實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測食品中亞利桑那沙門氏菌

王青龍，蔡雪鳳，周艷霞，曹 悅，張躍川，朱曉龍，鞏有博，耿健強(qiáng)，何湘漪

（北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評估中心（北京市食品檢驗(yàn)所），北京 100094）

沙門氏菌（Salmonella）是食品檢測過程中最常見的食源性致病菌之一，其在世界范圍內(nèi)引起的食物中毒病例也常常排在首位[1-3]。據(jù)報(bào)道，美國每年沙門氏菌感染的病例就超過40 000例[3-4]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的相關(guān)報(bào)道，全球每年傷寒感染的人超過1 600萬，其中50萬～60萬人會(huì)病死[4]。在我國，每年發(fā)生的食源性細(xì)菌中毒事件中，由沙門氏菌引起的食物中毒案例經(jīng)常是排在第一位，約占總比例的40%[5]。

目前，根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道已經(jīng)確認(rèn)的沙門氏菌的血清型就有2 500多種，在我國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了200多種沙門氏菌的血清型[6-8]，其中能夠感染人類致病的菌株主要有傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌和雞沙門氏菌，目前也有文獻(xiàn)報(bào)道亞利桑那沙門氏菌感染人類致病的案例[9-11]。引起人類感染沙門氏菌主要是由于食用了被污染的食品，感染沙門氏菌后一般會(huì)引起痢疾、胃炎、腸炎、傷寒等病癥，嚴(yán)重的還會(huì)引起敗血癥[12-14]。目前，食品沙門氏菌的檢測方法主要還是使用傳統(tǒng)培養(yǎng)和生化鑒定的方法，該方法需進(jìn)行選擇性增菌培養(yǎng)、生化鑒定、血清分型等步驟，一般要5～6 d才能得出檢測結(jié)果，不利于及時(shí)快速的進(jìn)行診斷、病源的查找、疫情不能夠及時(shí)得到控制。通過實(shí)驗(yàn)證明該方法對于亞利桑那沙門氏菌和沙門氏菌區(qū)分比較難，如果對于沙門氏菌的檢測經(jīng)驗(yàn)不足，往往會(huì)導(dǎo)致亞利桑那沙門氏菌會(huì)被漏檢。因此，建立一種能夠快速檢測食品中沙門氏菌和亞利桑那沙門氏菌的方法是非常必要和急需的，對于以后沙門氏菌的快速檢測也有著非常重要的意義。

本研究根據(jù)GenBank公布的亞利桑那沙門氏菌和其他沙門氏菌的gudD基因序列，通過序列比對設(shè)計(jì)引物和Taqman探針。通過種間特異性和不同屬間的特異性實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）擴(kuò)增體系的特異性、對沙門氏菌檢測的敏感性以及與傳統(tǒng)檢測方法結(jié)果的相符合性。以期為亞利桑那沙門氏菌的快速鑒定和檢測提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

不同血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株10株，樣品菌株88株，其中亞利桑那沙門氏菌（Salmonella arizonae）3株；其他食源性致病菌等非沙門氏菌29株：分別來源于美國典型菌種保藏中心（American type culture collection，ATCC），中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（national center for medical culture collection，CMCC），中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC），中國普通微生物菌種保藏管理中心（China general microbiological culture collectioncenter，CGMCC）。分離菌株88株由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。菌株信息見表1。上述菌株經(jīng)過生化實(shí)驗(yàn)和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 實(shí)驗(yàn)用菌株信息Table 1 Information table of experimental strain

1.1.2 試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取液、Taq Man Master Mix：美國ABI公司；亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（selenitecystinebroth，SC增菌液）、緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）：北京陸橋有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI QuantStudio 7實(shí)時(shí)熒光PCR儀：美國ABI公司；VITEKRCompact微生物分析系統(tǒng)：法國生物梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 引物探針設(shè)計(jì)

從GenBank上亞利桑那沙門氏菌和其他沙門氏菌的gudD基因已經(jīng)公布的序列，通過序列比對選擇一段目標(biāo)片段來設(shè)計(jì)引物和探針，使用該引物和探針實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。引物探針用primer5軟件設(shè)計(jì)，由上海生物工程有限公司合成。引物探針序列見表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針序列Table 2 Primers and the probe sequence of real-time PCR

1.3.2 DNA提取和特異性試驗(yàn)

所有沙門氏菌菌株接種于BPW緩沖蛋白胨水，于37℃培養(yǎng)18～24 h，取1 mL接種于SC培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)18～24 h。取1 mL于12 000 r/min離心5 min，去上清，用1 mL生理鹽水懸浮，12 000 r/min離心5 min，去上清，重復(fù)上述步驟兩次。最后用200 μL細(xì)菌裂解液懸浮，沸水浴5 min，冷卻2 min，15 000 r/min離心10 min，取上清備用。其他非沙門氏菌菌株作為陰性對照菌株用相應(yīng)的培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，取1 mL菌懸液轉(zhuǎn)移至離心管，按照沙門氏菌相同的步驟提取DNA備用，所有菌株的DNA均用于特異性試驗(yàn)。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和參數(shù)

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為25μL：2×MasterMix12.5μL、引物對（10 μmol/L）各1 μL、探針（10 μmol/L，0.5 μL、模板DNA2μL、去離子水8μL。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)為：50℃，2min，95℃預(yù)變性10min，94℃變性5s，60℃退火延伸40 s；同時(shí)收集FAM熒光，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。

實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線指數(shù)期明顯，Ct＜35可直接判定為陽性，Ct值為35～40判定為可疑，需要進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，Ct＞40判定為陰性。

1.3.4 模擬樣品檢測和靈敏度試驗(yàn)

取確定為沙門氏菌陰性的樣品（雞肉、鴨肉），采用GB4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行培養(yǎng)鑒定，確認(rèn)無沙門氏菌污染。分別稱取25g，每份樣品中分別添加3個(gè)不同稀釋濃度（100CFU/mL、101CFU/mL、102CFU/mL）的亞利桑那沙門氏菌和沙門氏菌的菌懸液（添加水作為陰性對照），制成14份模擬樣品。每份樣品中加入225mLBPW緩沖蛋白胨水，用拍打器拍打2 min，37℃培養(yǎng)18～24 h，取1 mL移入9 mL SC增菌液，37℃培養(yǎng)18～24 h，然后取1 mL增菌液提取DNA用于實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。同時(shí)，不同稀釋濃度的模擬污染樣品也用于實(shí)時(shí)PCR方法的檢測靈敏性試驗(yàn)。所有模擬樣品按照GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》，與實(shí)時(shí)熒光PCR方法同步進(jìn)行培養(yǎng)鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞利桑那沙門氏菌特異性檢測

取表1中所列的3株亞利桑那沙門氏菌、9株沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，3株亞利桑那沙門氏菌的DNA樣本采用YF/YR引物和YP探針均擴(kuò)增出陽性擴(kuò)增曲線，而其他沙門氏菌DNA樣本檢測結(jié)果為陰性。結(jié)果表明，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的亞利桑那沙門氏菌的引物和探針特異性很好。

圖1 亞利桑那沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR特異性擴(kuò)增圖譜Fig.1 Specific amplification pattern ofSalmonella arizonaeby real-time PCR

2.2 其他沙門氏菌特異性檢測

圖2 其他沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR特異性擴(kuò)增圖譜Fig.2 Specific amplification pattern of ordinarySalmonellaby real-time PCR

取表1中所列的9株沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、3株亞利桑那沙門氏菌的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，9株沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株采用SF/SR引物和SP探針均擴(kuò)增出陽性擴(kuò)增曲線，而亞利桑那沙門氏菌DNA樣本檢測結(jié)果為陰性。結(jié)果表明，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的沙門氏菌的引物和探針特異性很好，與亞利桑那沙門氏菌能夠明顯鑒別。

2.3 非沙門氏菌特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別使用YF/YR引物YP探針和SF/SR引物SP探針對表1中29株非沙門氏菌的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果如表3所示。由表3可知，本研究設(shè)計(jì)的亞利桑那沙門氏菌的YF/YR引物YP探針和其他沙門氏菌的SF/SR引物SP探針對非沙門氏菌均有非常好的特異性。因此本次設(shè)計(jì)的引物和探針能夠用于以后沙門氏菌和亞利桑那沙門氏菌的食品檢測。

表3 非沙門氏菌特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of specific experiments of non-Salmonella

2.4 模擬樣品檢測和靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

14份樣品中分別添加3個(gè)不同稀釋濃度（100CFU/mL、101CFU/mL、102CFU/mL）的亞利桑那沙門氏菌和沙門氏菌，與此同時(shí)，按照GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》檢測模擬污染樣品，結(jié)果見表4。

由表4可知，12份樣品的亞利桑那沙門氏菌和沙門氏菌的檢測結(jié)果均為陽性，不同添加濃度的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果可見，模擬污染樣品的實(shí)時(shí)PCR檢測靈敏度可以達(dá)到1～10 CFU/mL的添加濃度。

表4 模擬樣品檢測和靈敏度試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of simulated sample test and sensitivity test

3 結(jié)論

沙門氏菌的傳統(tǒng)方法鑒定需要經(jīng)過病原的選擇性分離、生化鑒定、血清學(xué)分型等步驟來鑒定，但是在血清型實(shí)驗(yàn)過程中不同血清型之間容易交叉反應(yīng)，從而會(huì)干擾血清型實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，因此在血清型檢測的過程中往往會(huì)存在一定比例的假陽性結(jié)果。隨著近些年分子生物學(xué)技術(shù)快速的發(fā)展，目前已經(jīng)報(bào)道的分子方法中主要是針對16SrRNA、invB、invA、SpvC、fimA、SEFl4、agfA、ssaQ、sefA、sdf、fimY等[15-16]為目標(biāo)基因，采用普通PCR或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測沙門氏菌，這些方法只是能夠檢測沙門氏菌的某個(gè)或者某些毒力基因，不能具體確定到血清型。

本文建立的TaqMan探針實(shí)時(shí)PCR檢測食品中亞利桑那沙門氏菌和其他沙門氏菌，具有很好的特異性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增靈敏性試驗(yàn)結(jié)果表明，檢測靈敏度可達(dá)到1～10 CFU/mL的添加濃度。經(jīng)模擬樣品驗(yàn)證，所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法與傳統(tǒng)方法的檢測結(jié)果相一致，具有檢測周期短、操作簡便的優(yōu)勢，具有很好的應(yīng)用前景。

[1]TATAVARTHY A,CANNONS A.Real-time PCR detection ofSalmonella species using a novel target:the outer membrane porin F gene(ompF)[J].Lett Appl Microbiol,2010,50(6):645-652.

[2]MANZANO M,COCOLIN L,ASTORI G,et al.Development of a PCR microplate-capture hybridization method for simple,fast and sensitive detection ofSalmonella serovarsin food[J].Mol Cell Probes,1998,12(4):227-234.

[3]YANG B,QU D,ZHANG X,et al.Prevalence and characterization of Salmonella serovars in retail meats of marketplace in Shaanxi,China[J].Int J Food Microbiol,2010,141(1-2):63-72.

[4]SIEMBIEDA J L,MILLER W A,BYRNE B A,et al.Zoonotic pathogens isolated from wild animals and environmental samples at two California wildlife hospitals[J].J Am Vet Med Assoc,2011,238(6):773-783.

[5]YANG B W,QU D,ZHANG X L,et al.Prevalence and characterization ofSalmonella serovarsin retail meats of marketplace in Shaanxi,China[J].Int J Food Microbiol,2010,141(1):63-72.

[6]HOORFAR J,LIND P,BELL M M,et al.Seroreactivity ofSalmonella-infected cattle herds against a fimbrial antigen in comparison with lipopolysaccharide antigens[J].J Vet Med,2010,43(1-10):461-467.

[7]LIU D,HAASE A M,LINDQVIST L,et al.Glycosyl transferases of O-antigen biosynthesis inSalmonella enterica:identification and characterization of transferase genes of groups B,C2,and E1[J].J Bacteriol,1993,175(11):3408.

[8]BARROW P A.ELISAs and the serological analysis ofSalmonellainfections in poultry:a review[J].Epidemiol Infect,1992,109(3):361-369.

[9]彭易根，張正群.亞利桑那沙門氏菌食物中毒72例臨床分析[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2011，27（4）：571-572.

[10]李 明，利 娟.亞利桑那沙門氏菌引起膽管炎合并膽石癥致敗血癥一例[J].中國臨床研究，2004，17（1）：6.

[11]劉 杰，黃淑華，陳 磊，等.開封市首次檢出2株亞利桑那沙門菌的鑒定與分析[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2013，24（4）：261-262.

[12]SHI S A,PARK M T,CHOI H,et al.Salmonellabacteriophage and antibacterial composition comprising the same.US8329442[P].2012-11-12.

[13]COX N A,BERRANG M E,CASON J A.Salmonellapenetration of egg shells and proliferation in broiler hatching eggs--a review[J].Poult Sci,2000,79(11):1571-1574.

[14]VRIESEKOOP F,SHAW R.The Australian bush fly(Musca vetustissima)as a potential vector in the transmission of foodborne pathogens at outdoor eateries[J].Foodborne Path Dis,2010,7(3):275.

[15]TURCOTTE C,WOODWARD M J.Cloning,DNA nucleotide sequence and distribution of the gene encoding the SEF14 fimbrial antigen of Salmonella enteritidis[J].J Gen Microbiol,1993,139(7):1477.

[16]GUO X,CHEN J,BEUCHAT L R,et al.PCR detection ofSalmonella entericaserotype Montevideo in and on raw tomatoes using primers derived from hilA[J].Appl Environ Microbiol,2000,66(12):5248-5252.