茶葉提取物體外抗氧化活性與其功能性成分含量的相關性研究

李 丹曹 永王 華馮云子伍錦鳴趙謀明

(1. 廣東中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，廣東 廣州 510385；2. 華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640)

飲茶及茶文化在中國已有數(shù)千年的歷史。中國茶葉品種齊全，資源豐富，是世界上主要的茶葉生產(chǎn)、出口國。根據(jù)發(fā)酵的情況，茶葉可分為不發(fā)酵茶(綠茶、白茶)、半發(fā)酵茶(烏龍茶)、全發(fā)酵茶(紅茶)及后發(fā)酵茶(黑茶)等[1]。茶作為世界三大飲品之一，不僅口感佳、熱量低，且具有諸多保健功能，如抗氧化[2-3]、抗動脈硬化[4-5]、抗菌抗病毒[2]、護肝明目[3]和保護神經(jīng)[6]等。將茶葉經(jīng)過一定工藝制得提取物能強化其保健功效，通過提取工藝充分利用低質(zhì)的茶末、茶碎等茶原料，可以增加產(chǎn)業(yè)附加值。

機體內(nèi)自由基的大量存在是引發(fā)心血管疾病、機體老化及癌癥等疾病的重要原因，而隨著人們健康綠色環(huán)保意識的增強，食源性天然抗氧化劑的研究與開發(fā)具有重要意義，應用前景廣闊。研究表明茶葉及其提取物具有良好的抗氧化能力[7]，但研究多集中在水溶性組分[8]，對其醇提物涉及較少。而且在茶葉活性物質(zhì)的研究工作中[6-7]，多集中在多酚的定量，然而其抗氧化活性物質(zhì)在真實體系中的貢獻大小仍不清楚。重組模型驗證的思路來源于近年來興起的分子感官組學研究系統(tǒng)[9]，常用于香氣活性物質(zhì)的研究，通過重組構建體系判斷香氣活性物質(zhì)鑒定的全面性和活性貢獻特點非常實用[10]，然而采用重組模型驗證茶葉功能活性貢獻大小的研究未見報道。

本研究對比分析不同發(fā)酵類型的茶葉醇提物及水提物的功能性成分差異，以氧自由基的吸收能力(ORAC)和DPPH自由基的清除能力為指標，比較各樣品體外抗氧化活性，并建立活性指標與功能性組分含量的相關性，通過重組模型確定其中關鍵活性成分對總抗氧化活性的貢獻能力，旨在為新型天然抗氧化劑的開發(fā)及茶葉綜合利用價值的提高提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 原料

3種茶樣：分別自其產(chǎn)區(qū)購買，詳見表1。

表1 茶葉樣品信息

1.2 儀器

旋轉蒸發(fā)器：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

電子天平：EL 204/EL3002型，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-800KDE型，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；

調(diào)溫電熱器：Q/320683AAFA02-2005型，5 000 mL，上海蘇進儀器設備廠；

搖擺式中藥粉碎機：DFY-500型，溫嶺市林大機械有限公司；

循環(huán)水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

色譜柱：XBridge C18(5 μm，150 mm×4.6 mm)型，美國Waters公司；

高效液相色譜儀：Waters-600型，美國Waters公司；

多功能酶標儀：Varioskan Flash型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

紫外可見分光光度計：UV-2100型，上海尤尼柯UNIC科學儀器有限公司。

1.3 試劑

濃硫酸、沒食子酸、抗壞血酸、鹽酸、乙醇、冰乙酸、苯酚、福林酚試劑、無水碳酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·2Na)、十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、二水合磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、葡萄糖：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

咖啡堿標準品：純度>98%，廣州鼎國生物技術有限公司；

熒光素鈉：純度>99%，上海源葉生物科技有限公司；

甲醇、乙腈：色譜級，德國Merck公司；

1,1-二苯基-三硝基苯肼(DPPH)、水溶性維生素E(Trolox)、谷氨酸、2,2’-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、兒茶素(C)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、沒食子兒茶素(GC)、沒食子酸(GA)標準品：純度>98%，美國Sigma公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品制備 將茶樣粉碎過40目篩，稱取50 g茶粉，加入80%乙醇或蒸餾水[料液比為1∶12 (g/g)]，加熱回流提取2 h。冷卻后過濾，濾液采用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至100 mL左右，制得茶醇提物及水提物于4 ℃貯藏備用。

1.4.2 茶提物浸提得率測定 參照GB 50093—2010中恒重法，按式(1)計算得率。

(1)

式中：

c——茶葉提取物浸提得率，%；

m1——濃縮液干物質(zhì)總重量，即濃縮液質(zhì)量×干物質(zhì)含量，g；

m2——茶葉干重，g。

1.4.3 茶提物主要功能性成分含量測定

(1) 茶多酚含量測定：采用福林酚比色法，按GB/T 8313—2008執(zhí)行。

(2) 茶多糖含量測定：采用苯酚-硫酸法[11]。

(3) 游離氨基酸含量測定：采用水合茚三酮比色法，按GB/T 8314—2013執(zhí)行。

(4) 兒茶素、咖啡堿、沒食子酸(GA)含量測定：采用高效液相法，按GB/T 31740.2—2015執(zhí)行。

1.4.4 DPPH 自由基清除能力測定 根據(jù)Zheng等[12]的方法，修改如下：取2 mL茶提物或標準品混合物稀釋液與2 mL DPPH乙醇溶液(0.2 mmol/L)渦旋混勻，靜置常溫避光反應30 min后，于波長517 nm處測定吸光度(Asample)。取2 mL無水乙醇與2 mL樣液混合測得吸光值為Ablank，以等量無水乙醇代替茶樣測得吸光值標記為Acontrol，該研究以Trolox作為陽性對照。DPPH自由基清除率按式(2)計算：

(2)

式中：

C——DPPH清除率，%；

Asample——樣品(樣品與DPPH乙醇溶液)的吸光值；

Ablank——空白樣品(乙醇與茶提物樣液)的吸光值；

Acontrol——對照組(乙醇與DPPH乙醇溶液)的吸光值。

將樣品濃度與其對應的自由基清除率進行擬合，建立線性回歸方程。清除率為50%對應的樣品或陽性對照的濃度即為IC50值。

1.4.5 氧自由基清除能力(ORAC值)測定 根據(jù)Lin等[11]的方法，修改如下：用pH 7.40磷酸鹽緩沖液(75 mmol/L)溶解和稀釋AAPH、熒光素鈉鹽、Trolox及待測樣品至相應濃度。在96孔板的微孔中依次加入25 μL茶提取物稀釋液/標準品混合物、pH 7.40的磷酸鹽緩沖液或Trolox標準液，7 nmol/L 的熒光素溶液75 μL。將96孔板在37 ℃下進行10 min 孵育后，加入AAPH溶液(12.8 mmol/L)100 μL，采用酶標儀開始計時反應并讀數(shù)(激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長538 nm)，反應時間120 min，每1 min 讀1次，共讀數(shù)121次。曲線下方的面積按式(3)計算：

AUC=0.5×(f0+f121)+(f1+f2+……+f120)，

(3)

式中：

AUC——曲線下方的面積；

f0——初始熒光強度，a.u.；

fi——第imin時的熒光強度，a.u.。

NetAUC=AUCsample-AUCblank，其中Trolox濃度與相應的Net AUC呈正比可建立方程，將樣品Net AUC代入方程，即得ORAC值。茶提物的ORAC值單位設為每克干物質(zhì)相當于Trolox的量(μmol TE/g·DW)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗結果以“均值±標準偏差”表示(n≥3)。采用Microsoft Excel 2013作圖，SPSS 20.0軟件進行相關性分析和單因素方差分析(P<0.05)。

2 結果與討論

2.1 不同茶類提取物浸提得率及功能性成分分析

不同茶類醇提物及水提物浸提得率及主要功能性成分含量見表2。不同茶類提取物(tea extracts, TE)浸提得率具有顯著差異(P<0.05)。紅碎茶和普洱熟茶水提物的得率高于醇提物的，而信陽毛尖則是醇提物較高，可能是信陽毛尖為綠茶，其中茶多酚含量高，同時茶多酚在80%乙醇中比純水中的溶解度大，提高了其醇提物的提取得率。醇提物及水提物中得率高低順序都為：信陽毛尖>普洱熟茶>紅碎茶，其中最高的為信陽毛尖醇提物(36.89%)。各主要功能性組分中茶多酚含量最高，茶多糖及咖啡堿次之，沒食子酸、蛋白質(zhì)和氨基酸含量較少。

表2 不同茶提取物得率及其功能成分含量?

? 同列肩標字母不同表示數(shù)據(jù)間存在顯著性差異(P<0.05)。

3種茶的醇提物茶多酚含量都顯著高于其水提物，表明茶多酚在80%的乙醇溶液中溶解度更高。信陽毛尖2種提取物中的茶多酚含量都顯著高于普洱熟茶及紅碎茶，其中最高的為信陽毛尖醇提物(474.91 mg/g·DW)，這與各類茶的加工工藝有關。綠茶加工過程中經(jīng)過殺青，使過氧化酶和多酚氧化酶等酶系失活，茶多酚不被氧化而損失。李大祥等[13]研究表明采用相同原料制得綠茶和紅茶，綠茶的茶多酚含量基本不變而紅茶則顯著下降。而普洱熟茶渥堆工藝中濕熱的環(huán)境和微生物作用也會導致酚類物質(zhì)含量減少[14]。

信陽毛尖、紅碎茶及普洱熟茶水提物中茶多糖含量顯著高于醇提物，分別是醇提物中的1.94，1.87，3.05倍，表明水提法能將茶多糖更充分地提取出來。水提物中茶多糖含量從高到低排序為：普洱熟茶>紅碎茶>信陽毛尖，且普洱茶水提物中的茶多糖含量(240.3 mg/g·DW)顯著高出紅碎茶和信陽毛尖(P<0.05)，這與黑茶后發(fā)酵過程中大量微生物作用促進茶葉中多糖分解為可溶性糖有關[15]。

提取物中咖啡堿含量在2種提取工藝中的高低順序一致，均為：普洱熟茶>紅碎茶>信陽毛尖，咖啡堿為嘌呤堿雜環(huán)結構，較為穩(wěn)定，隨發(fā)酵的進行降低并不顯著，因此咖啡堿主要取決于原料中的含量[16]。沒食子酸是茶多酚的結構組成單元，也是具有生理活性的簡單酚類化合物[17]，2種提取物中普洱茶的沒食子酸含量皆最高。茶葉醇提物中蛋白質(zhì)含量比水提取中高，但總體含量較低，是由于茶葉80%的蛋白質(zhì)主要為難以溶解的谷蛋白，而可溶性的主要為醇溶谷蛋白[18]。氨基酸在水提物中含量顯著高于醇提物，且水提物中信陽毛尖、紅碎茶的茶氨酸含量分別為普洱茶的5.18，4.03倍，這主要是黑茶工藝中的“渥堆作用”導致大量茶氨酸被破壞，含量急劇降低[19]。

不同茶提取物中5種兒茶素的定量結果見表3。兒茶素是茶葉多酚類物質(zhì)的主體成分，約占茶多酚總量的70%～80%[17]，由表3可知，茶多酚含量與兒茶素總量存在極顯著相關性(P<0.01)，相關系數(shù)為0.928，說明兒茶素總量在各茶類中的變化趨勢與茶多酚一致。醇提物中兒茶素總量顯著高于水提物(P<0.05)，其中信陽毛尖醇提物兒茶素總量最高(451.88 mg/g·DW)。紅碎茶與普洱熟茶的醇提物及水提物的兒茶素總量都無顯著差異，僅為信陽毛尖2種提取物總量的1/7及1/3。不同茶類加工工藝不同是造成兒茶素含量差異顯著的主要原因。關于紅茶工藝的研究[20]結果表明，揉切和發(fā)酵過程會使兒茶素含量減少近75%。茶葉的酯/簡比值(酯型兒茶素：簡單兒茶素)越高其相應的功能活性越強，信陽毛尖的醇提物和水提物及紅碎茶醇提物酯/簡比值都高于1，分別為3.88，1.43，1.14，表明可能具有較強的活性，酯型兒茶素的保健功能較強，具有抗氧化、抗腫瘤、保護神經(jīng)心腦血管、代謝酶干預、免疫內(nèi)分泌等作用[21]，其中又以EGCG和EGC的活性較高[22]。

表3 不同茶提取液中兒茶素組分及含量?

? “酯/簡”表示酯型兒茶素含量與簡單兒茶素含量的比值；同列上標字母不同表示數(shù)據(jù)存在顯著性差異(P<0.05)。

2.2 不同茶類提取物的抗氧化活性分析

2.2.1 氧自由基吸收能力 氧自由基吸收能力法是Cao等[23]在Glazar[24]的研究基礎上建立起來的一種評價樣品總抗氧化活性的化學方法，具有靈敏高，適用性廣泛等特點。ORAC法根據(jù)自由基破壞熒光探針導致熒光強度變化的原理，以Trolox為定量標準、熒光素鈉為熒光物質(zhì)、AAPH為過氧自由基來源。當抗氧化劑對ROO自由基作用時會引發(fā)熒光強度變化，采用熒光酶標儀測定抑制作用變化過程。如表4所示，不同茶類醇提物的ORAC值都顯著高于其相應水提物的，說明醇提物的氧自由基吸收能力更強。醇提物中3種茶類的ORAC值具有顯著差異，其大小順序為：信陽毛尖>普洱熟茶>紅碎茶。徐維盛等[25]采用ORAC法比較16種茶葉的抗氧化能力發(fā)現(xiàn)綠茶>黑茶>紅茶，與本研究結果一致。而3種茶類的水提物都有一定氧自由基吸收能力但無顯著差異(P>0.05)。

2.2.2 對DPPH自由基的清除能力 20世紀50年代末由Marden Blois[26]提出的DPPH自由基清除能力法，目前已發(fā)展成為評價和篩選化合物及天然提取物體外抗氧化能力的常用方法。不同茶類提取物的DPPH自由基的的半數(shù)清除率(IC50)見表5。提取物濃度與其對應的DPPH自由基清除作用存在良好的線性關系(相關系數(shù)為0.993～0.997)。

表4 不同品種茶葉提取液ORAC值?

? 同列肩標字母不同表示數(shù)據(jù)存在顯著性差異(P<0.05)。

不同茶類的醇提物IC50值顯著低于其對應的水提物，說明醇提物具有更強的DPPH自由基清除能力。與對照組相比，僅有信陽毛尖醇提物的DPPH自由基清除能力顯著高于Trolox。2種提取物中各類茶的IC50值具有顯著差異(P<0.05)，且大小順序一致：信陽毛尖>普洱熟茶>紅碎茶。周金偉等[27]測定各類茶的DPPH自由基的清除能力發(fā)現(xiàn)不發(fā)酵茶抗氧化能力明顯強于發(fā)酵茶，與本研究結果一致，這表明抗氧化能力受加工工藝的影響。

2.2.3 體外抗氧化活性與其功能性成分含量的相關性分析

不同茶提物中主要功能性成分含量與體外抗氧化能力(ORAC及1/IC50值)的相關性見表5。茶多酚含量與茶提物的ORAC及DPPH值呈顯著正相關(P<0.05)，相關系數(shù)分別是0.897及0.914，表明茶多酚含量越高，茶提物對氧自由基與DPPH自由基的清除能力越強，此結果與陳雪[28]的研究相符。兒茶素為茶多酚中的主體成分，5種主要兒茶素總量與ORAC值及1/IC50值呈極顯著正相關(P<0.01)，其中ECG含量與ORAC及1/IC50都呈極顯著相關性(P<0.01)，EGC、EC與ORAC值呈極顯著相關性(P<0.01)，而與1/IC50呈顯著相關(P<0.05)。EGCG則與2個抗氧指標都有顯著相關性(P<0.05)。值得注意的是，兒茶素的酯/簡與ORAC和1/IC50呈顯著相關性(P<0.05)，說明酯/簡比值越高其相關的抗氧化能力越強，而酯型兒茶素(特別是ECG)的含量是影響茶提物中氧自由基及DPPH自由基清除能力的重要因素。

表5 茶葉提取液DPPH自由基清除活力?

? 同列肩標字母不同表示數(shù)據(jù)間存在顯著性差異(P<0.05)。

表6 茶提取物中功能成分含量與體外抗氧化能力的相關系數(shù)?

Table 6 Relationship between the functional components contents and the anti-oxidant activities

成分相關系數(shù)ORAC1/IC50茶多糖-0.543-0.712茶多酚0.897*0.856*蛋白質(zhì)0.5230.667沒食子酸-0.465-0.550咖啡因0.1070.151茶氨酸-0.384-0.393兒茶素總量0.944**0.918**EGC0.946**0.882*C0.6960.757EGCG0.815*0.885*EC0.922**0.841*ECG0.921**0.936**酯/簡0.886*0.894*

? *表示在P<0.05水平上差異顯著，**表示在P<0.01水平上差異顯著。

2.2.4 體外抗氧化活性與兒茶素、沒食子酸含量的關系 根據(jù)以上分析結果，試驗獨立選取相關性較高的5種兒茶素和沒食子酸標品，并根據(jù)其在各茶提物中的含量(表2、3)進行復配，得到標品混合物STE。通過測定并比較TE及STE的ORAC、DPPH值，進一步探究5種兒茶素和沒食子酸對樣品抗氧化能力的貢獻作用，ORAC和DPPH的貢獻率分別按式(4)、(5)計算：

(4)

(5)

式中：

R1——ORAC的貢獻率，%；

R2——DPPH的貢獻率，%；

ORACSTE——標品混合物的ORAC值；

ORACTE——茶葉提取物的ORAC值；

DPPHSTE——標品混合物的DPPH值；

DPPHTE——茶葉提取物的DPPH值。

由圖1可知，3種茶的STE-E及STE-W的ORAC值較其相應的茶提物差異顯著。信陽毛尖STE-E的ORAC值貢獻率最高，達90.08%，說明信陽毛尖醇提物中的5種兒茶素及沒食子酸為其氧自由基清除能力的主要貢獻體。而作為發(fā)酵茶的紅碎茶和普洱熟茶的STE-E貢獻率分別僅為45.94% 及45.13%，不超過50%。說明通過發(fā)酵或后發(fā)酵工藝后，一方面兒茶素的含量會隨著發(fā)酵的進行而減少，所以茶提物中兒茶素及沒食子酸的抗氧化貢獻明顯減少，另一方面，通過發(fā)酵和后發(fā)酵過程會生成其他具有抗氧化活性的物質(zhì)。屠幼英等[29]發(fā)現(xiàn)，紅茶中多酚氧化產(chǎn)物茶黃素具有較好的抗氧化活性。

TE-E、TE-W分別指茶葉醇提物及水提物；STE-E、STE-W分別指根據(jù)茶醇提物及水提物中的成分含量配制成的標準品混合物(含C、EC、ECG、EGC、EGCG及沒食子酸)

圖1 不同品種茶葉提取液及相應標品混合物的ORAC值

Figure 1 The ORAC value of different tea extracts and the corresponding standard mix

由圖2可知，3種茶的STE-E及STE-W的DPPH值較其相應的茶提物差異顯著，其中信陽毛尖STE-E對茶提物的抗氧化性貢獻率最高，達61.31%，而紅碎茶STE-E最低，僅為23.30%。而水提物中3種茶的STE-W的DPPH值貢獻率差異不大(34.57%～43.44%)。6種STE中僅有信陽毛尖STE-E貢獻率超過50%，說明茶提物中除5種兒茶素及沒食子酸外，其他功能性物質(zhì)對DPPH的清除也起了重要作用。同時茶葉工藝的不同也影響茶類STE-E的貢獻率，不發(fā)酵茶中兒茶素及沒食子酸的貢獻率明顯大于發(fā)酵茶提物。

TE-E、TE-W分別指茶葉醇提物及水提物；STE-E、STE-W分別指根據(jù)茶醇提物及水提物中的成分含量配制成的標準品混合物(含C、EC、ECG、EGC、EGCG及沒食子酸)

圖2 不同品種茶葉提取液及相應標品混合物的DPPH自由基清除能力

Figure 2 The values of different tea extracts and the corresponding standard mix for scavenging DPPH free radicals

3 結論

試驗結果表明，3種茶類醇提物及水提物的組分含量和抗氧化活性差異顯著。醇提物中茶多酚(信陽毛尖>普洱熟茶>紅碎茶)、咖啡因及蛋白質(zhì)的含量較高，而水提物中以茶多酚、茶多糖(普洱熟茶>紅碎茶>信陽毛尖)及茶氨酸為主，這些差異與原料來源及茶葉加工工藝有關。兒茶素總量與茶多酚含量呈極顯著相關(P<0.01)，信陽毛尖的2種提取物與紅碎茶醇提物的兒茶素酯/簡值>1。3種茶類的醇提物對氧自由基吸收及DPPH自由基清除能力都比其水提物強，且3種茶類醇提物的ORAC值與IC50值的大小趨勢一致為：信陽毛尖>普洱熟茶>紅碎茶。DPPH和ORAC結果與提取物中茶多酚含量、兒茶素單體(ECG、EC、EGC、ECGC)、兒茶素總量和酯/簡值都呈顯著相關性，酯型兒茶素(ECG和EGCG)的含量對DPPH自由基清除能力及ORAC活性具有較大貢獻。兒茶素與沒食子酸標品復配試驗表明，5種兒茶素(ECG、EC、C、EGC、ECGC)和沒食子酸是信陽毛尖茶提物中主要抗氧化組分；而紅碎茶、普洱熟茶因經(jīng)發(fā)酵處理生成其他抗氧化活性組分，亟待進一步研究。