化學(xué)作用力對(duì)皮蛋蛋黃凝膠形成的影響

艾民珉湯 婷蔣愛(ài)民楊益嘉游玉婷

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2. 畜禽產(chǎn)品精準(zhǔn)加工與安全地方聯(lián)合工程研究中心，廣東 廣州 510642；3. 廣東省畜禽產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心，廣東 廣州 510642；4. 廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

皮蛋是中國(guó)傳統(tǒng)的生食蛋制品之一，具有色澤美觀、風(fēng)味濃郁、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)[1-2]。皮蛋的形成主要是利用氫氧化鈉與蛋白質(zhì)等成分作用，使其發(fā)生物理化學(xué)變化形成凝膠狀態(tài)[3-5]。傳統(tǒng)腌制工藝?yán)飼?huì)添加氧化鉛，而鉛的作用目前比較認(rèn)可的說(shuō)法是“堵孔”學(xué)說(shuō)[6]，即鉛能與蛋白質(zhì)等生成難溶物沉積于蛋殼和殼膜表面阻止氫氧化鈉進(jìn)一步進(jìn)入蛋內(nèi)部，避免蛋清“堿傷”現(xiàn)象的發(fā)生[7]。但是鉛會(huì)在人體內(nèi)積累，對(duì)人體健康造成危害，尤其對(duì)嬰幼兒智力發(fā)育有不良影響[8]。故近年來(lái)，學(xué)者對(duì)于皮蛋無(wú)鉛工藝研究較多[9-11]，比如采用添加鋅、銅等來(lái)替代鉛的作用，同時(shí)與氫氧化鈉等混合制成堿液，即清料法腌制液，解決了傳統(tǒng)腌制泥中重金屬超標(biāo)和腌制出的皮蛋品質(zhì)不穩(wěn)定等問(wèn)題。

蛋黃主要由33.8%的脂肪和14.5%的蛋白質(zhì)[12]組成，也是皮蛋的主要構(gòu)成部分。蛋清凝膠是依靠離子鍵與二硫鍵作用形成球狀蛋白質(zhì)聚集體，而蛋黃凝膠的形成受水分和鹽分的影響[13]。目前，對(duì)于皮蛋中蛋清凝膠的形成機(jī)理及改性研究較多，也較為成熟，但對(duì)于蛋黃凝膠形成機(jī)理及金屬離子調(diào)控等研究較少且仍未闡明[1]。本試驗(yàn)采用清料法腌制皮蛋，對(duì)皮蛋腌制過(guò)程中蛋黃內(nèi)部化學(xué)作用力和凝膠強(qiáng)度進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，旨在為蛋黃凝膠形成機(jī)理的探究及皮蛋品質(zhì)控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鴨蛋：廣州市天河區(qū)長(zhǎng)湴市場(chǎng)；

8-苯胺基-1-萘磺酸銨(ANS)：分析純，上?？祈樕锟萍加邢薰荆?/p>

5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)：分析純，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

紫外分光光度計(jì)：UV-2600型，日本島津公司；

熒光分光光度計(jì)：RF-5301PC型，日本島津公司；

均質(zhì)機(jī)：HPH2000/4型，德國(guó)IKA公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：Vertex70型，德國(guó)Bruker公司；

高速冷凍離心機(jī)：Eppendorf 5804R型，德國(guó)艾本德科技公司；

物性分析儀：TA.XT.Plus 型，英國(guó)SMS公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程 選取65～75 g新鮮鴨蛋數(shù)枚，用流動(dòng)水沖洗表面臟物，晾干后備用。按照以下配方配制腌制液：4.5% NaOH，3.5%食鹽，0.1% CuSO4，0.1% FeSO4，0.1% ZnSO4，0.1% 紅茶末。將晾干后的新鮮鴨蛋浸泡于腌制液中，腌制4周后出缸，流水沖凈鴨蛋表面殘留堿液后晾干，用石蠟包裹皮蛋，后熟2周。分別在腌制7，14，21，28，35，42 d時(shí)隨機(jī)選取10枚進(jìn)行分析測(cè)試。

1.3.2 凝膠強(qiáng)度測(cè)定 使用直徑為50 mm的圓柱型探頭P/50，對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行單軸向壓縮，壓縮距離4 mm，觸發(fā)力4.0 g。測(cè)試前速0.5 mm/s，測(cè)試速度0.5 mm/s，測(cè)試后速0.5 mm/s。

1.3.3 表面疏水性的測(cè)定 稱取1 g皮蛋黃，加入10 mL pH 7.0的磷酸緩沖液，均質(zhì)后于4 000×g離心10 min，取上清液備用。將離心后的樣品上清液蛋白質(zhì)濃度稀釋為0.01 mg/mL。取4 mL稀釋液，添加20 μL 8 mmol/L的ANS為熒光探針，激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm，掃描范圍為400～600 nm。

1.3.4 傅里葉轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析 精確稱取100 mg KBr和1.2 mg冷凍干燥后的樣品，用瑪瑙研缽研磨至沒(méi)有光澤后壓片。將壓好的樣品置于全反射附件(ATR)上進(jìn)行全波段(4 000～600 cm-1)掃描，掃描次數(shù)為16次，分辨率為4 cm-1。以相應(yīng)未添加樣品的KBr為背景，扣除背景后得到紅外光譜圖。利用OMNIC 6.0數(shù)據(jù)處理軟件和Peakfit 4.12 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，擬合后使殘差<0.01，根據(jù)各積分面積計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)所占百分含量。

1.3.5 游離巰基和總巰基的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[14]。

1.3.6 離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[15]。

1.3.7 凝膠電泳(SDS-PAGE) 凝膠電泳使用5%和12%分離疊加凝膠。稱取3 g蛋黃加入27 mL 5% SDS，并于12 000 r/min 的勻漿器中快速分散1 min，將勻漿在85 ℃下加熱1 h后，于7 500×g離心10 min。用樣品處理液將蛋白質(zhì)濃度調(diào)整到1 mg/mL，取20 μL進(jìn)行電泳，凝膠電泳單元的恒定電壓為200 V/板，凝膠的染色用考馬斯亮藍(lán)R-250(0.125%)、25 mL/100 mL 甲醇和10 mL/100 mL 醋酸。脫色用40 mL/100 mL 甲醇和10 mL/100 mL 醋酸。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用Origin 8.5和SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多重比較、LSD檢驗(yàn)以及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋黃凝膠強(qiáng)度的變化

由圖1可知，腌制過(guò)程中蛋黃的凝膠強(qiáng)度變化顯著(P<0.05)，而在后熟期間變化不顯著(P>0.05)。腌制過(guò)程中氫氧化鈉逐漸透過(guò)蛋殼與蛋殼膜進(jìn)入蛋清和蛋黃內(nèi)，使得蛋清呈透明凝膠狀，而蛋黃逐漸呈外部凝膠、溏心黏稠狀。氫氧化鈉與蛋黃中油脂發(fā)生皂化反應(yīng)使得表面蛋黃開(kāi)始凝固，同時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生堿變性，生成的變性蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)，使得原本柔軟的外層蛋黃呈凝膠狀，凝膠強(qiáng)度在腌制期間顯著增加。皮蛋出缸后，沒(méi)有氫氧化鈉的持續(xù)滲透，且水分逐漸散失，使得蛋黃凝膠強(qiáng)度在28～35 d時(shí)顯著增加(P<0.05)，而后熟期間皮蛋內(nèi)部微環(huán)境趨于穩(wěn)定，故在后熟過(guò)程中凝膠強(qiáng)度變化不明顯(P>0.05)。

圖1 凝膠強(qiáng)度的變化

2.2 蛋黃表面疏水性的變化

ANS可用作熒光標(biāo)記來(lái)反映蛋白質(zhì)的表面疏水特性及監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的變性過(guò)程，其常與陰離子蛋白結(jié)合[16]。皮蛋在腌制和后熟過(guò)程中的外源性熒光光譜見(jiàn)圖2。外層蛋黃和溏心蛋白質(zhì)的熒光峰值隨腌制時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，其中外層蛋黃峰值在14～42 d時(shí)下降顯著(P<0.05)，而溏心峰值在7～14 d時(shí)下降顯著(P<0.05)，在14～42 d時(shí)下降不明顯(P>0.05)，說(shuō)明外層蛋黃在14～28 d時(shí)發(fā)生了明顯的變性，而溏心在整個(gè)腌制和后熟過(guò)程中的蛋白質(zhì)變性較緩慢。氫氧化鈉的滲入，改變了酸堿平衡環(huán)境，變性后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)逐漸變得有序，空間結(jié)構(gòu)變得可延伸，使得更多極性基團(tuán)暴露。極性基團(tuán)以非共價(jià)鍵的方式與滲透的陰離子及蛋白質(zhì)相結(jié)合，導(dǎo)致非極性基團(tuán)和陰離子增加，熒光強(qiáng)度也相應(yīng)增加。而蛋清凝膠的形成使得氫氧化鈉滲透進(jìn)入蛋黃的速率下降，凝固的外層蛋黃進(jìn)一步減緩了氫氧化鈉滲透進(jìn)入溏心的速率，說(shuō)明蛋黃蛋白質(zhì)的變性會(huì)使表面疏水性下降。同時(shí)，溏心蛋白質(zhì)的熒光峰值是外層蛋黃的3～10倍，說(shuō)明外層蛋黃蛋白質(zhì)比溏心蛋白質(zhì)變性嚴(yán)重。

圖2 表面疏水性的變化

2.3 FTIR結(jié)果分析

2.4 蛋黃腌制過(guò)程中游離巰基與總巰基的變化

皮蛋在腌制和后熟過(guò)程中游離巰基和總巰基的變化見(jiàn)圖3。外層蛋黃的游離巰基下降緩慢(P>0.05)，溏心的游離巰基和總巰基均下降顯著(P<0.05)，而外層蛋黃總巰基呈先增加后下降趨勢(shì)，在第14天時(shí)達(dá)到最大值(32.34 μmol/g·Pro)。鄭華等[20]曾報(bào)道新鮮蛋黃的巰基含量為57 μmol/g·Pro。說(shuō)明蛋黃在腌制0～7 d時(shí)，巰基含量大幅度下降，而在腌制和后熟過(guò)程中游離巰基變化不明顯，原因可能是外層蛋黃蛋白質(zhì)的變性等因素使得巰基在前期轉(zhuǎn)化成了二硫鍵。外層蛋黃總巰基含量比游離巰基平均高3.44 μmol/g·Pro，而溏心總巰基含量比游離巰基高0.29 μmol/g·Pro，表明外層蛋黃中分子內(nèi)部巰基的數(shù)量要比溏心多。蛋黃中的蛋白質(zhì)是與不同質(zhì)量脂質(zhì)結(jié)合的磷蛋白，共有316種，占比較高的有低密度脂蛋白(65%)、高密度脂蛋白(16%)、卵黃球蛋白(10%)和卵黃高磷蛋白(4%)[21]。其中高密度脂蛋白能在高堿度下形成聚集體但并不是依靠巰基或二硫鍵的作用，而二硫鍵是球形蛋白質(zhì)形成凝膠的主要作用力，表明蛋黃中蛋白質(zhì)巰基的變化主要來(lái)自于卵黃球蛋白[22-23]。蛋黃接觸氫氧化鈉的時(shí)間晚于蛋清，變性后的卵黃球蛋白快速通過(guò)化學(xué)鍵與其它蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)而形成凝膠，進(jìn)一步滲透的氫氧化鈉與溏心中油脂發(fā)生皂化反應(yīng)，不同等電點(diǎn)的蛋黃蛋白質(zhì)逐漸變性聚集轉(zhuǎn)變?yōu)橥鈱拥包S凝膠，形成了皮蛋蛋黃色層分明的特點(diǎn)。

表1 二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

圖3 腌制和后熟過(guò)程中蛋黃游離巰基和總巰基的變化

2.5 蛋黃離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵的變化

蛋黃在不同腌制和后熟期間的化學(xué)作用力變化見(jiàn)圖4。由圖4可知，外層蛋黃中的SA和SD顯著增加(P<0.05)，溏心中的SA、SC和SD占比較大，表明外層蛋黃分子間作用力主要是離子鍵和二硫鍵，而溏心分子間作用力主要是離子鍵、疏水相互作用和二硫鍵。

離子鍵主要受負(fù)電荷的影響，能阻礙凝膠的形成，但外層蛋黃形成了凝膠，且其比例顯著增加(P<0.05)。在腌制前期氯化鈉較氫氧化鈉滲透速度快，外層蛋黃表面正電荷較多，而后期氯化鈉滲透速率下降及蛋白質(zhì)變性使得表面覆蓋較多負(fù)電荷，離子鍵含量增加。溏心離子鍵占比較大且呈先增大后降低趨勢(shì)，在21 d時(shí)達(dá)到最大值66.41%。表明在前21 d時(shí)由于水分的降低以及氫氧化鈉的滲入使得蛋白質(zhì)表面負(fù)電荷增加，而后期氯化鈉含量的增加降低了表面負(fù)電荷的相互作用，離子鍵降低。氫鍵是維持蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力，疏水相互作用是維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)作用力，它對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能性質(zhì)具有重要的作用。有研究[24]表明蛋白質(zhì)的疏水性對(duì)蛋白質(zhì)分子的凝聚作用有顯著影響。外層蛋黃的SB與SC占比較小，說(shuō)明氫氧化鈉的滲透造成多肽鏈末端官能團(tuán)被電離，使得氫鍵和疏水相互作用占比較小。溏心的SB下降顯著(P<0.05)，SC增加明顯(P<0.05)，表明溏心蛋白質(zhì)在腌制過(guò)程中逐漸發(fā)生變性而聚集形成凝膠，增加凝膠強(qiáng)度。二硫鍵是形成凝膠的重要化學(xué)鍵，也是維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的重要次級(jí)鍵，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)受到外界環(huán)境的影響時(shí)，二硫鍵會(huì)轉(zhuǎn)化為巰基，從而破壞蛋白SA表示蛋黃在溶劑A中的溶解度，代表離子相互作用；SB表示蛋黃在溶劑A與B的溶解度之差，代表氫鍵；SC表示蛋黃在溶劑B與C的溶解度之差，代表疏水相互作用；SD表示蛋黃在溶劑C與D的溶解度之差，代表二硫鍵[13]質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。外層蛋黃和溏心的SD占比均較大，變化也顯著(P<0.05)，說(shuō)明在強(qiáng)堿作用下蛋黃蛋白質(zhì)在腌制和后熟過(guò)程中發(fā)生了變性，多肽鏈之間的巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵，促進(jìn)了蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)并形成凝膠，提高了凝膠強(qiáng)度。

圖4 化學(xué)作用力的變化

Figure 4 The changes of intermolecular interaction

2.6 SDS-PAGE分析

由圖5可知，標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量為14.4～97.2 kDa。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率作為對(duì)照，根據(jù)樣品的相對(duì)遷移率，來(lái)判斷不同腌制時(shí)期蛋黃蛋白質(zhì)的變化。對(duì)比各樣品的電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外層蛋黃蛋白質(zhì)的主要條帶集中在43.0 kDa附近，且條帶數(shù)量從3條減少至1條，溏心蛋白質(zhì)在7 d時(shí)主要有7條，堿濃度的增加使得部分溏心蛋白質(zhì)分解，條帶數(shù)量減少。外層蛋黃和溏心凝膠電泳中均在43.0 kDa附近存在條帶，該蛋白質(zhì)可能是高密度脂蛋白，說(shuō)明與其它蛋白質(zhì)相比，高密度脂蛋白能在堿性環(huán)境中穩(wěn)定存在。在氫氧化鈉的作用下，蛋黃脂蛋白被破壞，蛋白質(zhì)與油脂分離，油脂與堿發(fā)生皂化反應(yīng)使得外層蛋黃開(kāi)始凝固，蛋白質(zhì)分解成小片段多肽，這些多肽通過(guò)內(nèi)部化學(xué)鍵發(fā)生交聯(lián)包裹水分而富有彈性，凝膠強(qiáng)度增加。蛋黃蛋白質(zhì)的電泳結(jié)果與其二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化一致。

M. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白 外. 外層蛋黃 內(nèi). 溏心

3 結(jié)論

研究皮蛋加工過(guò)程中蛋黃內(nèi)部化學(xué)作用力及其凝膠強(qiáng)度的變化，對(duì)揭示蛋黃凝膠的形成機(jī)理具有重要意義。結(jié)論如下：① 外層蛋黃蛋白質(zhì)的變性程度強(qiáng)于溏心蛋白質(zhì)，且其表現(xiàn)出的蛋白質(zhì)表面疏水性顯著下降，影響著蛋黃內(nèi)蛋白質(zhì)的聚集；② 外層蛋黃凝膠的形成主要依靠離子鍵和二硫鍵的作用，氫鍵和疏水相互作用貢獻(xiàn)較小；③ 溏心逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橥鈱拥包S凝膠，形成色層分明的特點(diǎn)，增強(qiáng)了蛋黃凝膠強(qiáng)度，其中疏水相互作用和二硫鍵起主要作用，離子鍵和氫鍵作用顯著減弱；④ 皮蛋中大部分蛋黃蛋白質(zhì)分解成小片段多肽，比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)可能是高密度脂蛋白。本試驗(yàn)對(duì)蛋黃的形成機(jī)理進(jìn)行了討論，但僅監(jiān)測(cè)了各種化學(xué)作用力對(duì)蛋黃凝膠形成的影響，對(duì)于蛋黃內(nèi)部各種成分對(duì)其凝膠形成的影響還有待進(jìn)一步研究。