商曉慧 朱亞楠 葉冠
摘 要 目的:參照全球主要國家藥典的相關內(nèi)容,應用高效液相色譜法建立更趨簡便、實用的人參皂苷含量測定方法。方法:采用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5.0 μm);流動相為0.025%磷酸溶液-乙腈,梯度洗脫;流速0.9 ml/min;檢測波長203 nm。對10批市售人參藥材中的6種人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd的含量進行測定。結果:可同時測定6種人參皂苷含量。10批市售人參藥材中的6種人參皂苷含量的差異較大。結論:本方法專屬性強,且測定結果準確、可靠,可用作人參藥材質(zhì)量標準中人參皂苷含量的測定方法。
關鍵詞 人參 人參皂苷 高效液相色譜法 含量測定
中圖分類號:R927.2; R284.1 文獻標志碼:A 文章編號:1006-1533(2018)13-0072-04
SHANG Xiaohui**, ZHU Yanan, YE Guan***
(Central Research Institute, Shanghai Pharmaceuticals Holding Co., Ltd., Shanghai 201203, China)
ABSTRACT Objective: To establish an HPLC method for the determination of six ginsenosides on the basis of ChP 2015, USP38-NF33, EP8.0, BP 2013 and JP17. Methods: The contents of six ginsenosides in ten samples sold in market were determined by HPLC on a ZORBAX Eclipse Plus C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5.0 mm) with a mobile phase of acetonitrile-0.025% of phosphoric acid solution (adjusted to pH 2 with phosphoric acid) at the flow rate of 0.9 ml/min and the detected UV wavelength of 203 nm. Results: The contents of six ginsenosides including Rg1, Re, Rf, Rb1, Rb2 and Rd in the ten samples could be simultaneously determined and there were significant differences among them. Conclusion: This method is simple, rapid and repeatable with good specificity, so it can be used for quality control of Panax ginseng.
KEY WORDS Panax ginseng; ginsenosides; HPLC; content determination
人參(Panax ginseng C. A. Mey.)為五加科植物人參的干燥的根和根莖,具有“百草之王”的美譽,具有補益脾肺、生津養(yǎng)血、安神益智等多種功效[1],多用于大補元氣?,F(xiàn)代藥理研究表明,人參由于其多成分、多靶點的作用,具有改善心血管循環(huán)、提高免疫力、延緩衰老和抗腫瘤等多種藥理活性[2-5]。
人參具有較高的保健、藥用價值,在全球范圍內(nèi)得到了廣泛應用。目前,全球主要國家藥典中均收載有人參藥材的質(zhì)量標準,且多以人參皂苷Rg1、Rb1和Re的含量為指標進行質(zhì)量控制。
為了更好地控制人參藥材質(zhì)量,筆者等在參照各主要國家藥典相關內(nèi)容、特別是《2015美國藥典-國家處方集》中西洋參質(zhì)量標準的基礎上,應用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)建立了可同時測定人參藥材中6種主要人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd含量的新方法,為人參藥材企業(yè)內(nèi)控標準的建立提供了依據(jù)。
1 儀器與試藥
Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司生產(chǎn));乙腈(色譜純)、磷酸(分析純)、水(超純水)。
10批市售人參藥材(經(jīng)筆者之一葉冠鑒定為人參的干燥根,樣品保存在筆者所在研究院的樣本庫中)。
對照品人參皂苷Rg1(批號:110703-201230)、Re(批號:110754-201525)、Rf(批號:111719-201505)、Rb1(批號:110704-201424)、Rb2(批號:111715-201203)和Rd(批號:111818-201302)均購自中國食品藥品檢定研究院。
2 方法及結果
2.1 對照品溶液制備
精密稱取適量人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd,甲醇定容后得濃度分別為2 620、2 250、1 200、3 340、1 610和1 420 μg/ml的對照品溶液,備用。
2.2 供試品溶液制備
方法1:取供試品粉末(過4號篩)約3 g,精密稱定后溶于150 ml三氯甲烷中,采用索氏提取法加熱回流3 h,棄三氯甲烷液,殘渣待溶劑揮發(fā)后移入250 ml錐形瓶中,加150 ml水飽和正丁醇,超聲處理90 min,過濾。取濾液125 ml,蒸干,殘渣以甲醇溶解并移至25 ml量瓶中,定容,搖勻,過濾,即得供試品溶液。
方法2:取供試品粉末(過4號篩)約3 g,精密稱定后溶于150 ml甲醇中,超聲處理90 min,過濾。濾液濃縮至25 ml,定容,搖勻,過濾,即得供試品溶液。
對方法1所得供試品溶液進行HPLC測定,算得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積分別為982.39、595.27、263.14、452.23、122.08和57.19;對方法2所得供試品溶液進行HPLC測定,算得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積分別為837.65、502.76、168.33、321.98、98.56和36.23。使用方法2所得供試品溶液測得的人參皂苷含量偏低,且色譜峰的峰形較差。因此,本研究使用方法1制得的供試品溶液。
2.3 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗
采用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5.0 μm),以0.025%磷酸溶液-乙腈為流動相進行梯度洗脫(0 ~ 35 min,19%乙腈;35 ~ 55 min,19% ~ 29%乙腈;55 ~ 70 min,29%乙腈;70 ~ 100 min,29% ~ 40%乙腈),流速0.9 ml/min,柱溫35 ℃,進樣量10 μl,檢測波長203 nm。
在上述色譜條件下進行HPLC測定,對照品溶液和人參藥材樣品溶液的色譜圖見圖1。從圖1可知,各人參皂苷色譜峰的峰形、分離度均良好,無干擾峰,表明系統(tǒng)的適用性良好。
2.4 線性關系考察
將6種人參皂苷的對照品溶液分別稀釋5、10、20、50、80和100倍,以0.22 μm濾膜過濾后再分別吸取10μl進行HPLC測定。以濃度為橫坐標(x)、色譜峰的峰面積為縱坐標(y)繪制各人參皂苷成分的標準曲線,線性回歸后得回歸方程,結果見表1。從表1可知,各人參皂苷成分在各自線性范圍內(nèi)的線性關系良好。
2.5 精密度試驗
精密吸取由“修正”人參制得的供試品溶液,連續(xù)進樣6次進行HPLC測定,計算人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積,它們的RSD分別為2.44%、2.48%、1.15%、2.81%、1.67%和2.23%,表明儀器的精密度良好。
2.6 重復性試驗
精密稱取“秘參堂”人參粉末6份,分別為3.032 4、3.011 7、3.039 8、3.020 3、3.023 4和3.002 5 g,按“2.2”項下方法1制備供試品溶液,進樣進行HPLC測定,計算人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積,它們的平均含量分別為2.080、1.731、0.498、1.093、0.331和0.157 mg/g,RSD分別為1.38%、1.61%、1.17%、1.96%、1.38%和1.94%,表明方法的重復性良好。
2.7 穩(wěn)定性試驗
精密吸取由“修正”人參制得的供試品溶液并分別于制備后0、2、4、8、12和24 h進樣進行HPLC測定,計算人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積,它們的RSD分別為2.25%、2.02%、1.54%、3.62%、2.83%和2.14%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.8 加樣回收率試驗
精密稱取已知含量的人參粉末6份約各1.01 g,加入一定量的對照品溶液,按“2.2”項下方法1制備供試品溶液,進樣進行HPLC測定,計算人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積,然后采用外標法計算加樣回收率。
加樣回收率(%)=(C-A)/B×100%
其中,A為供試品所含被測成分量,B為加入的對照品量,C為實測值。
各人參皂苷的平均加樣回收率和RSD見表2。
2.9 耐用性試驗
考察不同色譜柱溫(25、30和35 ℃)條件下進行HPLC測定時各人參皂苷色譜峰峰面積的變化情況,算得的各人參皂苷色譜峰的峰面積和RSD見表3。
2.10 樣品含量測定結果
分別取10批市售人參藥材,按“2.2”項下方法1制備供試品溶液,進樣進行HPLC測定,計算人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd色譜峰的峰面積,然后采用外標法計算它們在人參藥材中的含量,結果見表4。
由表4可見,10批市售人參藥材中的6種人參皂苷含量及合計含量差異較大,其中Rg1含量范圍在0.139 ~0.244 g/100 g間;Re含量范圍在0.124 ~ 0.190 g/100 g間;Rf含量范圍在0.030 ~ 0.061 g/100 g間;Rb1含量范圍在0.109 ~ 0.139 g/100 g間;Rb2含量范圍在0.031 ~ 0.076 g/100 g間;Rd含量范圍在0.005 ~ 0.042 g/100 g間。6種人參皂苷的合計含量范圍在0.463 ~ 0.627 g/100 g間。
3 討論
人參是名貴中藥材,應用廣泛。2012年衛(wèi)生部發(fā)文公布批準人工種植的人參為新資源食品,明確了≤5年的人工種植人參在我國可用于食品的生產(chǎn)與加工。但市售的不同來源人參的活性成分含量差異較大[6],為確保成品品質(zhì)的穩(wěn)定,有必要對人參藥材的質(zhì)量進行更全面的控制。
全球主要國家藥典均以人參皂苷Rg1、Rb1和Re等的含量對人參藥材進行質(zhì)量控制?!?015美國藥典-國家處方集》中規(guī)定,西洋參干藥材中的6種人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2和Rd的總含量不得<4.0%。本研究參照全球主要國家藥典的相關內(nèi)容,應用HPLC建立可同時測定人參藥材中6種主要人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2和Rd含量的新方法,以用于更全面地控制人參藥材的質(zhì)量。
《2015美國藥典-國家處方集》西洋參質(zhì)量標準中采用3 μm的色譜柱填料測定6種人參皂苷含量,對實驗室設備條件的要求很高,難以用作生產(chǎn)企業(yè)的常規(guī)質(zhì)量檢查手段?!稓W洲藥典8.0》和《英國藥典2013》中采用5 μm的色譜柱填料測定人參皂苷,但方法的專屬性不好。本研究采用常規(guī)的5 μm色譜柱,通用性好,可同時對人參藥材中6種主要人參皂苷進行含量測定。
食品開發(fā)注重色、香、味、形。用作食品原料的人參藥材,其感官指標要求具有人參特有的香氣以及味甘、微苦,但缺乏量化標準。本研究在人參藥材企業(yè)內(nèi)控質(zhì)量標準的建立過程中,通過對市售10批人參藥材進行感官評審、人參皂苷含量測定等系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn),人參藥材的滋味與本研究HPLC測定方法測得的6種人參皂苷的總含量呈正相關關系,但與應用紫外-可見分光光度計法(國家標準GB/T 19506)測得的總?cè)藚⒃碥諢o相關性,推測原因可能是紫外-可見分光光度計法缺乏專一性,從而導致結果差異較大。因此,為保證人參相關食品的感官與功效,應建立或更新企業(yè)的人參藥材內(nèi)控質(zhì)量標準,采用本研究建立的HPLC測定方法同時測定人參藥材中的6種主要人參皂苷含量。
參考文獻
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