瑪咖對(duì)SD雌性大鼠體內(nèi)能量代謝的影響及機(jī)理

朱玉竹朱 萍

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)附屬中學(xué)，云南 昆明 650200；2. 重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400044)

瑪咖(LepdiummeyeniiWalp, Maca) 原產(chǎn)于海拔3 500～4 000 m 的秘魯安第斯山脈(AndesPeru)，為十字花科(Brassicaceae)獨(dú)行菜屬(Lepidium)草本植物[1-2]。自2011年中國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)瑪咖粉作為新食品原料以來，中國(guó)瑪咖種植和加工均迎來了快速的發(fā)展?，斂Ш胸S富的多糖、瑪咖烯、瑪咖酰胺等是藥食同源作物，具有增強(qiáng)性功能[3]，抗疲勞、抗氧化[4]，減緩更年期綜合癥[5]等作用。已研究表明，云南產(chǎn)不同色型(紫、白、黃、黑)，不同產(chǎn)地(會(huì)澤、麗江、文山等)的瑪咖在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生理功能上存在差異，如：云南產(chǎn)瑪咖生物堿含量依次為黃色(2.224 1 mg/g)、白色(2.919 3 mg/g)、紫色(4.407 8 mg/g)，差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)[6]；多糖含量為紫色(7.02%)>黑色(6.93%)>綠色(6.75%)>黃色(6.53%)[7]；另外，不同色型(紫、黃、白)瑪咖在抗疲勞、降血脂、抗氧化、增強(qiáng)免疫等方面的效果也存在差異，其中紫色瑪咖效果最好，白色瑪咖效果較差[8]。徐梓荷[9] 49-62研究了云南產(chǎn)不同色型和產(chǎn)地瑪咖對(duì)性功能效果的影響，結(jié)果表明不同產(chǎn)地效果大小排序?yàn)椋簳?huì)澤>麗江>秘魯；不同顏色效果大小排序?yàn)椋汉谏斂?紫色瑪咖>黃色瑪咖。

機(jī)體功能的發(fā)揮與機(jī)體內(nèi)能量代謝緊密相關(guān)，而哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)途徑和腺苷酸活化的蛋白激酶(AMP activated protein kinase, AMPK)途徑在細(xì)胞內(nèi)共同構(gòu)成一個(gè)能量合成與分解代謝的開關(guān)[10]。在營(yíng)養(yǎng)充足的情況下，ATP的合成增加，mTOR被激活，磷酸化一系列蛋白底物，刺激細(xì)胞利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[11]。而mTOR-AMPK信號(hào)通路又受上游營(yíng)養(yǎng)因子、生長(zhǎng)因子和能量等刺激的影響，而瑪咖對(duì)機(jī)體內(nèi)能量代謝是否有影響，以何種細(xì)胞刺激信號(hào)進(jìn)行，尚不清楚。本試驗(yàn)擬研究云南產(chǎn)不同色型瑪咖對(duì)SD雌性大鼠機(jī)體能量代謝的影響及機(jī)理，以期為瑪咖的應(yīng)用與開發(fā)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD雌性大鼠：體重150～160 g，40只，動(dòng)物許可證號(hào) SCXK (渝)20120008，重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司；

基礎(chǔ)飼料：重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司；

瑪咖：云南省剛捷生物科技有限公司；

RNase Inhibitor(RNA酶抑制劑)：美國(guó)普洛麥格公司；

胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1) Elisa試劑盒、胰島素(InS) Elisa試劑盒：上海橋杜生物科技有限公司；

肝/肌糖原測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所；

M.MLV反轉(zhuǎn)錄酶：美國(guó)普洛麥格公司；

熒光定量試劑/膜/板子、SYBR Green Supermix：美國(guó)Bio-Rad公司；

Trizol：美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微量紫外分光光度：Nano Drop 2000型，美國(guó) Thermo 公司；

冷凍離心機(jī)：3-18k型，德國(guó)Sigma公司；

熒光定量 PCR 儀：Light Cycler Nano型，美國(guó)羅氏公司；

梯度PCR儀：S1000型，美國(guó)Bio-Rad公司；

全自動(dòng)生化分析儀：HITACHI-7020型，日本株式會(huì)社日立制作所；

全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行：L-8800型，日本株式會(huì)社日立制作所；

酶標(biāo)儀：H1MG型，美國(guó)基因有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)樣品的制備與劑量確定 將瑪咖切片后于50 ℃烘干至恒重，經(jīng)中藥粉碎機(jī)粉碎后過150 目篩。取瑪咖干粉6 g溶于1%羧甲基纖維素鈉溶液并定容至50 mL，即得0.12 g/mL 樣品懸浮液，4 ℃保存?zhèn)溆肹9]51[12]。

瑪咖成人每日推薦攝入量為25 g，中國(guó)人均體重60 kg[13]，即成人每日用瑪咖劑量為0.42 g/kg·BW[12,14]。

1.3.2 動(dòng)物分組和飼養(yǎng) 將40只SD雌性大鼠按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照、黑瑪咖、紫瑪咖、黃瑪咖、白瑪咖組，每組8只。每只大鼠獨(dú)立飼養(yǎng)于不銹鋼籠(25 cm×15 cm×15 cm)里，動(dòng)物房溫度控制在(25±1) ℃，相對(duì)濕度55%，晝夜循環(huán)周期12 h，試驗(yàn)組每日灌胃0.42 g/kg·BW的1%羧甲基纖維素鈉瑪咖干粉(150目)懸浮液，空白組灌胃等體積1%羧甲基纖維素鈉溶液，飼養(yǎng)期間自由采食基礎(chǔ)飼料和飲水，每天記錄大鼠采食量，每3 d稱重1次，同時(shí)調(diào)整灌胃量，喂養(yǎng)28 d，禁食12 h后稱重[12]。用乙醚麻醉后，斷頭，用含有肝素鈉的采血管采血，4 000 r/min、4 ℃離心15 min后，-80 ℃ 凍存，備用。采完血后，快速將大鼠解剖，用4 ℃生理鹽水清洗肝臟、骨骼肌、腎臟等組織表面血水，用吸水紙擦干，稱總重；稱取肝臟組織約100 mg，置于2 mL無(wú)RNA酶的微型離心管中，液氮速凍后，-80 ℃凍存，備用。

1.3.3 腹脂率和相對(duì)組織重的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[15]，按式(1)、(2)計(jì)算腹脂率和相對(duì)組織質(zhì)量。

(1)

(2)

式中：

c1——腹脂率，%；

c2——相對(duì)組織質(zhì)量，%；

m1——附睪周圍脂肪質(zhì)量，g；

m2——腎臟周圍脂肪質(zhì)量，g；

m3——組織質(zhì)量，g；

m——活體質(zhì)量，g。

1.3.4 生理生化指標(biāo)分析 采用尾部靜脈采血，血糖儀測(cè)定其空腹血糖；肝/肌糖原采用蒽酮比色法測(cè)定，具體操作按試劑盒操作說明書進(jìn)行；胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 (IGF-1)采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定，操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行；血清及組織中氨酸含量采用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定。

1.3.5 肝臟中關(guān)鍵基因qRT-PCR分析 根據(jù)文獻(xiàn)[15]修改如下，利用Qiagen試劑盒提取和反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，RNA濃度和純度(OD260 nm/OD280 nm)采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定；實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定各組織mRNA含量；內(nèi)參基因?yàn)棣?肌動(dòng)蛋白(ACTB)，qRT-PCR引物序列見表1。qRT-PCR在實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行分析。10 μL的qRT-PCR反應(yīng)體系包含：4.2 μL SYBR Green Supermix，4.2 μL DEPC水，100 ng/μL cDNA模板1.0 μL，20 μmol/L上、下游引物各0.3 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；40次循環(huán)包含95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s；65 ℃ 5 s；95 ℃ 5 s。每個(gè)樣品均設(shè)置3次重復(fù)。

表1 各基因引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果以mean±SD表示，各組間比較采用單因素方差分析，用Duncan法分析顯著性，P<0.05被認(rèn)為有顯著差異，各組間差異顯著性采用SPSS 21.0軟件分析，Origin 9作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 瑪咖對(duì)試驗(yàn)大鼠生長(zhǎng)的影響

由表2可知，與空白對(duì)照組相比，試驗(yàn)組大鼠體重均有增加趨勢(shì)，其中黑瑪咖、紫瑪咖和黃瑪咖對(duì)試驗(yàn)大鼠體重的增加量影響顯著(P<0.05)；試驗(yàn)組大鼠相對(duì)骨骼肌均有增加趨勢(shì)，其中黑瑪咖和紫瑪咖效果顯著(P<0.05)，而對(duì)肝臟和腎臟相對(duì)重量的影響不顯著(P>0.05)；各試驗(yàn)組均有降低腹脂率的趨勢(shì)，提示瑪咖可能通過調(diào)節(jié)能量分配來改變?cè)囼?yàn)大鼠胴體的組成。

2.2 瑪咖對(duì)試驗(yàn)大鼠生理生化指標(biāo)的影響

瑪咖對(duì)試驗(yàn)大鼠血糖和糖原含量的影響見表3。血糖和糖原水平在一定程度上反映了機(jī)體能量代謝的狀態(tài)[16]。在動(dòng)物體內(nèi)，機(jī)體各組織細(xì)胞的活動(dòng)及功能的發(fā)揮所需能量主要來源于血糖，而糖原是機(jī)體內(nèi)糖的儲(chǔ)存形式，在機(jī)體血糖降低時(shí)，肝糖原可迅速分解，以維持機(jī)體血糖水平的穩(wěn)定[17]。試驗(yàn)結(jié)果表明，瑪咖對(duì)試驗(yàn)大鼠血糖的影響不顯著，但可增加肝糖原含量的趨勢(shì)，其中黑瑪咖、紫瑪咖增加量顯著(P<0.05)，可能與瑪咖中含有大量的多肽有關(guān)?，F(xiàn)有研究[18-20]表明，瑪咖多肽可促進(jìn)小鼠肝內(nèi)糖質(zhì)新生，從而提高其肝糖原的儲(chǔ)備。而體內(nèi)糖原的儲(chǔ)備水平，可直接影響機(jī)體的抗疲勞和運(yùn)動(dòng)能力[21-22]。Ins和IGF-1在機(jī)體肝臟、肌肉及脂肪組織中對(duì)糖、脂肪、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝和貯存起作關(guān)鍵作用[23]。灌胃瑪咖后各試驗(yàn)組大鼠血清中Ins和IGF-1的含量變化均不顯著(P>0.05)?？芍?，Ins/IGF-1并非灌胃瑪咖促進(jìn)機(jī)體能量代謝的主要信號(hào)因子。

表2 瑪咖對(duì)試驗(yàn)大鼠生長(zhǎng)的影響?

? 同列a,b,c表示各組之間存在顯著差異(P<0.05)。

表3 瑪咖對(duì)試驗(yàn)驗(yàn)大鼠血糖和糖原含量的影響?

? 同列a,b,c表示各組間存在顯著差異(P<0.05)。

2.3 瑪咖對(duì)試驗(yàn)大鼠血清和肝臟中氨基酸含量的影響

瑪咖對(duì)試驗(yàn)大鼠血清和肝臟中氨基酸含量的影響見表4、5。生糖氨基酸可在機(jī)體內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化為葡萄糖，并供能。與空白對(duì)照組比，黑瑪咖和紫瑪咖可顯著(P<0.05)血清中Asn、Arg和Ser的含量。另外，各試驗(yàn)組均有增加血清中Gln 的趨勢(shì)，但不顯著(P>0.05)?，斂Э稍黾釉囼?yàn)大鼠肝臟中Asp、Ser、Thr和Ala的含量，其中黑瑪咖和紫瑪咖可顯著(P<0.05)增加試驗(yàn)大鼠肝臟中Asp、Ser、Thr和Ala的含量；對(duì)其它各種檢測(cè)到的氨基酸含量影響不顯著(P>0.05)。黑瑪咖和紫瑪咖增加試驗(yàn)大鼠血清和骨骼肌中生糖氨基酸，多為非必需氨基酸。在機(jī)體內(nèi)，非必需氨基酸可由體機(jī)相應(yīng)的α-酮酸自身合成或者蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)生。

當(dāng)機(jī)體能量充足時(shí)，氨基酸通常很少或不參與供能，而作為蛋白質(zhì)合成原料，增加機(jī)體蛋白質(zhì)合成[24]，這與黑瑪咖和紫瑪咖可提高大鼠骨骼肌相對(duì)重量的結(jié)果相吻合。支鏈氨基酸(Branched-chain amino acid, BCAA)包括Leu、Ile 和Val?，F(xiàn)有研究[25]表明，支鏈氨基酸不但是必需氨基酸，也是功能性氨基酸。本試驗(yàn)結(jié)果表明，各試驗(yàn)組瑪咖均可有上調(diào)試驗(yàn)大鼠血清和骨骼肌中Leu和Val的含量。而亮氨酸可刺激mTOR信號(hào)通路[26]，從而啟動(dòng)mTORC1 ser2448磷酸化[27]。

表4 瑪咖對(duì)試驗(yàn)大鼠血清中氨基酸含量的影響?

? 同列a,b,c表示各組間存在顯著差異(P<0.05)。

表5 瑪咖對(duì)試驗(yàn)大鼠肝臟中氨基酸含量的影響?

? 同列a,b,c表示各組間存在顯著差異(P<0.05)。

2.4 瑪咖對(duì)試驗(yàn)大鼠肝臟組織中能量代謝關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)量的影響

瑪咖對(duì)試驗(yàn)大鼠肝臟組織中能量代謝關(guān)鍵基因mRNA的影響見圖1。能量代謝平衡調(diào)控是由多個(gè)與之相關(guān)的信號(hào)通路所介導(dǎo)，其中AMPK信號(hào)通路和mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞內(nèi)共同構(gòu)成一個(gè)合成代謝和分解代謝過程的開關(guān)。當(dāng)機(jī)體[AMP]/[ATP]比值升高，可激活 LKB1，通過激活A(yù)MPK-TSC2，抑制mTOR活性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，各試驗(yàn)組均顯著 (P<0.05)上調(diào)試驗(yàn)大鼠肝臟mTORmRNA表達(dá)量；有上調(diào)AKTmRNA表達(dá)量的趨勢(shì)，其中黑瑪咖和紫瑪咖上調(diào)顯著(P<0.05)。而對(duì)AMPK、LKB1 mRNA表達(dá)量的影響不顯著(P>0.05)。氨基酸和葡萄糖等能量底物通過三羧酸循環(huán)改變細(xì)胞內(nèi)AMP和ATP的比例，能量水平降低時(shí)，v-ATPase-Ragulator接近LKB1 從而激活A(yù)MPK；能量水平較高時(shí)，mTORC1與之結(jié)合并被激活，開啟合成代謝通路。同時(shí)，AMPK 是mTOR通路上游主要的激酶，被激活后能磷酸化TSC2蛋白，下調(diào)Rheb-GTP，從而抑制mTORC1活性；也可磷酸化接頭蛋白R(shí)aptor從而阻礙Raptor與mTOR的結(jié)合[28]。另外，BCAA還可激活PI3K，進(jìn)而磷酸化AKT(ser437)，激活mTORC1[29-30]，也可直接作用于mTOR，使mTOR活化[31-32]。綜合以上結(jié)果表明，支鏈氨基酸是灌胃不同色型瑪咖激活mTOR的信號(hào)因子。

圖1 瑪咖對(duì)試驗(yàn)大鼠肝臟組織中能量代謝關(guān)鍵基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響

Figure 1 Effects of Maca on mRNA levels of key genes of energy metabolism in the liver of rats (n=8)

3 結(jié)論

食用瑪咖可通過調(diào)節(jié)能量分配來改變機(jī)體的組成，其機(jī)理可能是通過BACC作用于mTOR，使mTOR活化；可能存在以下信號(hào)通路：① BACC激活PI3K后使AKT(ser 437) 磷酸化，激活 mTORC1；② BACC直接作用于mTOR；③ 以上2種情況并存。其中黑瑪咖和紫瑪咖對(duì)機(jī)體能量代謝的影響效果顯著(P<0.05)高于黃瑪咖和白瑪咖。

本試驗(yàn)僅從mRNA水平進(jìn)行了探索，下一步將從蛋白質(zhì)水平、細(xì)胞水平、腸道健康、瑪咖粉碎粒度，及食用時(shí)間對(duì)機(jī)體能量代謝的影響及機(jī)理進(jìn)行深入研究。