果酒中有機(jī)酸的作用及檢測(cè)方法研究

曾竟藍(lán)，馬胤鵬，秦 丹，2，曾 璐*，陳長(zhǎng)松

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4.天下果業(yè)開發(fā)有限公司，湖南 湘西自治州 416000）

果酒是以水果為原料經(jīng)發(fā)酵而制成，一般酒精度約為12%vol，屬于低酒精度飲料酒[1]。果酒保留了水果的天然風(fēng)味，富含多種維生素和氨基酸，適量飲用對(duì)衰老引起的腦機(jī)能退化、心血管疾病以及某些癌癥的抑制有益[2-3]。近年來，人們開始提倡低度酒代替高度酒，飲用果酒成為一種趨勢(shì)[4]。常見的果酒除葡萄酒外，還包括蘋果酒、柑橘酒、荔枝酒、青梅酒、獼猴桃酒等。

果酒中所含的有機(jī)酸對(duì)于果酒的觀感、口感和品質(zhì)具有重要的影響，有機(jī)酸能溶解酒中的色素，使得果酒的顏色純凈美觀[5]。而且有機(jī)酸含量的高低對(duì)果酒的口感有直接影響，酒中有機(jī)酸含量過低，會(huì)使酒體平淡乏味；而有機(jī)酸含量過高，則會(huì)導(dǎo)致酒體生硬粗澀[6]。

1 果酒中主要有機(jī)酸

果酒中的有機(jī)酸大多來自于釀制所用的新鮮果實(shí)，因此果品原料的有機(jī)酸組成和含量的差異是導(dǎo)致果酒有機(jī)酸種類、含量差異的主要原因，同時(shí)也帶來了風(fēng)味、口感等方面的不同。各種類果酒的釀造過程中有多種有機(jī)酸參與反應(yīng)，如表1所示。其中有機(jī)酸對(duì)果酒品質(zhì)的作用可分為對(duì)果酒風(fēng)味構(gòu)成有利的有機(jī)酸（如酒石酸、檸檬酸、蘋果酸乳酸、琥珀酸等）以及對(duì)果酒品質(zhì)不利、在生產(chǎn)中應(yīng)盡量避免的有機(jī)酸（如乙酸、富馬酸）。

表1 不同果酒中主要有機(jī)酸的種類和含量Table 1 Types and contents of the main organic acids in different fruit wine

續(xù)表

1.1 對(duì)果酒風(fēng)味形成有利的有機(jī)酸

酒石酸存在于多種水果中，尤其在葡萄中大量存在，是葡萄酒最重要的特征有機(jī)酸。酒石酸稍有澀感、酸味強(qiáng)烈，在葡萄酒中的含量為1.0～3.0 g/L左右，酒石酸會(huì)在葡萄酒遇冷或酒精發(fā)酵過程中沉淀出來，使酒體酸度降低，陳酒中酒石酸質(zhì)量濃度一般為2.5～4.0 g/L，在葡萄酒老熟之后，酒石酸一般減至1.5～2.5 g/L[20]。酒石酸不但是葡萄酒pH值高低的決定因素[7-8]，而且對(duì)酒體的口感、穩(wěn)定性影響顯著。如當(dāng)葡萄酒中的酒石酸含量過高時(shí)，酒的口感粗硬并伴有澀感，品質(zhì)不佳[21]。當(dāng)酒石酸遭受乳酸細(xì)菌的侵蝕時(shí)，會(huì)分解形成乳酸，增加葡萄酒中的揮發(fā)酸含量，引起葡萄酒的“泛渾病”[22]。

檸檬酸具有清爽的酸味，口感溫和爽快，有新鮮感，后味延續(xù)時(shí)間短[23]。其廣泛分布于各種水果中，但因其品種及釀造工藝的不同，在果酒中含量差別很大，不同葡萄品種所釀造的葡萄酒中檸檬酸含量相差可達(dá)10倍[24]。除了來源于鮮果外，發(fā)酵過程中也會(huì)產(chǎn)生檸檬酸，它可作為底物在蘋果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）中被消耗，并轉(zhuǎn)變?yōu)閾]發(fā)酸[25]。

蘋果酸的酸度較大，其酸度比檸檬酸高20%，味道柔和，有特殊香味，稍帶苦澀味，呈味時(shí)間較長(zhǎng)[19]。水果中的蘋果酸以L-型為主，在果酒釀造的蘋果酸-乳酸發(fā)酵階段，乳酸菌會(huì)消耗L-蘋果酸并將其分解為L(zhǎng)-乳酸和CO2，使酒體的酸澀度、粗糙度、色度等降低[26]。

果酒中的乳酸主要來源于酒精發(fā)酵和蘋果酸-乳酸發(fā)酵，其酸性很強(qiáng)，但酸味較溫和，稍有澀感[13]。與蘋果酸相比，乳酸的穩(wěn)定性高且酸度低，因此經(jīng)過蘋果酸-乳酸發(fā)酵使蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸，酸度減低，酒體更加穩(wěn)定，不易變質(zhì)[27]。

琥珀酸主要由酵母菌發(fā)酵過程中三羧酸循環(huán)的代謝、蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中蘋果酸的轉(zhuǎn)化以及谷氨酸的轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生，是果酒發(fā)酵過程中的正常產(chǎn)物[28]。琥珀酸存在于各類果酒中，其口味復(fù)雜，既具酸味又有苦味，影響酒體風(fēng)味的形成，是葡萄酒中最富于味覺反應(yīng)的一種酸[29]。

1.2 果酒中不良有機(jī)酸

乙酸是酵母菌發(fā)酵的常規(guī)代謝產(chǎn)物，主要在發(fā)酵初期產(chǎn)生，具有很強(qiáng)烈的酸味，是酒類中的主要揮發(fā)酸[30]。在發(fā)酵后期或陳釀過程中，如果未能很好的隔絕氧氣或被其他細(xì)菌污染，乙醇就會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜帷８吆康囊宜釙?huì)掩蓋果酒的香氣，使果酒風(fēng)味協(xié)調(diào)性降低，變得不柔和，并引起果酒的口硬和后苦[31]。研究發(fā)現(xiàn)葡萄酒中乙酸的最適質(zhì)量濃度為0.2～0.7 g/L[32]。且我國(guó)國(guó)標(biāo)規(guī)定葡萄酒中乙酸的最大含量不得超過1.2 g/L[33]。因此，乙酸是果酒是否被氧化以及被其他微生物污染的重要檢驗(yàn)指標(biāo)。

富馬酸是檸檬酸三羧酸循環(huán)中的中間代謝產(chǎn)物之一，在果酒中的含量極低，對(duì)果酒的酸味影響很小。果實(shí)在正常代謝時(shí)無富馬酸形成，但受到機(jī)械損傷或有蟲害后，遭受外界環(huán)境中根霉菌的侵害造成污染，會(huì)導(dǎo)致富馬酸的生成；工廠生產(chǎn)線中的不規(guī)范操作如生產(chǎn)線清洗不徹底會(huì)引起微生物發(fā)酵產(chǎn)生富馬酸[34]。因此，富馬酸含量的高低可以從側(cè)面反映生產(chǎn)加工過程是否出現(xiàn)失誤。

2 有機(jī)酸對(duì)果酒的作用

2.1 有機(jī)酸對(duì)果酒風(fēng)味的影響

果酒中的酸是重要的呈味物質(zhì)，與其他呈味物質(zhì)共同組成果酒特有的芳香。酸含量過少的果酒，酒味寡淡、單調(diào)，酒體不協(xié)調(diào)；酸含量過高，則影響果酒整體的口感和風(fēng)味，導(dǎo)致果酒酸味明顯、刺舌[35]。因此，有機(jī)酸在調(diào)節(jié)果酒風(fēng)味中作用顯著，能起到除苦、減澀、緩沖口味、穩(wěn)定香氣的作用[36]。果酒中的有機(jī)酸分為揮發(fā)酸和不揮發(fā)酸。甲酸、乙酸等揮發(fā)酸分子質(zhì)量小，刺激性強(qiáng)；乳酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸等不揮發(fā)酸能增加酒體的醇厚感；而其他一些有機(jī)酸（如葡萄糖酸、抗壞血酸、糖醛酸等）則對(duì)果酒風(fēng)味的影響甚小[37]。另外，果酒中的有機(jī)酸在發(fā)酵和陳釀的過程中會(huì)與醇類物質(zhì)作用產(chǎn)生香氣物質(zhì)（如乳酸乙酯、乙酸乙酯、月桂酸乙酯、乙酸異戊酯等），賦予果酒清涼爽口的風(fēng)味[12]。

2.2 有機(jī)酸對(duì)果酒pH的影響

果酒的酸度主要由有機(jī)酸的種類、濃度決定，酒體中游離H+的濃度越高，其pH值越低，酸度越高。影響果酒酸度的有機(jī)酸是羧酸類，其特征是含有羧基（-COOH），能解離成質(zhì)子和共扼基團(tuán)而顯酸性，因此有機(jī)酸的種類和含量會(huì)對(duì)果酒的pH值產(chǎn)生一定程度的影響[38]。成冰等[39]對(duì)不同品種葡萄酒中的有機(jī)酸進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與紅葡萄酒相比，白葡萄酒中的總酸含量較低。盧倩文等[40]利用高效液相色譜法檢測(cè)以西藏區(qū)天然野櫻桃酒中的有機(jī)酸種類和含量，得出草酸和L-蘋果酸是果酒中的主要有機(jī)酸，其次乙酸和酒石酸，乳酸和檸檬酸含量最少。因此，檢測(cè)果酒有機(jī)酸含量，控制果酒釀制過程中酸度的變化，調(diào)整果酒pH值，對(duì)果酒的風(fēng)味口感有至關(guān)重要的影響。

2.3 有機(jī)酸對(duì)果酒穩(wěn)定性的影響

在果酒釀造過程中有機(jī)酸可加速多糖的轉(zhuǎn)化和果膠物質(zhì)的分解，促進(jìn)果酒的老熟和澄清[41]。因此，適量的有機(jī)酸能平衡酒中的苦味，使酒醇厚爽口。果酒在經(jīng)蘋果酸-乳酸發(fā)酵后，有機(jī)酸轉(zhuǎn)化，酸度降低，酒中的果香、醇香增加，生物穩(wěn)定性提高[42]。果酒中的酒石酸能與鉀、鈣離子生成不溶性的酒石酸鹽，從而沉于桶底或瓶底，在酒體的非生物性穩(wěn)定性方面起到重要作用[43]。酒中酚酸類含量過高會(huì)破壞果酒非生物穩(wěn)定性并賦予果酒較重的苦澀味[44]。檸檬酸能與鐵離子形成可溶性絡(luò)合物，在酒中加入少量檸檬酸（0.12～0.29 g/L）可有效防止鐵破敗病的產(chǎn)生[45]。

3 果酒中有機(jī)酸的檢測(cè)方法

3.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）是目前應(yīng)用最多的色譜分析方法，用該方法檢測(cè)果酒中的有機(jī)酸占利用色譜技術(shù)檢測(cè)有機(jī)酸的70%以上，其準(zhǔn)確率、重復(fù)性、便捷性均優(yōu)于其他檢測(cè)方法。果酒中有機(jī)酸的主要色譜條件為[46-49]檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；色譜柱：C18色譜柱或性能相當(dāng)?shù)纳V柱；檢測(cè)波長(zhǎng)：210～220 nm，柱溫：25～30℃；流動(dòng)相：甲醇或乙腈（5%～3%）-磷酸鹽緩沖液（95%～97%），其中磷酸鹽濃度0.01～0.05 mol/L，pH 2.5～3.0；流動(dòng)相流速0.5～1.0mL/min；進(jìn)樣量10μL。在這些基本條件下各種酸的分離度、相關(guān)系數(shù)、回收率都較高。

ZOTOU A等[50]利用高效液相色譜法，采用ODS-2（250 mm×4 mm，5 μm）色譜柱，選擇0.02 mol/L K2HPO4（pH 2.88）和體積分?jǐn)?shù)2%的甲醇為流動(dòng)相，以230 nm為紫外檢測(cè)波長(zhǎng)，在12 min內(nèi)測(cè)定了葡萄酒中半乳糖醛酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸的含量，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均在規(guī)定范圍內(nèi)。梁紅云等[51]建立了檢測(cè)黑莓果酒中主要的6種有機(jī)酸（酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、D-蘋果酸）的高效液相色譜方法，其回收率為98.56%，RSD為0.21%。向進(jìn)樂等[52]采用離子抑制反相高效液相色譜法測(cè)定菠蘿原漿果酒中的有機(jī)酸。通過定性和定量分析，從菠蘿原漿果酒中共檢10種有機(jī)酸。其建立的檢測(cè)方法精密度、重復(fù)性、樣品測(cè)定日內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD為0.33%～1.99%，各有機(jī)酸的加標(biāo)回收率為87.87%～106.96%。TASEV K等[53]利用高效液相色譜法對(duì)馬其頓的白葡萄酒和紅葡萄酒中的酒石酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸和丁二酸的含量進(jìn)行分析測(cè)定。其檢測(cè)方法的RSD為1.03%～3.99%，回收率95.0%～105.0%，各種酸的線性相關(guān)系數(shù)R＞0.999 3，具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

由此可見，在測(cè)定果酒中的有機(jī)酸種類和含量方面，HPLC法具有操作快速、簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠的優(yōu)點(diǎn)，可作為檢測(cè)有機(jī)酸的首推方法。

3.2 氣相色譜法

氣相色譜（gas chromatography，GC）使用成本較低，在果酒有機(jī)酸檢測(cè)上已得到廣泛應(yīng)用。由于果酒的有機(jī)酸種類繁多，有些組分含量極低，一般條件處理較難檢測(cè)，并且有些組分在分離提取時(shí)容易被破壞。對(duì)于這些含量較低和基質(zhì)較復(fù)雜的樣品，已有以下幾種柱前處理方法：固相微萃取、樹脂富集界面衍生、酯化篩選衍生。

杜曦等[54]應(yīng)用衍生化氣相色譜法測(cè)葡萄、葡萄酒中多元有機(jī)酸，通過碘乙烷與多元有機(jī)酸的四甲基銨鹽反應(yīng)，制備相應(yīng)的乙酯，在SE-30色譜柱上進(jìn)行分析測(cè)定。該方法的回收率均＞95%，RSD＜5.0%。高蕓等[55]采用氣相色譜定量分析了獼猴桃的有機(jī)酸含量。采用10%的硫酸甲醇對(duì)樣品進(jìn)行衍生化，用二氯甲烷萃取，最后進(jìn)行氣相色譜分析。結(jié)果表明，該方法的回收率較高（93.8%～102.3%），相關(guān)性較好（0.999 1～0.999 8），重復(fù)性好（RSD＜5%），且操作簡(jiǎn)單。鄧叢蕊[56]利用界面衍生化氣相色譜法來測(cè)定葡萄酒中總有機(jī)酸，用離子交換樹脂分離、富集葡萄酒中總有機(jī)酸并直接在樹脂界面上進(jìn)行乙酯化，然后結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用，鑒定并分析了葡萄酒中21種有機(jī)酸，該方法的精密度、重現(xiàn)性有較好，回收率為92.2%～104.3%。

由于有機(jī)酸的沸點(diǎn)較高、不易氣化，在使用氣相色譜法測(cè)果酒有機(jī)酸時(shí)，需要先對(duì)其衍生再進(jìn)行測(cè)定，其操作方法較為繁瑣，不利于實(shí)踐應(yīng)用。

3.3 離子色譜法

離子色譜法（ion chromatography，IC）具有靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單及分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)果酒中有機(jī)酸的常用方法。按分離原理可分為離子交換色譜法（ionexchangechromatography，IEC）和離子排斥色譜法（ion exclusion chromatography，ICE）兩種。

周建科等[57]利用離子排斥色譜法，以Shim-Pack SCR-102H色譜柱（8 mm×300 mm，7 μm）為分離柱，2.0 mmol/L鹽酸溶液作為淋洗液，分離并測(cè)定了蘋果醋中6種有機(jī)酸（草酸、檸檬酸、DL-蘋果酸、琥珀酸、戊二酸、乙酸）的含量。有機(jī)酸的檢測(cè)限在9.17～78.0 mg/L，各組分回收率為90%～110%，具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。宋衛(wèi)得等[58]建立了梯度淋洗離子色譜法測(cè)定白酒中18種有機(jī)酸的方法。采用AS11-HC陰離子分離柱（4 mm×250 mm），KOH溶液多級(jí)梯度淋洗，電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)，在流速為1.00 mL/min，柱溫為30℃時(shí)，18種有機(jī)酸在0.02～2.00 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（R值均＞0.99），回收率為73.50%～115.13%，精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.38%～4.97%。成霈等[59]采用戴安ICS1500離子色譜儀配合淋洗液梯度洗脫的方法在抑制電導(dǎo)模式下同時(shí)測(cè)定果酒中的酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、抗壞血酸、乳酸。該方法在葡萄酒、獼猴桃酒、石榴酒等果酒產(chǎn)品中有機(jī)酸的測(cè)定中，RSD均＜1%，加標(biāo)回收率均在91%～98%。何攀[60]使用Ion Pac AS11-HC分離柱，以15%的甲醇和氫氧化鈉為流動(dòng)相，梯度洗脫葡萄酒中有機(jī)酸（乳酸、乙酸、丁二酸、蘋果酸、酒石酸、富馬酸、檸檬酸）的含量，建立了用離子色譜法同時(shí)分離葡萄酒中6種主要有機(jī)酸的色譜條件。潘丙珍等[61]采用Ion Pac AS11陰離子交換分離柱，以氫氧化鉀為淋洗液，流速1.0 mL/min進(jìn)行梯度洗脫，通過抑制電導(dǎo)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。建立了離子色譜-電導(dǎo)檢測(cè)法測(cè)定葡萄酒中有機(jī)酸的分析方法。該方法對(duì)11種有機(jī)酸具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)在0.9909～0.9997；準(zhǔn)確度和精密度良好，樣品加標(biāo)回收率在81.0%～117.8%，RSD＜5.0%。

離子色譜法雖然不需要樣品進(jìn)行預(yù)處理或柱后處理，但由于淋洗液和柱填料的特殊性，對(duì)樣品中蛋白質(zhì)含量有嚴(yán)格限定，不適用于分析成分復(fù)雜的樣品，并且其分析樣品的周期較長(zhǎng)。

3.4 其他方法

果酒中有機(jī)酸的測(cè)定方法不僅僅只有上述幾種，還有毛細(xì)管電泳法、酸堿滴定法、比色分析法、薄層色譜法等。

毛細(xì)管電泳法是以是石英毛細(xì)管為分離通道，高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分之間的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離分析方法，具有高效快速，簡(jiǎn)單、便宜的優(yōu)點(diǎn)[62-63]。唐美華等[64]運(yùn)用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法直接測(cè)定了葡萄酒中8種有機(jī)酸。各有機(jī)酸線性相關(guān)系數(shù)在0.999 0～0.9998，加標(biāo)回收率為91.9%～116.9%，RSD為3.68%～5.41%。方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可對(duì)葡萄酒釀造過程快速監(jiān)控，并對(duì)酒的品質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。李永庫(kù)等[65]應(yīng)用毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定葡萄酒中草酸、富馬酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、酒石酸和乳酸8種主要有效成分的含量。在未涂層石英毛細(xì)管（50 μm×80 cm）中，以40.0 mmol/L醋酸銨（用1.0 mol/L醋酸調(diào)至pH 4.5）為緩沖溶液，30%異丙醇（含3.0 mmol/L氨水）為鞘液，分離電壓25.0 kV，各組分在15min內(nèi)得到完全分離。種組分的加標(biāo)回收率為87.6%～98.2%，RSD為2.7%～5.6%。盡管毛細(xì)管電泳法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，但與以上3種方法相比，其靈敏度和重現(xiàn)性方面仍存在不足，還有待進(jìn)一步的提高和改善。

酸堿滴定法、比色分析法和薄層色譜法雖然操作簡(jiǎn)便，但其靈敏度低，雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，與上述幾種檢測(cè)方法相比具有一定的局限性，因此不是分析檢測(cè)果酒有機(jī)酸的首選方法。

4 總結(jié)與展望

果酒中的有機(jī)酸雖不直接參與構(gòu)成果酒的香氣，但其特有的酸味和口感，是果酒中主要的呈味物質(zhì)，是果酒一項(xiàng)重要的品質(zhì)特征。本文對(duì)果酒的有機(jī)酸及其在果酒中的重要作用進(jìn)行了歸納和總結(jié)，目前關(guān)于有機(jī)酸在果酒中的呈味、呈香機(jī)理的研究報(bào)道較少。同時(shí)，在果酒釀造過程中有機(jī)酸的變化規(guī)律、各有機(jī)酸最適含量的控制以及建立果酒酸類物質(zhì)與風(fēng)味相結(jié)合的綜合評(píng)價(jià)體系等方面還需進(jìn)行深入的試驗(yàn)與探究。

目前果酒中有機(jī)酸的檢測(cè)方法主要是色譜法，包括高效液相色譜法、氣相色譜法以及離子色譜法等。在這些方法中，使用最廣泛的是高效液相色譜法。與其他幾種檢測(cè)方法相比，高效液相色譜法具有前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)周期短的優(yōu)點(diǎn)，一次性能檢測(cè)果酒中6～10種有機(jī)酸。但其在檢測(cè)酒中一些痕量的有機(jī)酸組分方面，還存在檢測(cè)結(jié)果誤差較大的缺點(diǎn)，因此在擴(kuò)大檢測(cè)范圍、提高檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度方面有待進(jìn)一步改進(jìn)和提高。

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