硝苯吡啶在鐵超載HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用及機(jī)制

呂小梅 冉兵 楊茂 李雪森 藺艷，

西南醫(yī)科大學(xué)1生理學(xué)教研室，2腫瘤醫(yī)學(xué)研究所（四川瀘州 646000）

鐵超載是鐵代謝紊亂的一種病理表現(xiàn)，多種疾病如：小紅細(xì)胞性貧血、溶血性貧血、腎炎綜合征和多次輸血等都可引起鐵超載［1-3］。機(jī)體鐵超載會(huì)引起過(guò)量的游離鐵在肝臟、胰腺、心臟、腦垂體、腎臟等薄壁器官沉積，促進(jìn)氧自由基的產(chǎn)生，并引起氧化應(yīng)激等病理生理過(guò)程的發(fā)生［4］。用鐵螯合劑降低血清及細(xì)胞內(nèi)鐵含量一直是臨床治療鐵超載的主要方式。硝苯吡啶作為一種鈣通道抑制劑在臨床主要被用于高血壓，冠心病等心血管疾病的治療［5-7］，但近年來(lái)有研究［8］顯示硝苯吡啶可抑制離體心肌和心室肌細(xì)胞L-型鈣通道介導(dǎo)的非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵的攝取，可顯著刺激COS-7細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)，增加鐵超載模型大鼠尿鐵排泄［9］等，提示心肌或腎小管細(xì)胞攝取鐵或與鈣通道有關(guān)，有學(xué)者甚至提出或許可用鈣通道抑制劑聯(lián)合鐵螯合劑來(lái)治療心肌鐵超載［8］。所以L-型鈣通道抑制劑——硝苯吡啶在鐵超載性疾病中的一些新的藥理特性就越來(lái)越受到了人們的關(guān)注。但硝苯吡啶對(duì)鐵超載腎小管細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的作用機(jī)制是什么，一直都非常不清楚，硝苯吡啶對(duì)鐵超載性氧化應(yīng)激是否有作用亦未見(jiàn)報(bào)道，本研究用HK-2細(xì)胞為對(duì)象，研究硝苯吡啶對(duì)腎小管細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用及可能的機(jī)制，以期為探明硝苯吡啶在鐵超載性疾病中的藥理特性提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 HK-2細(xì)胞、FAC和Nifedipine購(gòu)自上海延慕實(shí)業(yè)公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自Dojin，硝酸購(gòu)自科龍?jiān)噭┕?，普魯士藍(lán)伊紅染色試劑盒購(gòu)自北京solarbio試劑公司，總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）、還原性谷胱甘肽（GSH）均購(gòu)自南京建成試劑公司，鼠抗人單克隆DMT1（ab117544）和羊抗人多克隆FPN1（ab205376）抗體購(gòu)自Abcam公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體和羊抗鼠熒光標(biāo)記IgG抗體購(gòu)自Gene公司，兔抗羊辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記IgG抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，DAB顯色試劑盒為購(gòu)自MILLIPORE公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及處理 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞隨機(jī)分成4個(gè)組，分別為空白組、鐵超載組、硝苯吡啶組、共處理組。鐵超載組用檸檬酸鐵銨（ferric ammonium citrate，F(xiàn)AC）300 μmol/L 處 理24 h，硝苯吡啶組用硝苯吡啶10 μmol/L處理24 h，共處理組用硝苯吡啶處理1 h后加入FAC共同處理24 h，空白組用等體積的溶劑處理。

1.2.2 氧化應(yīng)激試驗(yàn) 收集分組處理好的細(xì)胞在冰上超聲波破碎，功率80 W，超聲時(shí)間5 s，間歇10 s，重復(fù)4次，獲取細(xì)胞破碎液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)用硫代巴比妥酸（TBA）法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的MDA含量、羥胺法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)T-SOD活性、微量酶標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GSH的含量。

1.2.3 感應(yīng)耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀測(cè)細(xì)胞內(nèi)鐵含量 HK-2細(xì)胞照1.2.1的方法分組處理，每組8個(gè)復(fù)孔。消化收集細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用PBS清洗3遍，每管加入純硝酸200 μL，混勻，37℃過(guò)夜，用超純水250倍稀釋后，用感應(yīng)耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀在259.94 nm波長(zhǎng)下測(cè)發(fā)射光強(qiáng)度，根據(jù)發(fā)射光強(qiáng)度與鐵含量的標(biāo)準(zhǔn)曲和樣品的發(fā)射光強(qiáng)度換算鐵含量。儀器參數(shù)設(shè)置為：發(fā)射功率1 150 W，載氣流量0.7 L/min，輔助氣流量1.0 L/min，冷卻氣流量12 L/min。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 1（divalent metal transporter 1，DMT1）和膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（ferroportin，F(xiàn)PN1）的表達(dá) 收集分組處理的細(xì)胞蛋白樣品。制取PAGE-SDS膠，分離膠10%，濃縮膠5%，每孔蛋白上樣量60 μg，按Western blot常規(guī)方法操作，一抗用鼠抗人β-actin單克隆抗體（1∶2 000），羊抗人FPN1多克隆抗體（1∶500），鼠抗人DMT1多克隆抗體（1∶500），二抗用兔抗鼠熒光標(biāo)記IgG（1∶5 000）和羊抗兔HRP標(biāo)記IgG（1∶2 000），在成像儀下曝光成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果用x±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間各指標(biāo)比較采用LSD法檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞MDA、SOD和GSH含量的比較用FAC處理HK-2細(xì)胞24 h后，與空白組相比，鐵超載組細(xì)胞內(nèi)MDA含量增多，SOD活性降低，GSH含量減少，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。硝苯吡啶組MDA含量，SOD活性和GSH含量與空白組比較差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但與鐵超載組相比MDA含量降低，SOD活性增加，GSH含量增多，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。共處理組與空白組相比，MDA含量增加（P＜0.05），SOD活性和GSH含量差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但與鐵超載組相比MDA含量降低，SOD活性增加，GSH含量增多，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。表明硝苯吡啶單獨(dú)處理對(duì)MDA、SOD和GSH無(wú)顯著影響，但能抑制FAC對(duì)MDA、SOD和GSH的影響。

表1 HK-2細(xì)胞中MDA、T-SOD、和GSH的含量Tab.1 The contents of MDA，T-SOD，and GSH in HK-2 cells（n=6） ± s

表1 HK-2細(xì)胞中MDA、T-SOD、和GSH的含量Tab.1 The contents of MDA，T-SOD，and GSH in HK-2 cells（n=6） ± s

注：與空白組相比較，*P＜0.05；與FAC組相比較，#P＜0.05

組別空白組鐵超載組硝苯吡啶組共處理組MDA（nmol/mg prot）0.12±0.01 0.24±0.03*0.12±0.01#0.17±0.02*#T-SOD（U/mg prot）63.00±3.71 47.57±2.13*60.60±4.53#58.98±5.23#GSH（nmol/mg prot）71.76±7.57 56.54±6.57*69.82±7.26#68.76±6.35#

2.2 細(xì)胞內(nèi)鐵含量的比較 用FAC和（或）硝苯吡啶處理HK-2細(xì)胞24 h后，用感應(yīng)耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀測(cè)各組鐵濃度，結(jié)果顯示：鐵超載組鐵含量升高，硝苯吡啶組與空白組和鐵超載組相比鐵含量降低，共處理組與空白組相比鐵含量升高，但與鐵超載組相比鐵含量降低，以上結(jié)果差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。表明硝苯吡啶處理能降低HK-2細(xì)胞內(nèi)鐵含量。

2.3 各組細(xì)胞DMT1表達(dá)水平的比較 HK-2細(xì)胞分組處理后，用Western blot法檢測(cè)DMT1的表達(dá)量。結(jié)果顯示鐵超載組DMT1的表達(dá)水平降低（P＜0.05），硝苯吡啶組的DMT1的水平升高（P＜0.05），共處理組與空白組相比DMT1表達(dá)水平無(wú)顯著變化（P＞0.05），但與鐵超載組相比DMT1表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。表明硝苯吡啶可增加HK-2細(xì)胞DMT1的表達(dá)量。見(jiàn)圖2。

圖1 各組細(xì)胞內(nèi)鐵含量的比較Fig.1 Iron contents in HK-2 cells

圖2 DMT1在HK-2細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Expression of DMT1 protein in HK-2 cells

2.4 各組細(xì)胞FPN1表達(dá)水平的比較 HK-2細(xì)胞分組處理后，用Western blot法檢測(cè)FPN1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示與空白組相比鐵超載組、硝苯吡啶組和共處理組FPN1的表達(dá)水平均升高（P＜0.05），硝苯吡啶組和共處理組與高鐵組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

3 討論

圖3 FPN1在HK-2細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3 Expression of FPN1 protein in HK-2 cells

氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）是指體內(nèi)氧化-抗氧化反應(yīng)失衡，ROS增多，對(duì)抗與清除氧自由基的能力減弱，細(xì)胞修復(fù)能力降低，膜脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化損害。MDA含量可反映細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損害的程度［10］，T-SOD和GSH可間接反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力［11］。本研究用FAC處理HK-2細(xì)胞24 h所致鐵超載模型細(xì)胞內(nèi)MDA含量增加，T-SOD活性降低，GSH含量降低，表明鐵超載可致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激。硝苯吡啶單獨(dú)處理時(shí)對(duì)MDA、SOD和GSH這幾個(gè)指標(biāo)無(wú)顯著影響，但與FAC聯(lián)合處理時(shí)細(xì)胞中MDA含量比鐵超載組明顯降低，SOD活性和GSH含量比鐵超載組明顯增加，表明硝苯吡啶本身并不能增加HK-2細(xì)胞抗氧化的能力，但能使FAC引起的細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損害明顯減弱，在HK-2細(xì)胞鐵超載促發(fā)的氧化應(yīng)激中具有保護(hù)作用。

為了探明硝苯吡啶減輕HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激性損傷的機(jī)制，本研究關(guān)注了硝苯吡啶對(duì)細(xì)胞內(nèi)鐵含量和鐵代謝相關(guān)蛋白DMT1和FPN1的表達(dá)的影響。經(jīng)典的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)途徑是轉(zhuǎn)鐵蛋白-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（Tf-TfR）循環(huán)：血漿中Fe3+與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合形成Tf-Fe3+，Tf-Fe3+與細(xì)胞膜上的TfR形成Tf-Fe3+-TfR復(fù)合物，經(jīng)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞形成內(nèi)吞小體（內(nèi)涵體），在質(zhì)子泵作用下，內(nèi)吞小體PH值下降，F(xiàn)e3+從Tf中釋放出來(lái)，脫鐵后的Tf被運(yùn)回胞外，F(xiàn)e以Fe2+的方式被內(nèi)涵體膜上的DMT1轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿中，F(xiàn)e2+或進(jìn)入鐵蛋白中儲(chǔ)存，或進(jìn)入線粒體參與代謝，或由FPN1轉(zhuǎn)出細(xì)胞并被氧化成Fe3+重新回到血漿中［3］。此外少量Fe2+在心肌、肝臟、胰腺還可以通過(guò)L-型鈣通道，DMT1，ZIP4等［12］方式被轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞中。研究證實(shí)鐵超載時(shí)，TfR表達(dá)下調(diào)［13］，經(jīng)典的Tf-TfR途徑鐵轉(zhuǎn)運(yùn)減少，旁路途徑增加，但具體哪些細(xì)胞各自有哪些途徑和通道，目前并不十分清楚。本研究中硝苯吡啶作為一種L-型鈣通道抑制劑顯著降低HK-2細(xì)胞內(nèi)鐵含量，與DAS等［8］觀察到的硝苯吡啶可減少大鼠心肌細(xì)胞通過(guò)L-型鈣通道攝取鐵的結(jié)果相似，提示HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)鐵或許也有鈣通道途徑，硝苯吡啶可能是通過(guò)抑制鈣通道而減少鐵攝取，從而降低HK-2細(xì)胞內(nèi)鐵含量，但這一猜測(cè)和機(jī)制還需要更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)闡明。

DMT1通常被認(rèn)為是調(diào)節(jié)鐵攝取的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它在不同細(xì)胞不同部位具有不同的功能：（1）在腸腔上皮細(xì)胞刷狀緣膜上介導(dǎo)Fe2+的攝??；（2）在外周神經(jīng)系統(tǒng)和紅細(xì)胞膜上負(fù)責(zé)非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵（non-Tf-boundiron，NTBI）的吸收［14］；（3）在內(nèi)涵體膜上負(fù)責(zé)將Fe2+轉(zhuǎn)出到胞漿中［15］；（4）在線粒體外膜上負(fù)責(zé)將鐵攝入線粒體中［16］。ABOUHAMED等［17］用熒光免疫染色的方法發(fā)現(xiàn)DMT1在腎近端小管上皮的表達(dá)主要位于晚期內(nèi)涵體/溶酶體膜上，并不出現(xiàn)在細(xì)胞膜上，所以它似乎并不負(fù)責(zé)腎小管細(xì)胞攝取鐵［17］，而是主要負(fù)責(zé)將晚期內(nèi)涵體/溶酶體內(nèi)的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿中。本研究中硝苯吡啶促進(jìn)HK-2細(xì)胞DMT1的表達(dá)，可增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)，亦將有利于逆轉(zhuǎn)鐵蓄積，減輕鐵超載所引發(fā)的氧化應(yīng)激性損傷。

FPN1是目前研究認(rèn)為的唯一負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)鐵轉(zhuǎn)出的蛋白［18］，在小腸、肝臟、脾、巨噬細(xì)胞和腎小管細(xì)胞中廣泛表達(dá)［19］。FPN1在腎近端小管細(xì)胞的胞漿和靠近基底膜的部位表達(dá)［20］，可能與腎臟重吸收鐵的功能相關(guān)［20］。本實(shí)驗(yàn)中硝苯吡啶增加鐵輸出蛋白FPN1的表達(dá)，將有利于增加鐵的轉(zhuǎn)出，幫助降低細(xì)胞內(nèi)鐵含量，從而減少鐵超載促發(fā)的氧化應(yīng)激性損傷。

綜上所述，筆者認(rèn)為硝苯吡啶在鐵超載HK-2的氧化應(yīng)激中有保護(hù)作用，這一作用與硝苯吡啶促進(jìn)DMT1和FPN1的表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)及轉(zhuǎn)出，降低細(xì)胞內(nèi)鐵含量有關(guān)。了解和探明硝苯吡啶在鐵超載腎小管細(xì)胞中的作用以及對(duì)鐵代謝的影響機(jī)制將為臨床用治療鐵超載性腎病提供新的思路和方法。

［1］GORDAN R，WONGJAIKAM S，GWATHMEY J K，et al.Involvement of cytosolic and mitochondrial iron in iron overload cardiomyopathy：an update［J/OL］.Heart Fail Rev，2018 Apr 19.

［2］PIETRANGELO A.Ineffective erythropoiesis：anemia and iron overload［J］.Hematol Oncol Clin North Am，2018，32（2）：213-221.

［3］ANDERSON G J，F(xiàn)RAZER D M.Current understanding of iron homeostasis［J］.Am J Clin Nutr，2017，106（6）：1559S-1566S.

［4］AZIZA S A，MELS A，ELSHALL S K．Ameliorating role of rutin on oxidative stress induced by iron overload in hepatic tissue of rats［J］.Pak J Biol Sci，2014，17（8）：964-977.

［5］UMEIZUDIKE K A，OLAWUYI A B，UMEIZUDIKE T I，et al.Effect of calcium channel blockers on gingival tissues in hypertensive patients in lagos，nigeria：A pilot study［J］.Contemp Clin Dent，2017，8（4）：565-570.

［6］SHAWKAT E，MISTRY H，CHMIEL C，et al.The effect of labetalol and nifedipine MR on blood pressure in women with chronic hypertension in pregnancy［J］.Pregnancy Hypertens，2018，11：92-98.

［7］TSUBURAYA R，TAKAHASHI J，NAKAMURA A，et al.Beneficial effects of long-acting nifedipine on coronary vasomotion abnormalities after drug-eluting stent implantation：The NOVEL study［J］.Eur Heart J，2016，37（35）：2713-21.

［8］DAS S K，OUDIT G Y.Votathy：L-type age-gated Ca2+channals as key mediators of iron-transport and iron-verload cardiomyopvs.T-type Ca2+channels［J］.Eur J Haematol，2012，88（6）：476-477.

［9］LUDWICZEK S，THEURL I，MUCKENTHALER M U，et al.Ca2+channel blockers reverse iron overload by a new mechanism via divalent metal transporter-1［J］.Nat Med，2007，13：448-454.

［10］宋園園，劉劍波.依達(dá)拉奉對(duì)肺栓塞患者血清HMGB1、MDA和LPA水平的影響［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（22）：3779-3782.

［11］藺艷，何濤，毛曉燕，等.還原型谷胱甘肽對(duì)腎急性缺血再灌注性損傷的作用［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（8）：1233-1236.

［12］COATES T D.Physiology and pathophysiology of iron in hemoglobin-associated diseases［J］.Free Radic Biol Med，2014，72：23-40.

［13］YU SS，JIANG L R，LING Y，et al.Nifedipine increases iron content in WKPT-0293 Cl.2 cells via up-regulating iron influx protein［J/OL］.Front Pharmacol，2017，13：8-60.

［14］VIOT R M，GOITIA B，USACH V，et al.DMT1 as a candidate for non-transferrin-bound iron uptake in the peripheral nervous system［J］.BioFactors，2013，39（4）：476-484.

［15］KHALIL S，HOLY M，GRADO S，et al.A specialized pathway for erythroid iron delivery through lysosomal trafficking of transferrin receptor 2［J］.Blood Adv，2017，1（15）：1181-1194.

［16］WOLFF N A，GARRICK M D，ZHAO L，et al.A role for divalent metal transporter（DMT1）in mitochondrial uptake of iron and manganese［J］.Sci Rep，2018，8（1）：211.

［17］ABOUHAMED M，GBUREKJ，LIU W，et al.Divalent metal transporter 1 in the kidney proximal tubule is expressed in late endosomes/lysosomal membranes：implications for renal handling of proteinmetal complexes［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2006，290（6）：F1525-1533.

［18］WILLEMETZ A，BEATTY S，RICHER E，et al.Iron-and hepcidin-independent downregulation of the iron exporter ferroportin in macrophages during Salmonella infection［J/OL］.Front Immunol，2017，8：498.

［19］ANTONELLO P.Ferroportin disease：pathogenesis，diagnosis and treatment［J］.Haematologica，2017，102（12）：1972-1984.

［20］藺艷，錢忠明，科亞.腎臟鐵代謝蛋白的表達(dá)與功能［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2011，38（2）：113-118.