基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測四妙勇安湯干預(yù)心力衰竭的作用機制研究*

任瑩璐，張惠敏，柳金英，蘇聰平，王 青，王 偉，郭淑貞

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029）

四妙勇安湯是中醫(yī)學(xué)中主要治療熱毒型脫疽的一代良方，具有清熱解毒，活血通絡(luò)，瀉火養(yǎng)陰的功效[1]。清代著名醫(yī)家鮑相墩將其收載于《驗方新編·卷二》中，金銀花重用為君藥，其甘寒入心，善于清熱解毒；玄參清熱涼血，瀉火解毒為臣藥；當(dāng)歸活血祛瘀止痛為佐藥，甘草加強金銀花清熱解毒之力，調(diào)和諸藥為使。近代有關(guān)四妙勇安湯在心血管中的應(yīng)用報道日漸增多，四妙勇安湯也逐漸運用到抗動脈粥樣硬化、急性心肌梗死，心絞痛等疾病當(dāng)中[2-6]。

慢性心力衰竭指由任何初始心肌損傷引起心臟結(jié)構(gòu)或功能變化,導(dǎo)致心室泵血和（或）充盈功能低下的一種復(fù)雜的臨床綜合征,是一種臨床常見病，是眾多心血管疾病的最終歸宿。臨床中，周凌云等[5]觀察加味四妙勇安湯對氣滯血瘀型慢性心力衰竭患者的臨床療效，得出結(jié)論：四妙勇安湯加味對氣滯血瘀型慢性心力衰竭臨床療效顯著。由于中藥復(fù)方化學(xué)成分的復(fù)雜性和功能主治的多樣性,使得四妙勇安湯干預(yù)心力衰竭的作用機制并不明確,因此借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法挖掘四妙勇安湯主要活性成分的作用靶點與其疾病間的關(guān)聯(lián)性,對于從系統(tǒng)生物學(xué)角度整體闡釋四妙勇安湯干預(yù)心力衰竭的作用機制具有重要意義[7]。

1 材料與方法

1.1 靶點及其對應(yīng)有效成分的預(yù)測 挖掘BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中四妙勇安湯中干預(yù)心力衰竭的潛在靶點,并登陸B(tài)ATMAN-TCM服務(wù)器(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm),分別上傳四妙勇安湯主要靶點，得到各個靶點對應(yīng)的有效成分篩選結(jié)果,將兩部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行整合[8]。BATMAN-TCM系統(tǒng)可以分析疾病靶點富集度的顯著性水平并對有效成分與目標(biāo)靶點相關(guān)性進(jìn)行評分（score）。通過統(tǒng)計分析,選擇合適的計算方法計算預(yù)測傳統(tǒng)中藥治療疾病的顯著性P值。最終選擇有統(tǒng)計學(xué)意義的四妙勇安湯治療疾病。以P＜0.05作為“藥物-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的基準(zhǔn)。以score cut off=20為篩選線，導(dǎo)出四妙勇安湯治療心衰的顯著性分析，及所對應(yīng)的靶點和有效成分。

1.2 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 根據(jù)上述預(yù)測結(jié)果,使用Cytoscape軟件中的關(guān)聯(lián)功能（Merge）將篩選出的活性成分、潛在靶點以及與靶點對應(yīng)的疾病信息構(gòu)建一個藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。在生成的網(wǎng)絡(luò)中,節(jié)點代表化合物、蛋白質(zhì)或疾病，邊代表化合物-靶點以及靶點-疾病相互作用。

1.3 金銀花與玄參靶點分析 四妙勇安湯重用金銀花、玄參各90 g，使用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫，分析金銀花、玄參治療心力衰竭的靶點。利用韋恩圖（Venn diagram）進(jìn)一步研究金銀花與玄參治療心衰機制的共同點與不同點。

2 結(jié)果

2.1 四妙勇安湯干預(yù)心衰的靶點篩選 檢索BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，四妙勇安湯治療心力衰竭的靶點共15個，如表1所示為四妙勇安湯治療心力衰竭對應(yīng)靶點，與心力衰竭經(jīng)典通路基本吻合（P＜0.05）。

表1 四妙勇安湯治療心力衰竭對應(yīng)靶點（score cut off=20）

2.2 四妙勇安湯的活性成分篩選 通過BATMANTCM數(shù)據(jù)庫中整理出四妙勇安湯中共307個化合物，手動篩選四妙勇安湯干預(yù)心衰的靶點對應(yīng)的成分共89個。如表2所示，其中若一個靶點對應(yīng)超過3個靶成分下表只則列出前3個成分，其中主要涉及了生物堿、木質(zhì)素、皂苷、萜類等（P＜0.05）。

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 使用Cytoscape軟件構(gòu)建在心力衰竭方向四妙勇安湯活性成分-作用靶點的網(wǎng)絡(luò)模型,如圖1所示。從圖中可以看出,89個活性成分的15個潛在靶點對比到心力衰竭上，且不同的活性成分可作用于相同的靶點，也可作用于不同的靶點，充分體現(xiàn)了四妙勇安湯多成分、多靶點的作用機制。

表2 四妙勇安湯治療心力衰竭靶點對應(yīng)成分（score cut off=20）

2.4 金銀花與玄參靶點分析 利用韋恩圖（Venny 2.1）進(jìn)一步研究四妙勇安湯中的金銀花與玄參治療心衰機制的關(guān)系。結(jié)果顯示，金銀花與玄參共有的心衰靶點數(shù)量為3，分別占兩種藥物總的靶點數(shù)的30%；金銀花獨有的靶點數(shù)為6，占總數(shù)的60%；玄參獨有的靶點數(shù)為1，占總數(shù)的10%。

圖1 四妙勇安湯治療心力衰竭的靶點-成分網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

圖2 金銀花與玄參共有及特有的治療心力衰竭靶點分析圖

3 討論

目前中藥類研究主要采取傳統(tǒng)的提取分離法，分離其有效部位及有效成分，通過在體或離體等方式進(jìn)行活性檢測，統(tǒng)一篩選治療某一疾病的有效成分群，組合活性部位進(jìn)行中藥新藥再開發(fā)[9]。這些方法雖然已取得一些成效，但因為耗時耗力，進(jìn)展緩慢，而且中藥多成分多靶點的特點導(dǎo)致其成分-疾病-靶點的對應(yīng)性不高，所以這種傳統(tǒng)方法不能完全代表中藥的功效[10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中醫(yī)藥學(xué)的結(jié)合研究，在中藥中已知的化學(xué)成分，疾病中已知靶點的基礎(chǔ)上，充分利用已有的研究成果，用在線構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)的方法研究中藥中化學(xué)成分的多靶標(biāo)、多途徑協(xié)同作用，并用網(wǎng)絡(luò)的形式直觀呈現(xiàn)這種復(fù)雜作用，這種研究方法可以大大的輔助中藥新藥的二次開發(fā)[11]。

本文以四妙勇安湯為例，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法考察四妙勇安湯治療疾病的分布情況，并將其與相關(guān)靶點進(jìn)行對接，根據(jù)疾病與靶點相關(guān)性推測四妙勇安湯治療上心力衰竭可能的機制，并進(jìn)一步篩選了四妙勇安湯中金銀花、玄參治療心衰的靶點。計算結(jié)果表明，四妙勇安湯治療慢性心力衰竭的作用機制靶點包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、α2型腎上腺素受體、1型血管緊張素II受體等。眾所周知，使AngⅡ降低，抑制RAS活性、調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)干預(yù)心力衰竭的重要作用環(huán)節(jié)[12～14]。進(jìn)一步分析金銀花與玄參的靶點發(fā)現(xiàn)，金銀花可能為四妙勇安湯中治療心力衰竭的主要貢獻(xiàn)者。有文獻(xiàn)提示，金銀花作為清熱解毒藥，可對心力衰竭的治療有獨特的貢獻(xiàn)，與金銀花配伍可能有提高藥效的心血管藥理學(xué)作用[15]。

四妙勇安湯化學(xué)成分與相關(guān)靶標(biāo)的相互作用研究能初步揭示中藥分子基礎(chǔ)及復(fù)雜的作用機理，從分子水平和網(wǎng)絡(luò)水平分析了中醫(yī)藥治療疾病的復(fù)雜水平，為現(xiàn)代中藥的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)綜合觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，可提示中藥相關(guān)藥理作用靶點、篩選中藥有效靶成分，大大減少實驗工作量，降低重要新藥開發(fā)及研究的風(fēng)險，有助于中藥現(xiàn)代化發(fā)展及創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)[16-18]。