從蘋果皮中提取和分離熊果酸研究

范何宸銳 鄒桂英

摘要：以蘋果（Malus pumila Mill.）皮為原料，以NaOH的乙醇水溶液為溶劑進(jìn)行超聲輔助提取，并采用響應(yīng)面的方法對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，提取液體經(jīng)濃縮，加鹽酸調(diào)節(jié)pH 3.0，過濾，用10%的乙醇水溶液洗滌濾餅、濾餅經(jīng)干燥、石油醚脫脂、乙醇結(jié)晶和重結(jié)晶后，可得到高純度的熊果酸晶體。該工藝所用設(shè)備和原料易得，方法簡單，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，通過該方法可使蘋果皮變廢為寶，減少環(huán)境污染。

關(guān)鍵詞：蘋果（Malus pumila Mill.）皮；熊果酸；提??；分離

中圖分類號：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）11-0079-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.019

Abstract： Apple（Malus pumila Mill.） peel was extracted with ultrasound assistance using ethanol aqueous solution containing NaOH as extracting solvent， the extraction conditions were optimized by response surface method. The extract was concentrated， and its pH was justified to 3.0 with hydrochloric acid. The mixture was filtrated and filter cake was washed with 10% ethanol aqueous solution. The filter cake was dried， and then degreased by petroleum ether. The residue was crystallized and recrystallized in ethanol to obtain ursolic acid crystal. This method was very simple and easy to scale up， which can make apple peel valuable and can reduce environmental pollution.

Key words： Apple（Malus pumila Mill.） peel； ursolic acid； extraction； separation

蘋果（Malus pumila Mill.）的生產(chǎn)和消費(fèi)近年來持續(xù)增長，已成為全球產(chǎn)量第二的水果。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016年中國蘋果產(chǎn)量約為4 380萬t[1]，是世界最大的蘋果生產(chǎn)國和消費(fèi)國，占世界產(chǎn)量的40%左右[2]，其中約30%用于工業(yè)加工，主要用于生產(chǎn)蘋果汁和果脯等。在日常消費(fèi)和加工蘋果時，會產(chǎn)生大量的蘋果皮。如按果皮占果重1%計(jì)算，每年中國蘋果加工廠將產(chǎn)生13.14萬t的蘋果皮，如此數(shù)量驚人的蘋果皮如果不處理好，將產(chǎn)生嚴(yán)重的環(huán)境污染問題[1，2]。蘋果皮中含有豐富的營養(yǎng)成分，如膳食纖維、單糖、蛋白質(zhì)等，可被用作飼料、栽培蘑菇和發(fā)酵酒精等。除此之外，蘋果皮還含有重要的生物活性分子，如果膠、多酚、黃酮和五環(huán)三萜類化合物[3-6]，特別是其中的五環(huán)三萜類化合物，因其具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗腫瘤的作用，引起人們的重視[7，8]。熊果酸（Ursolic acid）是蘋果皮中含量最豐富的五環(huán)三萜類化合物，結(jié)構(gòu)如圖1所示，因?yàn)樗哂型怀龅纳锘钚院退幱脙r值，近年來成為研究熱點(diǎn)[7，9，10]。

本研究以含氫氧化鈉的乙醇水溶液為提取溶劑，通過超聲波輔助提取的方法快速從蘋果皮中提取熊果酸，再利用鹽酸調(diào)pH、過濾、洗滌、干燥、脫脂和結(jié)晶的方法得到高純度的熊果酸晶體，工藝流程如圖2所示，該方法所用試劑價廉易得、工藝簡單，以期為蘋果皮熊果酸提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果購于超市，用削皮刀削皮，蘋果皮干燥并粉碎，過40目篩，備用。

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；色譜級的甲醇購自西隴科學(xué)股份有限公司；二次去離子水，實(shí)驗(yàn)室自制。其余試劑皆為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent儀器有限公司）；KQ-600DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GS12-B電子恒速攪拌器（上海安亭電子儀器廠）；SHZ-ⅢB循環(huán)水式真空泵（臨海市譚氏真空設(shè)備有限公司）；RES2CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、W201B4恒溫浴鍋（上海申生科技有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海東星建材試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；FZ102微型植物粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；BAS124S分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.3 熊果酸的提取

將干燥的蘋果皮粉碎后過篩，收集20～40目的粉末，干燥備用。精密稱取一定量的蘋果皮粉末，加入一定量的含NaOH的乙醇水溶液，稱量，在200 W功率下超聲輔助提取0.5 h，擦干外壁，再稱量，用乙醇補(bǔ)充缺失的質(zhì)量，離心。用注射器抽取一定量上清液，過0.45 μm濾膜進(jìn)行檢測。熊果酸的提取率按以下公式計(jì)算。

選取液固比（A）（mL∶g，下同）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、NaOH與蘋果皮質(zhì)量比（C）作為優(yōu)化因素，按表1所示，采用三因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對超聲輔助提取蘋果皮中熊果酸的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，具體條件組合及對應(yīng)提取率如表2所示。

1.4 蘋果皮中熊果酸分離方法

按圖2所示的工藝流程從蘋果皮中分離熊果酸，各步驟所得樣品中熊果酸的純度，可用樣品中所含熊果酸的質(zhì)量百分比表達(dá)，計(jì)算方法按以下公式進(jìn)行。

1.5 樣品中熊果酸的測定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]，采用HPLC方法進(jìn)行熊果酸含量的測定，以Sepax Bio-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，柱溫30 ℃，以乙腈水溶液（體積比，乙腈∶0.1%磷酸水溶液=90∶10）為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長210 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化從蘋果皮中提取熊果酸

根據(jù)表2中的試驗(yàn)方案和結(jié)果，利用Design-Expert軟件對表2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和回歸，采用二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合，得到的擬合模型：Y=13.549 5+0.035 65×A-31.692 5×B-10.625×C-1.75×10-3×A×B-0.482 5×A×C+10.25×B×C-3.012 5×10-4×A2+18.437 5×B2+238.75×C2。根據(jù)這個回歸模型的結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

模型的F值為11.28，說明模型極顯著，模型的F值只有0.21%的機(jī)率是由試驗(yàn)噪音引起的。模型的Prob>F（0.002 1）小于0.05，說明所用模型是極顯著。失擬項(xiàng)值（3.56）是不顯著的，說明所用模型可用于試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合。在數(shù)學(xué)模型中，只有A和B2為顯著項(xiàng)，故在保證模型多層次性的前提下，剔除模型中不顯著項(xiàng)，對模型進(jìn)行縮減得到Y(jié)=13.487 48+0.022 113×A-31.514 72×B+5.250 00×C-0.482 5×A×C+18.402 78×B2。根據(jù)這個縮減后的回歸模型的結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示。

模型的F值為24.89，說明模型極顯著，模型的F值只有0.01%的機(jī)率是由試驗(yàn)噪音引起的。模型的Prob>F（<0.000 1）遠(yuǎn)小于0.05，這也說明所用模型極顯著。失擬項(xiàng)值（2.07）是不顯著的，說明該模型可以用于試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合。在數(shù)學(xué)模型中，只有A、C和B2為顯著項(xiàng)，AC項(xiàng)較為顯著，B為不顯著項(xiàng)，但為保證模型的多層次性，在模型中仍然保留B項(xiàng)。

由圖3可知，A項(xiàng)與C項(xiàng)的交互作用較弱。根據(jù)縮減后的數(shù)學(xué)模型，利用Design-Expert 軟件優(yōu)化得到最佳的理論提取條件：液固比29.75，乙醇體積分?jǐn)?shù)0.75%，NaOH與原料質(zhì)量比0.005，此條件下理論計(jì)算的提取率為0.802%。根據(jù)理論計(jì)算條件，對試驗(yàn)條件進(jìn)行修正，為液固比30.00，乙醇體積分?jǐn)?shù)0.75%，NaOH與原料質(zhì)量比0.005，依據(jù)此條件，重復(fù)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到熊果酸平均提取率為0.78%，與理論計(jì)算提取率很接近。

2.2 蘋果皮中熊果酸的分離提取

從蘋果中分離提取熊果酸的試驗(yàn)步驟如圖2所示。按上述優(yōu)化后的提取條件，取50 g蘋果皮粉末，加入1 500 mL體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇和0.25 g NaOH，攪拌，超聲輔助提取，抽濾，收集濾液；濾渣按前述方法再提取2次，合并3次的濾液后，提取液濃縮至100 mL；向濃縮液中慢慢加入鹽酸，調(diào)pH=3.0，靜置過夜，抽濾，濾餅用100 mL 10%的乙醇溶液洗滌，烘干得粗產(chǎn)品2.1 g。粗產(chǎn)品用石油醚浸泡，過濾后，取濾餅，干燥后得到熊果酸粗品1.6 g。用52 mL無水乙醇在70 ℃左右攪拌至粗品完全溶解，快速過濾，濾液在室溫下密封靜置冷卻，緩慢結(jié)晶。所得晶體，呈細(xì)針狀，過濾，得到熊果酸晶體0.425 7 g。再用無水乙醇重結(jié)晶得到高純度熊果酸針狀晶體0.22 g。如圖4表示，蘋果皮通過多個步驟的提取和分離過程，成功制備得到無色針狀的熊果酸晶體。對于不同提取和分離階段得到的樣品，采用HPLC的方法對產(chǎn)品中所含熊果酸的含量進(jìn)行了測定。

圖5為各樣品的高效液相色譜圖。由圖5可知，樣品隨分離過程的進(jìn)行，熊果酸峰面積所占比例逐漸提高，說明樣品中熊果酸的含量逐漸上升。通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)石油醚浸泡后的粗品、經(jīng)10%乙醇溶液洗后的粗品、經(jīng)第一次重結(jié)晶和經(jīng)第二次重結(jié)晶得到的熊果酸晶體中熊果酸的含量分別為64.37%、69.05%、75.14%和99.09%。由此發(fā)現(xiàn)，該分離方法非常有效，樣品中熊果酸的含量逐漸提高，最終得到高純度的熊果酸晶體。

3 結(jié)論

以蘋果皮為原料，通過提取、脫脂、洗滌、結(jié)晶和重結(jié)晶后，得到高純度的熊果酸晶體，該工藝所用設(shè)備和原料易得，方法非常簡單，所以易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。另外，通過該方法使蘋果皮變廢為寶，并且可減少亂扔蘋果皮引起的環(huán)境污染。

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