黃芩苷對LPS致流產(chǎn)小鼠的子宮局部免疫調(diào)節(jié)機制研究*

馬雁南 ，楊小頎

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽 712046；2.寶雞市第二中醫(yī)醫(yī)院婦產(chǎn)科，寶雞 721300；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖科，咸陽 712046）

妊娠是一個既復(fù)雜又協(xié)調(diào)的生理過程，當其中任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生異常，都將導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。臨床上，對妊娠28周內(nèi)，胎兒體重不足1 000 g而終止者稱之為“流產(chǎn)”[1]，中醫(yī)則稱之為“胎漏、胎動不安”[2]。據(jù)統(tǒng)計，約31%的胚胎著床后發(fā)生流產(chǎn)[1]，這一病理現(xiàn)象的發(fā)生正呈現(xiàn)逐年上升趨勢，已嚴重影響育齡女性的身心健康[3]。

胚胎遺傳并在發(fā)育全過程中攜帶一半父系抗原，其作為異己抗原，不僅在妊娠過程中未遭到母體子宮明顯的免疫排斥，相反卻與其和平相處，足以證明母體子宮通過一定的免疫調(diào)節(jié)行為促成免疫耐受機制，促使妊娠過程安全有序進行，而一旦這種穩(wěn)定的免疫機制失調(diào)，勢必將導(dǎo)致流產(chǎn)等現(xiàn)象發(fā)生，正如Duclos[4-5]等研究證實，細菌脂多糖（LPS）可在子宮局部產(chǎn)生大量腫瘤壞死因子-α（TNF-α），致使胚胎丟失，亦即發(fā)生流產(chǎn)行為。

近年來隨著生殖免疫研究的精準化深入，諸多研究發(fā)現(xiàn)妊娠免疫耐受的形成與子宮局部的細胞因子密切相關(guān)，其中最為經(jīng)典的是Th1/Th2細胞因子的平衡模式，Th1和Th2型細胞均由Th0分化而來，Th1型細胞分泌的細胞因子主要包含IFN-γ、TNF-α、IL-2等，可對胚胎造成免疫損傷，而Th2型細胞分泌的細胞因子則主要包含IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等，對胚胎則起免疫保護作用，正常妊娠時，母胎界面以Th2型反應(yīng)占優(yōu)勢[6-9]，也就是母體子宮分化發(fā)育產(chǎn)生的Th2型免疫細胞分泌相細胞因子諸如：IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 等應(yīng)在子宮與胚胎間建立免疫耐受過程中發(fā)揮強勢作用[6-7]。因此，如若在胚胎發(fā)育期，人為干預(yù)增強子宮局部Th2型免疫細胞或減弱Th1型免疫細胞作用，將會促使免疫耐受，并對胚胎發(fā)育產(chǎn)生積極影響，起到“安胎”的積極作用。

黃芩初載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性涼味苦，具有清熱安胎的作用[8-9]。中藥安胎歷史悠久，黃芩亦在諸多安胎方劑中出現(xiàn)并沿用至今，其主要成分之一黃芩苷的安胎效果已被臨床實踐所證實[10-12]，但其是否是在母胎界面局部免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，且其相關(guān)作用機制卻鮮未報導(dǎo)。

本實驗選用LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)小鼠模型，在黃芩苷干預(yù)下經(jīng)ELISA測試方法檢測其子宮組織中TNF-α、IL-10的含量變化情況，旨在研究黃芩苷是如何通過調(diào)節(jié)子宮局部母-胎界面免疫狀態(tài)來發(fā)揮安胎作用，從免疫學(xué)角度來探討黃芩苷的安胎機制，為中醫(yī)學(xué)中黃芩“清熱安胎”理論提供確鑿科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及藥品 細菌脂多糖（Lipopolysaccharide from E coli.O111B4），Sigma 公司產(chǎn)品 ； 黃 芩 苷（Baicalin），購于博奧生物醫(yī)藥科技有限公司；小鼠TNF-α、IL-10ELISA測試盒,BioSource產(chǎn)品；蛋白酶抑制劑（Aprotinin），Biosharp產(chǎn)品。

1.2 試驗動物 6～8周齡SPF級昆明雌鼠，體質(zhì)量20～22 g（購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心），經(jīng)常規(guī)飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境1周后,陰道涂片法挑選出處于動情期雌鼠，與雄鼠2∶1合籠交配，次晨檢出陰栓者，記為孕0 d。

1.3 動物分組及處理 受孕小鼠隨機分為空白組（A組）、LPS處理組（B組）、LPS及黃芩苷處理組（C組）、黃芩苷處理組（D組）(見表1)，各組樣本數(shù)量均為10只。B、C組孕鼠分別于孕7 d給予尾靜脈注射LPS 0.1 μg（0.2 mL）制作流產(chǎn)模型，A、D 組孕 7 d 尾靜脈注射PBS 0.2 mL。LPS處理組自孕4 d開始連續(xù)灌胃（磷酸鹽緩沖液 0.4 mL/d），共 4 d；C、D 組自孕4 d開始連續(xù)灌胃[黃芩苷液0.4 mL/（1 mg·d）]，共4 d（見表1）。孕9 d后采用頸椎脫臼法處死所有孕鼠。

1.4 胚胎吸收率和流產(chǎn)率計算 孕9 d處死孕鼠后打開腹腔，充分暴露子宮，觀察子宮生長情況，記錄胚胎著床數(shù)目和胚胎吸收數(shù)目。

發(fā)育正常的胚胎形狀似串珠，色澤光鮮，大小均一，胚胎的中間部位可見紅色條索狀胎盤。而發(fā)育異常子宮呈黑紫或褐色，內(nèi)可見陳舊性出血或伴血凝塊，體積明顯變小，部分胚胎萎縮或消失。解剖鏡下觀察，模糊一片無正常胚胎結(jié)構(gòu)。

胚胎吸收率及流產(chǎn)率的計算公式：

胚胎吸收率=吸收胚胎數(shù)/（吸收胚胎數(shù)+存活胚胎數(shù)）×100%

流產(chǎn)率=流產(chǎn)母鼠數(shù)/試驗組母鼠總數(shù)×100%

1.5 試驗取樣 在冰盒上完整取出各組子宮，除去系膜及脂肪組織后稱重?？v向剖開子宮，完整剝離胚胎后，剪下右側(cè)子宮角稱量凈重，加入pH=7.4磷酸鹽緩沖液（內(nèi)含6倍量0.75μg/mg的蛋白酶抑制劑），立即在低溫環(huán)境中（4℃）進行勻漿，12 000 r/min離心15 min后取上清液分裝，-80℃凍存，用于ELSIA測定TNF-α、IL-10的含量。左側(cè)子宮剪除后，用眼科剪分離蛻膜組織，剪成1 cm×1 cm大小，鋪平放入組織盒，置于70%乙醇中固定，用于HE染色。

1.6 ELISA測定子宮組織中的TNF-α、IL-10的含量 遵照試劑盒說明書操作，反應(yīng)終止后，在酶標儀450 nm波長處讀取吸光度（OD）值，利用標準曲線計算TNF-α、IL-10的含量。

1.7 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)使用Excel 2000和SPSS 18.0軟件包進行統(tǒng)計，卡方檢驗分析組間差異顯著性。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，P＜0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 流產(chǎn)率、胚胎吸收率比較 空白組10只孕鼠中2只發(fā)生流產(chǎn)，流產(chǎn)率為20%，其總計86枚胚胎中83枚為正常胚胎，且胚胎組織新鮮，少見出血、壞死，胚胎吸收率分別為3.4%。LPS處理組中10只孕鼠均發(fā)生流產(chǎn)，子宮內(nèi)無存活胚胎，部分胚胎已經(jīng)溶化，流產(chǎn)率及胚胎吸收率均為100%，與空白組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。C組的流產(chǎn)率20%及胚胎吸收率為3.3%，近似空白組，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但與LPS處理組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。D組流產(chǎn)率及胚胎吸收率均為0，與空白組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各處理組妊娠結(jié)果

表1中A、B兩組實驗數(shù)據(jù)對比差異顯著（P＜0.01），說明LPS具有明顯致流產(chǎn)的作用；B、C組對比差異顯著（P＜0.01），說明黃芩苷能夠有效干預(yù)LPS導(dǎo)致的妊娠小鼠產(chǎn)生流產(chǎn)行為；A、D組對比有差異，（P＜0.05），說明黃芩苷在妊娠過程中起到積極促進作用，具有安胎功效。

2.2 子宮組織中免疫因子含量比較分析

2.2.1 TNF-α含量對比 LPS處理組子宮組織中TNF-α含量最高，與A、C組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；C組子宮組織中TNF-α在黃芩苷干預(yù)下含量無明顯升高，與空白組數(shù)值接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；D組子宮組織中TNF-α含量最低，與空白組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 子宮組織中TNF-α、IL-10的含量

2.2.2 IL-10含量對比 LPS處理組子宮組織中IL-10含量明顯減少，低于空白組，與A、C組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；C組子宮組織中在黃芩苷干預(yù)下IL-10的含量升高明顯，與LPS處理組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；D組中IL-10的含量最高，與空白組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2.3 TNF-α/IL-10比值對比 通過表2中四組數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，LPS處理組TNF-α/IL-10比值最大（為1.673±0.034），與A、C、D組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；C、D 組的 TNF-α/IL-10比值均低于空白組，其中D組最低（為0.115±0.045 4），均與空白組相比有差異。

2.3 子宮蛻膜組織的變化 HE染色結(jié)果如圖?？瞻捉M子宮腺體清晰可見，子宮蛻膜細胞排列整齊，大小均勻，數(shù)量正常。LPS處理組顯示蛻膜細胞碎裂，數(shù)量明顯減少，大量炎細胞浸潤，局部難以見子宮腺體。C組顯示蛻膜細胞數(shù)量增多，核增大，子宮腺體可見。D組顯示蛻膜細胞明顯增多，排列整齊，核增大，腺體清晰可見。

2.4 實驗結(jié)論 本實驗中，在黃芩苷的干預(yù)下，不論是C組，還是D組，在流產(chǎn)率、胚胎吸收率方面對照LPS處理組、空白組，均顯著降低且具有統(tǒng)計學(xué)意義，充分證明黃芩苷具有確切的安胎作用；同時，在子宮局部免疫調(diào)節(jié)因子含量方面，受黃芩苷干預(yù)作用，代表Th1型細胞途徑之一的TNF-α因子含量顯著降低，代表Th2型細胞途徑之一的IL-10含量顯著升高，使得子宮局部免疫耐受機制偏向Th2占優(yōu)勢趨勢方向發(fā)展。這也充分證明黃芩苷既可上調(diào)Th2細胞作用，釋放大量IL-10，促進子宮局部建立免疫耐受機制，降低流產(chǎn)率和胚胎吸收率，又可抑制Th1細胞，使得巨噬細胞分泌的TNF-α因子顯著減少，降低了子宮對胚胎的細胞免疫效應(yīng)，降低流產(chǎn)率和胚胎吸收率，綜合作用的結(jié)果使母胎微環(huán)境向著Th2占優(yōu)勢的平衡轉(zhuǎn)變，具有良好的安胎效果。

圖1 各組子宮蛻膜組織HE染色結(jié)果

3 討論

何麗君[13]等認為，TNF-α因子在機體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮雙重調(diào)節(jié)作用，即適量的TNF-α可調(diào)節(jié)機體的免疫及代謝功能,對維持穩(wěn)定狀態(tài)和抵制各種疾病因子具有重要意義,而過量的TNF-α卻可導(dǎo)致多種病理改變[14]。通過本實驗可發(fā)現(xiàn)，空白組（A）條件下，子宮局部存在適量的TNF-α因子，維持子宮局部正常的免疫調(diào)節(jié)。而細菌脂多糖LPS處理組（B）小鼠發(fā)生流產(chǎn)現(xiàn)象，正是由于LPS誘導(dǎo)活化Th1型細胞，釋放大量的IFN-γ，刺激子宮局部分泌過量巨噬細胞，而導(dǎo)致過多的巨噬細胞分泌產(chǎn)生過量TNF-α因子，進而誘導(dǎo)有害物質(zhì)產(chǎn)生，對子宮局部和胚胎造成放大免疫反應(yīng)的影響，導(dǎo)致胚胎丟失。付錦華[15]等認為，胚胎進入子宮后，母胎之間適應(yīng)性與相容性受到IL-10的作用，即由Th2型細胞分泌產(chǎn)生IL-10因子在母胎界面免疫調(diào)節(jié)中促進免疫耐受機制發(fā)生，使母胎相互相容、適應(yīng)。本實驗中，在LPS處理（B）干預(yù)下，母胎界面免疫平衡被打破，Th1型途徑占優(yōu)勢，抑制了Th2途徑，使得IL-10因子明顯減少，導(dǎo)致流產(chǎn)率、胚胎吸收率明顯升高，這也從另一方面證實IL-10因子在主導(dǎo)Th2型細胞途徑安胎機制中發(fā)揮重要作用。近年來，諸多學(xué)者在生殖免疫領(lǐng)域研究發(fā)現(xiàn)，黃芩及其有效成分能夠明顯調(diào)節(jié)機體的免疫功能狀態(tài)，尤其在妊娠期子宮局部發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究不僅證明黃芩苷在小鼠子宮局部免疫調(diào)節(jié)中，可通過促進Th2型途徑發(fā)揮良好安胎作用，同時在抑制Th1型免疫細胞產(chǎn)生TNF-α因子，避免胚胎丟失方面亦發(fā)揮作用，可謂黃芩苷在子宮局部免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮雙重機制作用，卻殊途同歸于安胎。