竹豆清蛋白提取工藝優(yōu)化及亞基組成分析

姚海霞王 娟王立梅齊 斌

(1. 常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118)

竹豆(bamboo bean)為豇豆屬，又稱飯豆、爬豆等。其資源豐富、種植地廣，目前全國各地，云南、吉林、山西、貴州等均有種植。竹豆營養(yǎng)豐富，其富含淀粉、蛋白質、鈣、磷、鐵及粗纖維、類胡蘿卜素、VB1、VB2、VC等[1-2]。與綠豆、小豆相比，竹豆具有抗蟲害、產(chǎn)量高、適應力強等優(yōu)勢[3]，適合在高溫干旱或土壤貧瘠地區(qū)種植。然而，它卻只被當作飼料和綠肥，其種子資源未被有效開發(fā)和利用。

目前，國內(nèi)外對竹豆的農(nóng)藝性狀[4]、栽培措施[5]、種質資源多樣性[6]等均有報道，但關于竹豆清蛋白的研究報道幾乎沒有。植物清蛋白的研究大多集中在蕓豆[7]、綠豆[8]11-48、米糠[9]、菜籽粕[10]等農(nóng)作物，研究表明植物清蛋白具有較好的起泡性及乳化性，可部分替代動物雞蛋蛋白，在食品應用上具有較大潛力，可應用于蛋糕、面包、冰淇淋或者餅干等食品[11-12]，具有來源廣、成本低的優(yōu)勢。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)蛋白亞基對功能性質具有重要作用[13-14]，在凝膠性和乳化性方面的研究已較為廣泛[15-16]。本試驗擬以竹豆為原材料，采用Osborne分級法[17]提取清蛋白，通過響應面試驗優(yōu)化提取工藝，進一步分析其亞基組成，以期為研究竹豆清蛋白的理化性質及功能性質提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

竹豆：購于云南昆明蘭姐特產(chǎn)店；

乙醇、硼酸、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉：分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司；

甲基紅、亞甲基藍、溴甲酚綠：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

Tris[三(羥甲基)胺基甲烷]、SDS(十二烷基硫酸鈉)、Glycine(甘氨酸)：分析純，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

磁力加熱攪拌器：RCT basic型，蘇州賽恩斯儀器有限公司；

高速冷凍離心機：CR22GⅡ型，日本Hitachi公司；

冷凍干燥機：freezone 6 型，美國Labeonco公司；

pH計：FE20型，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；

電子天平：MP10001型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；

超純水儀：Milli-Q advantage型，美國Millipore公司；

電泳儀：Mini-PROTEAN Tetra型，美國Bio-Rad公司；

凝膠成像系統(tǒng)：BIO-RAD型，美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 竹豆基本成分的測定 竹豆水分、灰分、蛋白、脂肪、淀粉的測定分別按照《食品安全國家標準》中直接干燥法(GB 5009.3—2016)、質量法(GB 5009.4—2016)、凱氏定氮法(GB 5009.5—2016)、索氏提取法(GB 5009.6—2016)和酸水解法(GB 5009.9—2016)進行測定。

1.3.2 竹豆清蛋白制備工藝流程

竹豆→粉碎機粉碎→過篩(60目)→石油醚室溫脫脂[料液比為1∶3 (g/mL)]48 h→自然風干→脫脂竹豆→蒸餾水提取→離心(10 000 r/min,4 ℃，15 min)→取上清→調(diào)pH至4.0→離心(10 000r/min,4 ℃，15 min)→取沉淀→水洗→調(diào)至pH至7.0→冷凍干燥48 h→竹豆清蛋白

1.3.3 竹豆清蛋白等電點的測定 配置1 mg/mL竹豆清蛋白溶液，分別將pH調(diào)至3.0～5.6，每0.2一個梯度，靜置1 h后離心取上清，采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量，分別計算其溶解度，溶解度最低的pH即為等電點。

1.3.4 單因素試驗提取

(1) 攪拌速率：固定料液比1∶8 (g/mL)、提取溫度45 ℃、提取時間1 h，設置攪拌速率為200，400，600，800，1 000 r/min，考察攪拌速率對竹豆清蛋白提取率的影響。

(2) 攪拌溫度：固定料液比1∶8 (g/mL)、攪拌速率600 r/min、提取時間1 h，設置提取溫度為35，40，45，50，55 ℃，考察攪拌溫度對竹豆清蛋白提取率的影響。

(3) 攪拌時間：固定料液比1∶8 (g/mL)、提取溫度45 ℃、攪拌速率600 r/min，設置提取時間為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，考察攪拌時間對竹豆清蛋白提取率的影響。

(4) 料液比：固定提取溫度45 ℃、攪拌速率600 r/min、提取時間1 h，設置料液比為1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶14(g/mL)，考察料液比對竹豆清蛋白提取率的影響。

1.3.5 響應曲面試驗優(yōu)化工藝 根據(jù)單因素試驗結果，本試驗選取了攪拌速率、攪拌溫度、攪拌時間、料液比4個因素作為工藝參數(shù)，以竹豆清蛋白的提取率為參考指標。根據(jù)Box-Behnken的原理進行試驗設計，建立相關模型，確定最優(yōu)提取工藝。

1.3.6 竹豆清蛋白提取率的計算

(1)

式中：

E——提取率，%；

m——竹豆清蛋白質量，g；

M——竹豆干豆的質量，g；

w——竹豆干豆中總蛋白質量分數(shù)，%(前期測得為20.5%)。

1.3.7 竹豆清蛋白的亞基組成 精確稱取竹豆清蛋白1 g (精確至0.001 g)至100 mL蒸餾水中，超聲提取15 min，離心(4 000 r/min, 4 ℃, 15 min)取上清，作為待測液。取100 μL 樣液，加20 μL 5×Sample Loading Buffer[組分：250 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8); 0.5% Bromophenol Blue; 10% SDS;50% Glycerol; 7.5% DTT]，100 ℃煮沸5 min，取10 μL上樣。分別制備5%濃縮膠和12%分離膠，對其進行不連續(xù)垂直電泳，設置濃縮膠電壓70 V 分離膠110 V ，至溴酚藍跑至分離膠底部1 cm處結束。采用考馬斯亮藍G-250染色，充分脫色后拍照保存。

2 結果與分析

2.1 竹豆基本成分

竹豆基本成分見表1。

表1 竹豆基本成分含量

2.2 竹豆清蛋白等電點

由圖1可知，竹豆清蛋白在pH 3.5～4.5時有較低的溶解度，在pH 4.0時最低，該處即為其等電點。研究[18]表明大多數(shù)蛋白質在等電點處起泡性最差，但起泡穩(wěn)定性較好；劉永創(chuàng)等[19]發(fā)現(xiàn)等電點處的大豆分離蛋白比中性條件下制備的乳液具有更高的乳化穩(wěn)定性及儲藏穩(wěn)定性。因此，蛋白質的等電點對其功能性質的研究具有重要意義。

圖1 竹豆清蛋白的等電點測定

2.3 單因素試驗

2.3.1 攪拌速率對竹豆清蛋白的影響 由圖2可知，竹豆清蛋白提取率隨攪拌速率先上升后下降，最后趨于平穩(wěn)，當攪拌速率為400 r/min時，提取率達到最高。在一定范圍內(nèi)，增加攪拌速度可以促進蛋白與水分子的接觸，促進溶解，但達到一定限度后，過高的攪拌速率產(chǎn)生的剪切力可能導致蛋白變性，破壞其原有結構[20]144-153，使溶解度降低，提取率降低。

圖2 攪拌速率對竹豆清蛋白提取率的影響

2.3.2 攪拌溫度對竹豆清蛋白提取率的影響 由圖3可知，在35～45 ℃時竹豆清蛋白提取率隨溫度升高而逐漸增大，在50 ℃時下降較為緩慢，而在55 ℃時急速下降。這是因為在35～45 ℃時，竹豆清蛋白的水合能力隨著溫度的升高而增強，而隨著溫度的進一步升高，氫鍵作用和離子基團的水合作用減弱，蛋白質水合能力下降[20]130-131，提取率隨之下降。而在55 ℃時，下降極為顯著，可能是此時溫度過高，蛋白質的高級結構遭到破壞，導致變性聚集。

圖3 攪拌溫度對竹豆清蛋白提取率的影響

Figure 3 Effect of stirring temperature on the extraction rate of bamboo bean albumin

2.3.3 攪拌時間對竹豆清蛋白提取率的影響 由圖4可知，竹豆清蛋白提取率在攪拌時間為1.5 h達到最大。當攪拌時間為0.5～1.5 h時，竹豆清蛋白充分展開，同水穩(wěn)定結合，逐步接近飽和，提取率上升；而在1.5 h后，清蛋白與水分子結合達到飽和，增加攪拌時間只會破壞維持蛋白質結構作用力的平衡，部分基團的水化層被破壞，使原來結合好的蛋白質分子又脫離水分子，提取率下降。

2.3.4 料液比對竹豆清蛋白提取率的影響 由圖5可知，竹豆清蛋白提取率隨提取溶劑體積量增大而先增后降，且增減幅度較大，在料液比為1∶12 (g/mL)時達到最大。當溶劑較少時，竹豆清蛋白隨著溶劑的增加充分浸出，同水結合越充分，提取率增大，在料液比為1∶12 (g/mL)時，同水結合力達到最大；而溶液較多時，竹豆清蛋白過度腫脹，與水結合力減弱，提取率下降。

圖4 攪拌時間對竹豆清蛋白提取率的影響

Figure 4 Effect of stirring time on the extraction rate of bamboo bean albumin

圖5 料液比對竹豆清蛋白提取率的影響

Figure 5 Effect of ratio of material to liquid on the extraction rate of bamboo bean albumin

2.4 響應面試驗

2.4.1 響應面試驗設計與結果 響應面因素與水平的試驗設計及相應試驗結果見表2、3。

2.4.2 模型的建立與分析 采用Design-Expert 8.05b軟件對表3數(shù)據(jù)進行擬合，得回歸方程：

Y=26.55-0.022A-0.26B+1.54C-2.75D+0.56AB-0.58AC+0.96AD-0.32BC+0.19BD+0.21CD-1.36A2-1.32B2-5.19C2-3.73D2。

(2)

其中，校正系數(shù)R2=0.993 4，變異系數(shù)CV=1.88%，說明該模型擬合度較好，可對竹豆清蛋白的提取工藝進行分析和預測，能較好地反映真實值。

響應面數(shù)據(jù)的方差分析結果見表4，結果顯示模型P<0.000 1，表明回歸模型極顯著。失擬誤差P=0.092>0.05，表明所用模型與試驗擬合誤差不顯著，未知因素對試驗干擾少，數(shù)據(jù)較準確[21]。由表4可知，單因素對竹豆清蛋白提取率影響順序依次為：D>C>B>A；因素之間交互作用大小依次為：AD>AC>AB>BC>CD>BD；各因素的二次方對提取率影響大小為： C2>D2>A2>B2。

表2 響應面因素與水平的試驗設計

2.4.3 響應曲面三維圖和等高線分析 竹豆清蛋白提取的等高線圖與響應面3D圖見圖6～8。由圖6可知，響應曲面較陡峭，等高線形狀為寬橢圓，表明攪拌速率和溫度對竹豆清蛋白提取率具有較顯著影響；由圖7可知，響應曲面陡峭，等高線形狀為較細橢圓，表明攪拌速率和時間交互作用顯著，且時間對提取率的影響大于攪拌速率；由圖8可知，響應曲面比之前更加陡峭，橢圓形狀更細長，表明攪拌速率和料液比之間的交互作用更加顯著，這也與方差分析結果相一致，表明了模型的可靠性與真實性。

表3 響應面試驗結果

表4 方差分析表?

? *差異顯著，P<0.05；** 差異極顯著，P<0.01。

圖6 攪拌速率和溫度對竹豆清蛋白提取率的響應面與等高線圖

圖7 攪拌速率和時間對竹豆清蛋白提取率的響應面與等高線圖

圖8 攪拌速率和料液比對竹豆清蛋白提取率的響應面與等高線圖

2.5 最佳工藝參數(shù)確定與模型驗證

通過響應面模型可知，提取竹豆清蛋白的最佳工藝為：攪拌速率355.83 r/min、提取溫度44.02 ℃、提取時間1.58 h、料液比1∶11.20 (g/mL)，提取率的預測值為27.25%。為實際操作方便，將最佳參數(shù)調(diào)整為：攪拌速率356 r/min、提取溫度44 ℃、提取時間1.5 h、料液比1∶11.20 (g/mL)，此條件下提取率為27.56%(n=3)，與預測值相差1.14%，說明該模型用于提取竹豆清蛋白是可靠的。最優(yōu)條件下，竹豆清蛋白純度為(86.50±2.17)% (n=3)，與其他豆類蛋白[22]比較，純度相差不大，可用于后續(xù)功能性質的研究。

2.6 竹豆清蛋白的亞基組成

竹豆清蛋白的SDS-PAGE電泳如圖9所示，通過Image Lab軟件，將蛋白質Marker的分子量對數(shù)(y)與條帶相對遷移率(x)作標準曲線方程：y=-2.4x+2.88，R2=0.983 3。將竹豆清蛋白條帶相對遷移率帶入標準曲線方程，計算其主要亞基分子量。竹豆清蛋白含有9個亞基條帶，分別為

圖9 竹豆清蛋白的SDS-PAGE還原電泳

1.3.3，103.5，94.6，49.6，35.3，32.3，27.6，24.0，19.7 kDa。其中最主要亞基分布在49.6，27.6 kDa，分別占總量的61.1%，20.6%，與李永武[8]42-45提取的綠豆清蛋白亞基分子量分布相似。

3 結論

通過響應面試驗確定竹豆清蛋白的最佳提取工藝為：攪拌速率356 r/min、提取溫度44 ℃、提取時間1.5 h、料液比1∶11.20 (g/mL)，在此條件下提取率為27.56%，純度為(86.50±2.17)%。SDS-PAGE電泳分析表明，竹豆清蛋白含有9個亞基條帶，其中最主要亞基分布在49.6，27.6 kDa。

目前，關于竹豆清蛋白提取工藝報道幾乎沒有，通過優(yōu)化其提取工藝，有助于獲得更高產(chǎn)量的竹豆清蛋白；通過SDS-PAGE電泳進一步分析亞基組成，為進一步研究其功能性質及結構特征提供理論依據(jù)，有助于竹豆清蛋白在食品領域的加工及應用。