基于生物信息技術(shù)的骨骼肌收縮實驗教學(xué)方法改進路徑探索

馬明月 謝永芳 曾垂省 舒坤賢

摘 要：骨骼肌收縮實驗是生理解剖學(xué)等課程的基礎(chǔ)實驗之一，同時也是生物學(xué)實驗中必須掌握的實驗技術(shù)之一，能夠為以后有關(guān)實驗打下基礎(chǔ)。在進行骨骼肌收縮實驗之前，需要掌握制備坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本的方法，并且標(biāo)本制備質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到骨骼肌收縮實驗現(xiàn)象是否顯著。因此，文章將對影響坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本制備和影響骨骼肌收縮等多方面因素進行考察，并針對問題提出改進方法。

關(guān)鍵詞：腓腸??；收縮；因素；牛蛙

中圖分類號：G642 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2096-000X（2018）03-0086-03

Abstract： The skeletal muscle contracting experiment is one of the basic experiments of physiological anatomy， and one of the fundamental skills in biological experiments. Before the experiment， the method of making sciatic nerve-gastrocnemius specimen whose quality directly exert on experiment results should be mastered. Therefore， this thesis attempts to analyze factors that impact on specimen's making and skeletal muscle， and to put forward improving solutions.

Keywords： gastrocnemius； contraction； factor； rana catesbiana

由重慶郵電大學(xué)生物學(xué)院開設(shè)的《生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實驗》課程，旨在通過對生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)課程的學(xué)習(xí)，使學(xué)生掌握和了解現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的基本實驗方法。同時，培養(yǎng)學(xué)生的觀察力和想象力，使學(xué)生能夠結(jié)合醫(yī)學(xué)工程、生物信息、體育等專業(yè)的需要，認(rèn)識人體作為一個整體，其各部分的功能活動是如何互相協(xié)調(diào)、互相制約，以及如何在復(fù)雜多變的環(huán)境中維持正常的生命活動。本課程提倡建立自己的學(xué)習(xí)方法、學(xué)習(xí)手段的學(xué)習(xí)，而不是局限于書本知識的學(xué)習(xí)，要求學(xué)生在本課程中學(xué)會創(chuàng)新性學(xué)習(xí)的初步方法，培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題的能力以及創(chuàng)新思維和創(chuàng)新能力，為以后的專業(yè)學(xué)習(xí)和終身學(xué)習(xí)打下扎實基礎(chǔ)。

針對《生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實驗》課程中的第一個實驗——坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本制備與不同刺激強度和頻率對骨骼肌收縮的影響，也是大一新生進校后的第一個生物學(xué)實驗，該實驗的地位極其重要。通過多次的實踐教學(xué)，現(xiàn)針對骨骼肌收縮實驗的教學(xué)方法做出提出了部分改進方法。具體探索過程如下：

一、實驗方法

（一）實驗材料

實驗對象：常規(guī)實驗中通常選擇蟾蜍為實驗對象[1， 2]。

實驗試劑為任氏液，也稱為林格氏液，是一種比較接近兩棲類動物內(nèi)環(huán)境的液體。通常用于保持兩棲類動物離體組織器官的生理活性、延長蛙心體外跳動時長等。配置1升任氏液需要的成分劑量如下，首先依次加入32.5ml的20%氯化鈉（NaCL）、1.4ml的10%氯化鉀（KCL）、4.0ml的5%碳酸氫鈉（NaHCO3）、1.0ml的1%磷酸二氫鈉（NaH2PO4）以及2g的葡萄糖粉末（可不加），然后加入1.2ml的10%氯化鈣，最后加蒸餾水直至液體達到1000ml。由于氯化鈣容易引起沉淀，因此需要后加。

實驗器材包括蛙類手術(shù)器械、蛙板、固定針、玻璃分針、鋅銅弓、SMUP-PC生理信號處理系統(tǒng)、肌槽、張力換能器等。鋅銅弓是由鋅片和銅片兩種金屬制成，具有刺激作用，用以檢驗坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本的機能活性。肌槽用于固定坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本。張力換能器通常連接到臺式平衡記錄儀上，描記常規(guī)方法制備肌肉標(biāo)本的收縮情況。SMUP-PC生理信號處理系統(tǒng)集生物信號采集、放大、顯示、記錄與分析為一體，搭配Windows系統(tǒng)的圖文操作界面，在本實驗中用來研究觀察刺激強度與骨骼肌反應(yīng)的關(guān)系實驗、刺激頻率與骨骼肌反應(yīng)的關(guān)系。除此之外，SMUP-PC生理信號處理系統(tǒng)還可以探索蛙心灌流、動脈血壓測定、呼吸運動調(diào)節(jié)等多種實驗。

（二）實驗方法和過程

制備坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本，在制備標(biāo)本之前需要沖洗干凈實驗動物表面的污物，制備標(biāo)本的過程可以分為以下幾個步驟[3，4]。1.雙毀髓法處理實驗對象，先將針尖向前刺入顱腔內(nèi)攪動（單毀髓），再將毀髓針退回枕骨大孔，針尖轉(zhuǎn)向后方，平行刺入椎管內(nèi)搗毀脊髓，完成雙毀髓。實驗動物（蟾蜍或其他蛙類）四肢松軟、呼吸運動消失則說明毀髓成功。2.剝制后肢標(biāo)本，過程如圖1。3.分離兩后肢，如圖2a，使用粗剪刀沿縱向剪開脊柱，并剪斷兩后肢相連的肌肉組織，一只用于當(dāng)前標(biāo)本制備使用，另一只暫時置于任氏液中保存。4.分離坐骨神經(jīng)、游離腓腸肌，如圖2b-c，此過程中全程使用玻璃分針對坐骨神經(jīng)和腓腸肌進行游離，待腓腸肌與其下結(jié)締組織分離后，在其跟腱處穿線、結(jié)扎。5.分離股骨頭，刮凈股骨周圍的肌肉組織，股骨的一半處剪斷。此時一個完整的坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本已經(jīng)制備完成（圖2d），最后使用鋅銅弓輕觸坐骨神經(jīng)，若腓腸肌呈現(xiàn)收縮現(xiàn)象，說明此標(biāo)本制備成功，可用于接下來收縮實驗[5]。

檢驗不同刺激強度、頻率對骨骼肌收縮的影響。第一步，固定標(biāo)本、連接裝置。將標(biāo)本的股骨固定于肌槽中，坐骨神經(jīng)置于刺激電極，腓腸肌上的棉線系于張力換能器的著力點上，調(diào)節(jié)肌槽與換能器之間的位置和距離，使絲線垂直、松緊度合適，使肌肉保持在自然拉長的長度。第二步，考察不同刺激強度、頻率下腓腸肌收縮的情況。打開微機、四路放大器，打開信號處理系統(tǒng)主界面，選擇“骨骼肌單收縮與復(fù)合收縮”程序，模擬不同程度的刺激強度和頻率。肌肉的收縮信號由壓力放大通道輸入處理系統(tǒng)。

二、實驗結(jié)果

（一）刺激強度對腓腸肌收縮的影響

考察不同刺激強度與肌肉收縮力量之間的關(guān)系。蛙類腓腸肌的單收縮全程時間約為0.12秒。因此，間歇性地給予坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本刺激，可以觀察到隨著刺激強度的逐漸增加，腓肌肉收縮強度（即收縮力量）逐漸增強。但是當(dāng)肌肉達到最大收縮后，此后再增加刺激強度，收縮強度（或幅度）將不再增加。最大收縮是指此刺激強度使神經(jīng)干中全部神經(jīng)纖維興奮，其所支配的全部肌纖維全都發(fā)生興奮和收縮[6]。

（二）刺激頻率對腓腸肌收縮的影響

不同刺激頻率與肌肉收縮形式之間的關(guān)系。將刺激強度固定在最適強度，調(diào)整刺激頻率和刺激時間，觀察腓腸肌單收縮、復(fù)合收縮等收縮形式的變化?？梢园l(fā)現(xiàn)當(dāng)相繼兩個刺激的間隔大于單收縮總時程時，腓腸肌出現(xiàn)一連串的單收縮，在收縮波形上呈彼此分開的狀態(tài)（如圖3①）。逐漸增大刺激頻率，當(dāng)兩個或多個相繼刺激間隔小于單收縮的總時程，但大于其收縮期時，肌肉收縮形式為不完全強直收縮，收縮波形呈現(xiàn)出鋸齒狀（如圖3②）。當(dāng)相繼多個刺激的間隔時間小于單收縮的收縮期時，肌肉收縮形式表現(xiàn)為為完全強直收縮[6]，即處于完全的持續(xù)的收縮狀態(tài)，不表現(xiàn)出舒張期的痕跡（如圖3③）。強直收縮的幅度同重大于單收縮的幅度，并且在一定范圍內(nèi)，保持刺激強度和作用時間不變，肌肉的收縮強度（或幅度）隨著刺激頻率的增加而增高，如圖3③和④的高度差異。

（三）其他因素對腓腸肌收縮的影響

本實驗分別在10、11、12月份進行了數(shù)次重復(fù)。發(fā)現(xiàn)10月份實驗過程中腓腸肌收縮現(xiàn)象更加明顯，而12月份的實驗中超過半數(shù)以上的牛蛙腓腸肌未出現(xiàn)任何收縮現(xiàn)象，猜測是由于氣溫降低的緣故。

除此之外，本實驗選擇了從50g～150g重量不等的牛蛙作為實驗對象。從實驗操作和實驗效果綜合來看，80～100g之間的牛蛙比較適合本實驗。

三、教學(xué)方法改進的總結(jié)

蛙類坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本的制備以及腓腸肌收縮實驗在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、體育學(xué)等研究和教學(xué)中具有重要作用，其目的是揭示骨骼肌收縮機制。通過本論文的反復(fù)實驗實踐，我們認(rèn)為此教學(xué)實驗可進行如下改進。

（一）實驗材料的選擇

常規(guī)蛙類坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本制備實驗中通常選擇蟾蜍作為實驗對象，其原因為易養(yǎng)殖、生長期短、價格便宜等。但是，蟾蜍的體表有疣粒，內(nèi)有毒腺。一方面，若實驗操作不規(guī)范存在一定的風(fēng)險性；另一方面，考慮到現(xiàn)在大學(xué)生的成長環(huán)境，對蟾蜍存在一定戒備心理，不利于實驗完成。因此，建議選擇牛蛙作為本實驗的對象。相對來說，牛蛙的取材更加方便，通常本地均可購買到，不受時間、環(huán)境等的限制；而且，牛蛙的表皮更加光滑、無疣粒等結(jié)構(gòu)，相對也更加安全。

關(guān)于實驗對象大小的選擇。若實驗牛蛙過大，缺點是剝制后肢過程中較困難，并且牛蛙的力氣會比較大不利于學(xué)生進行毀髓操作，而優(yōu)點則是離體肌肉的生理活性強。若實驗牛蛙過小，雖有利于剝離后肢，但缺點是必須快速制備標(biāo)本并立刻上機觀察，若耽擱稍久會造成后期收縮觀察不明顯。因此，建議選擇80～100g之間的牛蛙進行實驗。

（二）實驗環(huán)境的要求

當(dāng)實驗溫度維持在25攝氏度左右最佳。當(dāng)溫度過高時，會使骨骼肌在標(biāo)本制備階段處于較為興奮狀態(tài)，影響后期刺激強度、頻率與骨骼肌收縮關(guān)系的觀察；當(dāng)溫度較低時，骨骼肌的收縮效果較差。由于溫度限制，特別是中西部地區(qū)學(xué)校，冬季進行本實驗會出現(xiàn)效果不明顯。因此建議將“骨骼肌收縮實驗”設(shè)置在每年的4、5或10月份開設(shè)。

（三）實驗操作——雙毀髓法

本實驗操作中運用雙毀髓方法處理牛蛙。雖然，此方法能夠排除神經(jīng)中樞對實驗結(jié)果的影響。但是，學(xué)生在不熟練的情況下，特別是首次操作的過程中會出現(xiàn)以下問題，a.毀髓針扎到內(nèi)臟，碰觸或破壞坐骨神經(jīng)；b.握姿不準(zhǔn)確，嚴(yán)重破壞牛蛙肌肉等的生理活動。以上情況都會直接導(dǎo)致實驗失敗。因此，建議在實施雙毀髓操作前先使用乙醚麻醉牛蛙，此法既不影響牛蛙的生理活動，也便于學(xué)生們的毀髓操作。

參考文獻：

[1]路玉蘭.制備坐骨神經(jīng)——腓腸肌標(biāo)本方法的改進[J].廊坊師范學(xué)院學(xué)報，2001，17（4）：96-97.

[2]喬現(xiàn)福，畢超，邱丙芳.疲勞對蟾蜍骨骼肌舒張性能的影響[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，27（5）：387-389.

[3]崔弘，宋婷婷，陶媛媛，等.檢測蟾蜍離體坐骨神經(jīng)和腓腸肌生理功能的簡便有效輔助裝置[J].中國病理生理雜志，2016，32（9）：1723-172

8.

[4]張志琴，劉政政，趙磊，等.坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本制備方法的改良[J].石河子大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2004，22（5）：1.

[5]劉芳娥，劉利兵.實驗基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)[M].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2014.

[6]周華，崔慧先.人體解剖生理學(xué)[M].北京；人民衛(wèi)生出版社，2016.