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    紫蘇方膠囊微生物限度檢查方法的研究

    2018-08-05 17:54:02張媛媛曹莧愷李曉波
    上海醫(yī)藥 2018年13期
    關(guān)鍵詞:驗(yàn)證

    張媛媛 曹莧愷 李曉波

    摘 要 目的:建立中藥抗菌藥物紫蘇方膠囊微生物限度檢查方法并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。方法:參照2015年版《中國藥典》四部通則,利用卵磷脂、L組氨酸、聚山梨酯80的中和作用,采用薄膜過濾法和平皿法測(cè)定紫蘇方膠囊對(duì)金黃色葡萄球菌等5種試驗(yàn)菌種的回收率,并對(duì)其進(jìn)行了控制菌適用性試驗(yàn)。結(jié)果:5種試驗(yàn)菌回收率均在0.5~2.0范圍,控制菌可檢出。結(jié)論:本試驗(yàn)所建立方法可用于紫蘇方膠囊的微生物限度檢查。

    關(guān)鍵詞 紫蘇方 驗(yàn)證 微生物限度試驗(yàn)

    中圖分類號(hào):R286; R927.11 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1006-1533(2018)13-0080-04

    Verification of microbial limit test method for Zisu Fang

    ZHANG Yuanyuan1,2*, CAO Xiankai2, LI Xiaobo1**

    (1. Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China;

    2. Shanghai Lvgushengmingyuan Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai 201707, China)

    ABSTRACT Objective: To establish and verify the microbial limit test method for the traditional Chinese medicine of Zisu Fang capsule. Methods: According to the fourth part of the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia principles, the recovery rates of Zisu Fang capsule against 5 kinds of test microorganisms including Staphylococcus aureus were measured by membrane filtration and Petri dish methods and using the neutralization of lecithin, L-histidine and polysorbate 80, and the applicability test of E.coli as the control bacterium was also performed. Results: The recovery rates of the 5 kinds of experimental microorganisms were in the range of 0.5~2, and the control bacterium could be detected. Conclusion: The methods established in this experiment can be used for the microbial limit test of Zisu Fang capsule.

    KEY WORDS Zisu Fang; verification; microbial limit test

    紫蘇方為王永炎院士的臨床經(jīng)驗(yàn)方并由上海綠谷生命園醫(yī)藥有限公司開發(fā)為膠囊劑。該方具有清熱燥濕、化痰止咳的功效,用于治療感冒后余邪未凈,低熱咳嗽,周身不適,食欲不振。該方由紫蘇子、紫蘇梗、丹參、黃芩、苦參五味藥組成,主要藥效成分為丹參酮ⅡA、丹酚酸B、迷迭香酸、黃芩苷、苦參堿和氧化苦參堿。藥效研究已發(fā)現(xiàn)該方具有較強(qiáng)的抗菌活性,其提取物對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性顯著,與頭孢克洛聯(lián)用,能增強(qiáng)多種病原微生物對(duì)抗生素的敏感度[1-2]。紫蘇方微生物限度檢查包括需氧菌、霉菌和酵母,控制菌選取大腸埃希菌。中成藥組方具有復(fù)雜性,任何成分的抑菌成分均可影響微生物限度檢查的準(zhǔn)確性[3]。所以,對(duì)于此類藥物,單用稀釋和加中和劑的方法很難使試驗(yàn)菌(金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌、白色假絲酵母、黑曲霉)的比值都達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。為保障患者的用藥安全,確立可靠的微生物限度檢驗(yàn)方法,本試驗(yàn)參照2015年版《中國藥典》四部通則1105、1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查微生物計(jì)數(shù)法、控制菌檢查法,對(duì)紫蘇方膠囊微生物限度檢查方法進(jìn)行了摸索與驗(yàn)證[4],利用卵磷脂、L-組氨酸、聚山梨酯80的中和作用去除紫蘇方膠囊的抑菌性,并采用薄膜過濾法中加入中和劑的方法有效去除抑菌成分。

    1 材料和方法

    1.1 藥品與試劑

    紫蘇方膠囊(規(guī)格0.3 g,批號(hào)161102、161103、161105,上海綠谷生命園醫(yī)藥有限公司)。

    pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液(批號(hào)160829,上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司);大豆卵磷脂、L-組氨酸、聚山梨酯80(批號(hào)分別為20160701、20160901、20161201,潤捷化學(xué)試劑有限公司)。

    1.2 培養(yǎng)基與菌種

    胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號(hào)分別為151130、151223、150821、150210、151217、151109,上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

    金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, CMCC(B) 26003)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa, CMCC(B)10104)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis, CMCC(B)-63501)、白色假絲酵母(Candida albicans, CMCC(F)-98001)、黑曲霉(Aspergillus niger, CMCC(F)-98003)和大腸埃希菌(Escherichia coli, CMCC(B)44102)均來自于中國食品藥品檢定研究院。

    1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

    DHG-BH9243Ш電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、SPX-150BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱、MJ-160BS-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械有限公司);Testo 206-pH2酸度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司);HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電氣有限公司);YP1002N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);BSC-1000ⅡA2生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);YX940D電動(dòng)吸引器(上海醫(yī)療器械公司醫(yī)用吸引器廠)

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    參照2015年版《中國藥典》四部通則[4]對(duì)紫蘇方膠囊進(jìn)行需氧菌總數(shù)、真菌總數(shù)、控制菌檢查方法的確認(rèn),其中需氧菌總數(shù)采用薄膜過濾法,真菌總數(shù)及控制菌檢查采用平皿法。

    1.4.1 菌液的制備

    參照2015年版《中國藥典》四部通則[4]1105微生物計(jì)數(shù)法項(xiàng)下方法制備。

    對(duì)陽性菌菌液濃度進(jìn)行稀釋,濃度為10-4~10-6,使菌落數(shù)不大于100 cfu/ml。

    1.4.2 中和劑的制備

    取30 g胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,3 g大豆卵磷脂,1 g L-組氨酸,970 ml純化水加熱溶解后,加入30 g聚山梨酯80混合均勻,121 ℃、15 min滅菌后備用(臨用新配)。

    1.4.3 供試液的制備

    取紫蘇方膠囊10 g,加中和劑90 ml,于不超過45℃的水浴中放置,混勻,作為1∶10供試液。用中和劑繼續(xù)稀釋,制備1∶100供試液。

    1.4.4 計(jì)算公式及接受標(biāo)準(zhǔn)

    試驗(yàn)組比值=(試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù))/菌液對(duì)照組菌落數(shù)。

    中和劑比值=(中和劑對(duì)照組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù))/菌液對(duì)照組菌落數(shù)。

    所得比值均應(yīng)在0.5~2.0范圍內(nèi)。

    1.4.5 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證

    1)需氧菌計(jì)數(shù)方法的確定(預(yù)試驗(yàn)) 以金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和銅綠假單胞菌為試驗(yàn)菌。分別采用a,b,c 3種方法對(duì)供試品進(jìn)行處理。①方法a:供試品采用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液1 000 ml(最后沖洗100 ml時(shí)加入菌懸液);②方法b:供試品加入中和劑(30 g胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,3 g大豆卵磷脂,1 g L-組氨酸,15 g聚山梨酯80),pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液600 ml(最后沖洗100 ml時(shí)加入菌懸液);③方法c:方法b中聚山梨酯80改為30 g,于45 ℃水浴保溫,其余條件不變。

    2)方法驗(yàn)證 分別取三批供試品按方法c進(jìn)行處理,采用薄膜過濾法進(jìn)行檢查。①試驗(yàn)組:取1∶100供試液10 ml,按方法c操作,沖洗時(shí)加入0.1 ml菌液,濾干,于TSA上培養(yǎng);②供試品對(duì)照組:不加入菌液的供試液,測(cè)定供試品微生物數(shù);③菌液對(duì)照組;取稀釋液替代供試液,按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行回收試驗(yàn);④中和劑對(duì)照組:用中和劑替代供試液,按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行回收試驗(yàn);⑤陰性對(duì)照組:取中和劑10 ml,不加入菌液。

    1.4.6 真菌總數(shù)計(jì)數(shù)驗(yàn)證

    取三批供試品采用平皿法進(jìn)行真菌計(jì)數(shù)的方法學(xué)驗(yàn)證及菌落計(jì)數(shù)。①試驗(yàn)組:取制備好的供試液,加入試驗(yàn)菌液,取1 ml供試液等量分注5個(gè)無菌平皿,分別傾注15~20 ml沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,培養(yǎng);②供試品對(duì)照組:取制備好的供試液,不加入菌液。測(cè)定供試品微生物數(shù);③菌液對(duì)照組:取稀釋液替代供試液,按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行回收試驗(yàn);④中和劑對(duì)照組:用中和劑替代供試液,按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行回收試驗(yàn);⑤陰性對(duì)照組:平皿中加入1 ml中和劑,培養(yǎng)。

    1.4.7 控制菌驗(yàn)證試驗(yàn)

    以大腸埃希菌作為控制菌采用平皿法進(jìn)行操作,。①試驗(yàn)組:取1∶10供試液10 ml置100 ml TSB中,混勻,同時(shí)加入大腸埃希菌菌懸液1 ml混合均勻;②陰性對(duì)照組:取TSB 100 ml,不加入樣品和菌懸液;③菌液組:取TSB 100 ml加入大腸埃希菌菌懸液1 ml混合均勻。均按藥典方法培養(yǎng),以接入試驗(yàn)組的大腸埃希菌被檢出為接受標(biāo)準(zhǔn)。

    2 結(jié)果

    2.1 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法的預(yù)實(shí)驗(yàn)

    三種預(yù)實(shí)驗(yàn)方法試驗(yàn)結(jié)果表明,方法c可用于需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)(表1)。

    2.2 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證

    按照方法c對(duì)三批供試品進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明采用方法c可用于紫蘇方需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)(表2)。

    2.3 真菌總數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)

    采用平皿法對(duì)三批供試品進(jìn)行真菌總數(shù)驗(yàn)證,結(jié)果表明,可用于紫蘇方真菌總數(shù)計(jì)數(shù)(表3)。

    2.4 控制菌驗(yàn)證試驗(yàn)

    控制菌選用稀釋10-4倍的大腸埃希菌,3批供試品試驗(yàn)結(jié)果表明,適用性試驗(yàn)符合標(biāo)準(zhǔn)(表4)。

    3 討論

    通過上述一系列試驗(yàn),成功摸索出了適合于具有抑菌作用的紫蘇方膠囊的微生物限度控制方法,本次驗(yàn)證試驗(yàn)中需要注意的兩點(diǎn):①中和劑一定要臨用現(xiàn)配;②銅綠假單胞菌的計(jì)數(shù)須在培養(yǎng)24 h內(nèi)完成,而且試驗(yàn)中貼膜時(shí)要用無菌棉花吸干濾膜水分,否則培養(yǎng)后菌落會(huì)連成片,無法計(jì)數(shù),從而無法對(duì)回收率做出判斷。

    微生物限度檢查是判斷藥品受到微生物污染的程度,是企業(yè)從原料到成品生產(chǎn)全過程進(jìn)行微生物評(píng)價(jià)的主要依據(jù),同時(shí)也是藥品安全性檢查的重要項(xiàng)目[5-7]。檢查方法中干擾因素較多,易影響計(jì)數(shù)結(jié)果,如培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基、加菌濃度及加菌量等[8-9]。在新藥的研究和開發(fā)過程中,建立適當(dāng)?shù)臋z驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)證必不可少,而且不能簡(jiǎn)單照搬,需經(jīng)驗(yàn)證確認(rèn)試驗(yàn)方法和檢測(cè)系統(tǒng)的有效性[10-12]。微生物限度檢查方法常用的方法有薄膜過濾法(必要時(shí)可加入中和劑或稀釋培養(yǎng)基)和平皿法。薄膜過濾法是液體類制劑和抑菌作用較強(qiáng)的水溶性藥品進(jìn)行微生物限度試驗(yàn)的首選方法[13-14]。由于本次試驗(yàn)中紫蘇方膠囊具有較強(qiáng)的抑菌作用,本文在薄膜過濾法中加入中和劑,摸索了中和劑的比例及對(duì)供試液加溫等方法,成功去除了供試品的抑菌成分,建立了檢查方法,為中藥抑菌藥物的微生物限度檢查方法的建立提供了參考。

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