶基因下調(diào)并優(yōu)先表達，而Cys（半胱氨酸蛋白酶）基因上調(diào)并優(yōu)先表達，表明UDT1是水稻絨氈層早期發(fā)育的關(guān)鍵基因，主要參與次生壁細胞向成熟絨氈層的分化［13］。

TDR位于2 號染色體，全長3 223 bp，包含7 個內(nèi)顯子和8 個外顯子，編碼一個由552 個氨基酸組成的bHLH 蛋白質(zhì)，bHLH 結(jié)構(gòu)域位于第280~341 個氨基酸之間。TDR 蛋白與擬南芥AMS 蛋白最為相似，但與UDT1編碼的全長蛋白序列僅有12% 的同源性［14］。tdr突變體絨氈層細胞質(zhì)染色不加深，不濃縮，缺乏變性的超微結(jié)構(gòu)特征。TUNEL 試驗和彗星試驗表明，絨氈層PCD（程序性死亡）信號微弱，說明其未能降解。Affymetrix 水稻芯片對在減數(shù)分裂即小孢子發(fā)育階段的野生型和tdr突變體花藥進行轉(zhuǎn)錄分析時，發(fā)現(xiàn)2 個目標基因OsCP1和Osc6分別編碼半胱氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶抑制劑，而半胱氨酸蛋白酶與細胞的凋亡密切相關(guān)，表明TDR與水稻花藥絨氈層的PCD 過程密切相關(guān)［15］。

TIP2位于1 號染色體，全長2 112 bp，包含3 個內(nèi)含子和3 個外顯子，由于其編碼的產(chǎn)物與TDR相互作用而命名。TIP2編碼的轉(zhuǎn)錄因子包含一個保守的bHLH 結(jié)構(gòu)域和一個未知的功能域，與EAT1 蛋白的序列具有高度相似性。對tip2突變體花藥橫切面觀察，發(fā)現(xiàn)花藥壁內(nèi)三層細胞形態(tài)無明顯差異，無法區(qū)分絨氈層細胞，細胞數(shù)量分析發(fā)現(xiàn)絨氈層的平均細胞數(shù)較野生型顯著增加［14］。共表達TIP2和TDR的酵母菌株在缺乏His 和Ade 的特定培養(yǎng)基上正常生長，顯示LacZ報告基因表達激活，證實了TIP2和TDR之間相互作用。研究表明TIP2與TDR互作共同參與調(diào)控花藥發(fā)育后期絨氈層PCD 過程［16］。

EAT1位于4 號染色體上，全長3 063 bp，包含3個內(nèi)含子和4 個外顯子，EAT1編碼含有一個bHLH結(jié)構(gòu)域和一個DUF 基序的轉(zhuǎn)錄因子。對eat1-1突變體進行花藥橫切面觀察，發(fā)現(xiàn)絨氈層異常，烏氏體呈不規(guī)則的圓形，并被一層管狀結(jié)構(gòu)所覆蓋，花藥發(fā)育和小孢子形成被終止。 qRT-PCR 檢測突變體eat1-1，發(fā)現(xiàn)GAMYB、UDT1、TDR和PTC1等基因在eat1-1花藥中沒有明顯變化，酵母雙雜交分析表明EAT1與TDR相互作用。EAT1在分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)上位于TDR的下游，可直接調(diào)控AP25和AP37編碼APs來調(diào)控水稻絨氈層的PCD 過程［17］。

2.2 PHD-finger 結(jié)構(gòu)域蛋白

目前分離出的參與水稻絨氈層發(fā)育的PHDfinger 結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)包括PTC1（PERSISTENT TAPE?TAL CELL1）和TIP3（TDR INTERACTING PROTEIN 3）。TIP3是最新發(fā)現(xiàn)的與水稻TDR 蛋白相互作用的基因，位于3 號染色體上，全長2 094 bp，包含3 個外顯子和2 個內(nèi)含子，編碼698 個氨基酸構(gòu)成的PHD-finger 蛋白質(zhì)。TIP3敲除突變體植株表現(xiàn)出完全不育，與野生型對比，tip3突變體絨氈層細胞PCD 延遲，盡管小孢子母細胞釋放出小孢子，但其細胞質(zhì)凌亂且密布小液泡。突變體tip3從第8 時期開始在絨氈層中幾乎沒有TUNEL 信號，再次表明絨氈層PCD 延遲，說明TIP3也參與調(diào)控水稻絨氈層的PCD 過程［18］。

PTC1定位在9 號染色體上，包含一個2 040 bp的編碼區(qū)，其中有3 個外顯子和2 個內(nèi)含子，分別在N 未端和C 末端預(yù)測一個核定位信號和一個保守的PHD 結(jié)構(gòu)域。突變體ptc1表現(xiàn)為雄性不育，透射電鏡分析其花藥結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)其絨氈層的膜和細胞器持續(xù)保持完整，沒有破裂和凋亡的跡象，且絨氈層廣泛增生向花藥室擠壓且烏氏體相對減少。對野生型和ptc1 突變體進行轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)，175 個與脂質(zhì)運輸和代謝以及次生代謝物生物的合成、運輸和分解代謝有關(guān)的基因在突變體ptc1中表達量產(chǎn)生差異［19］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，PTC1與TIP3在水稻中不是功能冗余基因，能通過另外的途徑調(diào)控水稻絨氈層的退化降解［20］。

2.3 MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子

目前分離出的參與水稻絨氈層發(fā)育相關(guān)的MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子包括OsMADS3 和OsMADS8。OsMADS3位于1號染色體，為水稻C類器官識別蛋白質(zhì)，在花藥發(fā)育早期被證明是雄蕊發(fā)育的必需基因。在雄蕊原基中，當外稃和內(nèi)稃原基啟動時，OsMADS3的表達開始被檢測到，在第9~12 時期OsMADS3在絨氈層和小孢子中再次表達。突變體mads3-4絨氈層細胞沒有凝聚且染色較淺，之后絨氈層細胞增大并雜亂無序，且降解延遲［21］。結(jié)果表明，OsMADS3早期參與了花藥原基的分化并間接參與絨氈層形成，后期也在絨氈層退化中表達調(diào)控［22］。

OsMADS8位于9 號染色體，全長6 377 bp，為水稻E 類器官識別蛋白質(zhì)。為分析OsMADS8的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建了OsMADS8基因敲除轉(zhuǎn)基因株系，收集轉(zhuǎn)基因植株0.5~2.0 cm 的圓錐花序用于基因芯片分析。利用水稻芯片技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)OsMADS8的一個靶向基因OsTGA10，該基因位于9 號染色體上，全長9 095 bp，包含9 個內(nèi)含子和10 個外顯子，被注釋為bZIP 轉(zhuǎn)錄因子。靶向區(qū)域分析表明，OsMADS8直接通過蛋白-DNA 結(jié)合方式靶向OsTGA10。對突變體ostga10花藥切片觀察，發(fā)現(xiàn)突變體的絨氈層細胞降解異常，其細胞質(zhì)不濃縮，細胞核較大，降解延遲［23］。表明OsMADS8不僅調(diào)控水稻花分生組織形成雄蕊且抑制小穗分生組織的逆轉(zhuǎn)，還通過調(diào)控OsTGA10，參與水稻絨氈層的PCD 過程［24］。

2.4 其他轉(zhuǎn)錄因子

目前分離出的參與水稻絨氈層發(fā)育相關(guān)的其他轉(zhuǎn)錄因子還包括OsAGO2、DTC1和OsGAMYB。OsAGO2位于4號染色體，全長3 063 bp，編碼包含典型AGO蛋白的PAZ 和PIWI 結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。OsAGO2的敲除導(dǎo)致花藥發(fā)育缺陷從而花粉不育，絨氈層都出現(xiàn)細胞質(zhì)疏松和空泡化，絨氈層提前出現(xiàn)降解，后期絨氈層細胞持續(xù)空泡化［25］。表明OsAGO2主要參與調(diào)控花藥后期絨氈層降解。

DTC1（DEFECTIVE TAPETUM CELL DEATH 1）位于7 號染色體，全長為3 163 bp，包含6 個內(nèi)含子和6 個外顯子，編碼一種含有DCD 結(jié)構(gòu)域和KELCH重復(fù)序列的蛋白質(zhì)。dtc1突變體的絨氈層沒有降解，而是保持原有形狀，但小孢子降解消失。qRTPCR 分析dtc1突變體的基因表達差異，發(fā)現(xiàn)UDT1、TDR和EAT1的表達水平?jīng)]有明顯變化，而OsCP1、AP25、AP37和Osc6的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，這些基因在tdr、eat1和eat1突變體中也表達下調(diào)。DTC1 的啟動子區(qū)域包含一個bHLH 轉(zhuǎn)錄因子的假定靶序列，說明DTC1可能作用于UDT1、TDR和EAT1的下游。雙分子熒光互補試驗得出DTC1 蛋白質(zhì)與OsMT2b和OsMT-I-4b 相互作用，表明DTC1是調(diào)控花藥后期絨氈層降解的重要基因［26］。

OsGAMYB位于1 號染色體，全長4 325 bp，編碼的OsGAMYB 蛋白質(zhì)包含4 個結(jié)構(gòu)域：MYB 結(jié)構(gòu)域和其他3 個保守域，是水稻絨氈層發(fā)育中一個GA 相關(guān)的MYB基因。OsGAMYB在花序頂部區(qū)域表達，在雄蕊原基和花藥絨氈層細胞高表達，在營養(yǎng)生長器官表達較低［27］。突變體gamyb的花藥絨氈層發(fā)育異常，小孢子母細胞皺縮不緊挨絨氈層，隨后絨氈層細胞膨脹延伸到內(nèi)室，導(dǎo)致雄性不育。OsGAMYB與UDT1平行作用于絨氈層發(fā)育，影響了水稻絨氈層的退化降解［28］。

3 水稻絨氈層發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

bHLH 蛋白質(zhì)是調(diào)控絨氈層發(fā)育過程的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。UDT1 優(yōu)先表達于絨氈層早期發(fā)育階段，調(diào)控編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因除bHLH 基因外，還包含MYB 和WRKY 轉(zhuǎn)錄因子。UDT1 啟動子包含Ebox 元件，這些元件是bHLH-MYB 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中已知的結(jié)合位點，表明UDT1 與OsGAMYB 平行調(diào)控水稻的早期發(fā)育［29，30］。MSP1（MULTIPLE SPORO?CYTE 1）和MIL2（MICROSPORELESS2）調(diào)節(jié)3 個花藥內(nèi)壁層的產(chǎn)生和分化，突變會導(dǎo)致絨氈層消失［31，32］。TIP2、TDR 和EAT1緊密聯(lián)系，主要調(diào)控絨氈層降解，基因表達較晚，可能在UDT1、MSP1和MIL2的下游起作用。TIP2位于TDR和EAT1的上游，在絨氈層分化形成初期表達，促進絨氈層分化。在絨氈層細胞分化形成后期，TIP2 通過激活下游轉(zhuǎn)錄因子TDR編碼蛋白質(zhì)，并與TDR 形成復(fù)合蛋白質(zhì)繼續(xù)促進絨氈層細胞的發(fā)育。在四分體時期，TIP2調(diào)控第三個bHLH 轉(zhuǎn)錄因子EAT1的表達，同時EAT1 蛋白與TDR 蛋白形成新的復(fù)合體，調(diào)節(jié)絨氈層程序性死亡過程（圖1）。TDR直接調(diào)控花藥發(fā)育相關(guān)基因OsADF、Osc6和OsCP1的表達水平。OsADF 是F-box 蛋白質(zhì)，在細胞周期進程、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、程序性細胞死亡和細胞信號等許多生理活動中起關(guān)鍵作用［33］。TDR 可能通過觸發(fā)ADF 介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解通路調(diào)節(jié)絨氈層細胞發(fā)育和花粉形成［34］。Osc6和OsCP1與水稻花藥發(fā)育所需的脂質(zhì)（LTPs）有關(guān)，OsCP1編碼一種半胱氨酸（Cys）蛋白酶，屬于廣泛分布于動植物和微生物中的一個酶家族，在降解細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和促進PCD 方面發(fā)揮著重要作用［35］。OsC6編碼具有脂質(zhì)結(jié)合活性的特定脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)（LTP），是絨氈層特定結(jié)構(gòu)烏氏體和花粉外壁發(fā)育所必需的［36］。 EAT1 通過激活A(yù)P25和AP37（兩者都是天冬氨酸蛋白酶）的轉(zhuǎn)錄，激活下游蛋白酶表達從而調(diào)控絨氈層細胞死亡［37］。

圖1 絨氈層的發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

OsGAMYB、UDT1、TDR、CYP703A3［38］作用于PTC1的上游，而PTC1調(diào)控Cys 蛋白酶和質(zhì)膜ATP酶的表達，質(zhì)膜ATP 酶是調(diào)節(jié)細胞凋亡和壞死之間轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵蛋白質(zhì)［39］。TIP3、PTC1和擬南芥中的PHD-finger 蛋白影響雄配子減數(shù)分裂的機制不同［40，41］，TIP3、PTC1與TDR互作，直接或者間接地激活下游特定靶基因進而調(diào)控絨氈層的降解和花粉壁的形成。

OsMADS3和OsMADS8同是花器官識別蛋白質(zhì)，調(diào)控早期絨氈層的分化［42］，同時又參與絨氈層的退化降解。OsMADS3與MT-1-4b的啟動子有關(guān)，降低MT-1-4b的表達會導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株超氧陰離子水平升高，影響花粉育性［43］。OsTGA10為MADS-box蛋白質(zhì)OsMADS8的靶點，OsMADS8蛋白與其第二個內(nèi)含子結(jié)合，從而調(diào)控OsTGA10表達。MTR1編碼一種分泌性成束蛋白糖蛋白，對水稻的雄性生殖發(fā)育起重要作用［44］。OsTGA10蛋白與AP25和MTR1啟動子中的TGACG 單元結(jié)合，抑制了2個基因的啟動子活性，TIP2的存在能增強OsTGA10蛋白的抑制作用。

OsAGO2在轉(zhuǎn)錄因子基因TIP2、TDR、EAT1/DTD和OsTGA10上游發(fā)揮作用。 OsAGO2 蛋白與Os?HXK1啟動子結(jié)合并通過DNA 甲基化直接調(diào)控其表達。OsHXK1 是己糖激酶，這是一種雙功能酶，它既能將己糖磷酸化，形成6-磷酸己糖，又能在糖傳感和信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用［45］。OsHXK1 的表達會影響絨氈層活性氧（ROS）的積累，從而調(diào)控絨氈層PCD 和花粉的正常發(fā)育。

DTC1在轉(zhuǎn)錄因子基因UDT1、TDR、EAT1下游和分泌蛋白基因OsMT2b上游發(fā)揮作用。OsMT2b編碼一種分子量小、富含半胱氨酸的小分子金屬結(jié)合蛋白質(zhì)，在植物抗病信號傳導(dǎo)通路中的活性氧產(chǎn)生和細胞死亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用［46］。DTC1通過降低花藥發(fā)育后期ROS 清除蛋白OsMT2b 的表達量和活性，提高ROS 的含量，從而促進絨氈層的降解。

4 展望

水稻絨氈層的分化形成和退化降解是一個復(fù)雜的過程，對花粉粒的育性有著重要作用，目前已發(fā)現(xiàn)多種與水稻絨氈層發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。bHLH 蛋白質(zhì)是花藥絨氈層細胞分化、形態(tài)建成和降解過程的核心調(diào)控因子，可調(diào)節(jié)PHD-finger 蛋白質(zhì)的表達。MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子是同時協(xié)助水稻絨氈層形成及降解的重要轉(zhuǎn)錄因子。絨氈層細胞降解是小孢子發(fā)育的重要保障，活性氧（ROS）的積累是導(dǎo)致絨氈層細胞PCD 的關(guān)鍵。DTC1和OsMADS3直接或間接調(diào)控ROS 清除蛋白OsMT-1-4b 和OsMT2b 的表達量和活性，從而提高ROS 的含量，進一步促進絨氈層的降解，影響花粉的形成。此外脂肪代謝物是花粉外壁的重要成分，PTC1和EAT1分別影響半胱氨酸蛋白酶和蛋白酶抑制因子的表達，調(diào)控花粉壁的脂肪家族代謝，從而影響花粉育性。

應(yīng)用正向及反向遺傳學(xué)是了解水稻絨氈層發(fā)育相關(guān)基因的有效方法，花粉不育為相關(guān)突變體的產(chǎn)生和發(fā)現(xiàn)提供了良好的試驗材料，為研究水稻花粉發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了便利。轉(zhuǎn)錄因子之間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主要通過突變體引起的表達量變化來判斷其上下游關(guān)系。然而人類目前對許多水稻絨氈層發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子功能的了解還不深入，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)依舊模糊。近年來，水稻花粉發(fā)育特定階段以及特定組織的基因表達譜分析工作和激光微切割技術(shù)的發(fā)展為水稻花粉發(fā)育的分子機理研究奠定了良好的基礎(chǔ)，同時高通量測序及代謝組分析方法的充分利用，使得對水稻絨氈層發(fā)育的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究更加深入，相信更多未知的控制水稻生殖發(fā)育的分子機制將逐漸被人們所解析。