馬拉色菌在特應(yīng)性皮炎患者皮損區(qū)和非皮損區(qū)定植情況的研究*

陸 茂，冉玉平，代亞玲，歐 美，吳紅梅，羅媛元

1.四川大學(xué)華西醫(yī)院 皮膚科(成都 610041)；2．成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 皮膚科(成都 610500)

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis, AD)是一種臨床常見的復(fù)發(fā)性、瘙癢性、炎癥性皮膚病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能是遺傳因素、免疫因素、環(huán)境因素、感染因素等共同作用所致。與感染因素有關(guān)的微生物主要有金黃色葡萄球菌，其次是真菌(包括馬拉色菌及念珠菌等)[1-2]。目前，國外有關(guān)馬拉色菌在AD患者皮膚定植情況的報道[3-4]較多，但陽性檢出率及菌種構(gòu)成差異較大，可能與種族、地區(qū)及鑒定方法不同有關(guān)，而國內(nèi)相關(guān)報道很少。本研究采用Sugita等[5]實時熒光定量 PCR方法，對從AD患者面部、上肢、背部皮損區(qū)和非皮損區(qū)皮膚鱗屑提取的馬拉色菌DNA進(jìn)行定量PCR檢測，分析國內(nèi)AD患者皮損區(qū)和非皮損區(qū)馬拉色菌的分布特點和菌種構(gòu)成?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年3—5月四川大學(xué)華西醫(yī)院皮膚科門診或住院就診的AD患者共28例，符合AD診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。其中，男15例，女13例；年齡1～12(5.25±3.64)歲。參照濕疹面積及嚴(yán)重度指數(shù)(eczema area and severity index, EASI)評分法[7]，對患者病情嚴(yán)重程度進(jìn)行評分，得分1.2～55.2(12.57±11.71)分。23例健康對照者來自我院工作人員子女，男13例，女10例，年齡2～15(6.69±3.71)歲。所有研究對象2周內(nèi)無使用抗真菌藥物和糖皮質(zhì)激素史，采樣前24 h內(nèi)不能在采樣部位使用任何清潔用品(包括水洗)或藥物，不伴有其他皮膚病，不伴有腫瘤或其他嚴(yán)重疾患。兩組研究對象性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對象在入組前均已獲得知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

OpSiteTM無菌透明敷貼(英國Smith and Nephew Medical公司)；1M Tris-HCI、10%SDS、0.5M EDTA、TE緩沖液(日本W(wǎng)ako公司)；苯酚/氯仿/異戊醇溶液(美國Invitrogen公司)；氯仿、異戊醇、無水乙醇(上海索萊寶生物科技有限公司)；3M乙酸鈉、Ethatimate(日本Nippon Gene公司)；pUC57載體、大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞(上海生工生物工程股份有限公司)；QIAprep Spin Miniprep Kit質(zhì)粒小量提取試劑盒(德國Qiagen公司)；S1000TM Thermal Cycler基因擴(kuò)增儀、Power PAC300電泳儀、GelDoc1000型數(shù)字化凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)；FTC2000熒光定量PCR儀(加拿大Funglyn Biotech公司)；Ultrospec 3100 pro紫外分光光度計(美國GE公司)。

1.3 引物與探針的設(shè)計和合成

參照Sugita等[5]設(shè)計的馬拉色菌屬、球形馬拉色菌、限制馬拉色菌特異性引物和探針，由北京華大基因研究中心合成3對引物以及與之對應(yīng)的MGB熒光探針(表1)。

表1 實時熒光定量PCR 所用的引物及探針

1.4 采樣

以O(shè)pSiteTM無菌透明敷貼采集AD患者3個部位(面部、上肢、背部)皮損區(qū)和非皮損區(qū)以及健康對照者相應(yīng)區(qū)域的皮膚鱗屑。敷貼重復(fù)粘貼同一區(qū)域3次以保證菌量。取一部分敷貼(3 cm×3 cm)進(jìn)行直接DNA提取。

1.5 馬拉色菌基因DNA的提取

向1.5 mL無菌EP管加入700 μL lysing solution(100 mM Tris-HCl，30 mM EDTA，0.5%SDS)，然后取3 cm×3 cm敷貼放入EP管中，置于100 ℃，干浴15 min，離心半徑5 cm，14 000 r/min，離心5 min，取200 L上清液轉(zhuǎn)移到一個新的1.5 mL無菌EP管中。加入100 μL苯酚/氯仿/異戊醇溶液(25∶24∶1)混勻，離心半徑5 cm，14 000 r/min，離心5 min，取200 μL上清液轉(zhuǎn)移到1個新的1.5 mL的無菌EP 管中。加入100 μL氯仿/異戊醇溶液(24∶1)混勻，離心半徑5 cm，14 000 r/min，離心5 min，取200 μL上清液轉(zhuǎn)移到一個新的1.5 mL的無菌EP 管中。加入3.3 μL 3M乙酸鈉，混勻5 s，再加入1 μL Ethatimate，混勻5 s，向每管加入500 μL無水乙醇，混勻3 s，離心半徑5 cm，14 000 r/min，離心20 min。棄上清，加入200 μL70%乙醇，離心半徑5 cm，14 000 r/min，離心5 min。棄乙醇，室溫下干燥30 min。加入30 μL TE緩沖液，至DNA完全溶解后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建與驗證

由北京華大基因研究中心人工合成馬拉色菌屬、球形馬拉色菌、限制馬拉色菌特異性引物上下游相應(yīng)區(qū)域約150 bp片段[5]，作為構(gòu)建馬拉色菌屬、球形馬拉色菌、限制馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒所需插入的序列(標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的序列涵蓋擴(kuò)增片段即可)。合成產(chǎn)物與 pUC57載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，用含有 LB瓊脂平板篩選陽性克隆，用 PCR 擴(kuò)增鑒定陽性克隆菌，并對陽性重組質(zhì)粒測序驗證。用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，紫外分光光度計測定濃度與純度，計算拷貝數(shù)。將重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋制備不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品陽性質(zhì)粒模板，用于實時熒光定量PCR反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

1.7 PCR反應(yīng)

反應(yīng)體積為10 μL：PCR buffer 5 μL，正方向引物、探針各0.2 μL，模板DNA 2 μL，去離子水2.35 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性20 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸10 min。選用實驗室保存的白色念珠菌(ATCC10231)以及表皮葡萄球菌(ATCC040188)標(biāo)準(zhǔn)株作為對照，檢驗馬拉色菌引物的特異性。擴(kuò)增時均用去離子水作為模板設(shè)陰性對照，每板均帶標(biāo)準(zhǔn)曲線，3孔重復(fù)。分別以 105～109拷貝/反應(yīng)，于同等條件下進(jìn)行實時熒光定量PCR，每個稀釋度設(shè)置 3孔重復(fù)。以各標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct 值為縱坐標(biāo)，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測未知樣品的 Ct 值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的拷貝數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PCR質(zhì)量控制

馬拉色菌屬、球形馬拉色菌、限制馬拉色菌重組質(zhì)粒10倍倍比稀釋101～108拷貝/反應(yīng)，于同等條件下進(jìn)行熒光定量PCR，均得到陽性擴(kuò)增曲線，白念珠菌以及表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株作為對照，無陽性結(jié)果。馬拉色菌屬、球形馬拉色菌、限制馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均≥0.995，擴(kuò)增效率為96.15%～102.97%，反映了標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的線性度和反應(yīng)效率。

2.2 AD患者、健康對照者各部位馬拉色菌拷貝數(shù)比較

AD患者、健康對照者各部位馬拉色菌拷貝數(shù)比較結(jié)果顯示：部位與區(qū)域交互作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；AD患者面部皮損區(qū)、非皮損區(qū)和健康對照者面部馬拉色菌屬、球形馬拉色菌、限制馬拉色菌拷貝數(shù)均高于上肢、背部相應(yīng)區(qū)域，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，上肢與背部比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；AD患者同一部位皮損區(qū)、非皮損區(qū)、健康對照者相應(yīng)區(qū)域馬拉色菌屬、球形馬拉色菌、限制馬拉色菌拷貝數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 AD患者、健康對照者不同部位馬拉色菌拷貝數(shù)比較

注：與面部比較，*P<0.05

2.3 AD患者各部位馬拉色菌拷貝數(shù)與EASI評分的相關(guān)性

AD患者面部、上肢、背部的皮損區(qū)、非皮損區(qū)馬拉色菌屬拷貝數(shù)與EASI評分均無相關(guān)性(r=0.282、0.139、0.210、0.175、0.253、0.148，P>0.05)；AD患者面部、上肢、背部的皮損區(qū)、非皮損區(qū)球形馬拉色菌拷貝數(shù)與EASI評分均無相關(guān)性(r=0.360、0.162、0.231、0.181、0.284、0.054，P>0.05)；AD患者面部、上肢、背部的皮損區(qū)、非皮損區(qū)限制馬拉色菌拷貝數(shù)與EASI評分均無相關(guān)性(r=0.166、0.135、0.314、0.223、0.220、0.184，P>0.05)。

2.4 AD患者、健康對照者各部位馬拉色菌菌種構(gòu)成

AD患者及健康對照者各部位馬拉色菌菌種構(gòu)成均以球形馬拉色菌和限制馬拉色菌為主，兩者占比合計達(dá)80%以上。AD患者、健康對照者各部位馬拉色菌占比結(jié)果顯示：菌種與區(qū)域交互作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)； AD患者各部位皮損區(qū)、非皮損區(qū)和健康對照者相應(yīng)區(qū)域球形馬拉色菌、限制馬拉色菌占比比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；AD患者各部位皮損區(qū)、非皮損區(qū)和健康對照者相應(yīng)區(qū)域同一菌種占比比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 AD患者、健康對照者各部位球形馬拉色菌、限制馬拉色菌占比比較

3 討論

馬拉色菌現(xiàn)分為14個種，傳統(tǒng)的菌種鑒定方法是在分離培養(yǎng)后進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化學(xué)特性分析。近年來，隨著皮膚微生態(tài)研究技術(shù)的不斷發(fā)展，基于培養(yǎng)的鑒定方法已逐漸被認(rèn)識到存在以下3個方面的不足：1)馬拉色菌各菌種對營養(yǎng)條件的需求不同，生長速度不一，不同菌種生長條件和快慢有差異，不同菌種易發(fā)生相互抑制生長，容易生長的菌種可抑制和掩蓋不易生長的菌種；2)準(zhǔn)確的馬拉色菌菌種結(jié)構(gòu)分析要求待測標(biāo)本中所有種類的馬拉色菌均能在培養(yǎng)基中生長復(fù)蘇，但迄今尚無一種培養(yǎng)基能滿足所有馬拉色菌菌種的生長要求；3)各菌種的形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)會隨著培養(yǎng)方法的不同而發(fā)生變化，加上判斷結(jié)果時受主觀因素和客觀條件的影響均比較大，形態(tài)學(xué)和生理生化學(xué)鑒定方法所得出的結(jié)果不可避免存在一定誤差，同時不同實驗室之間數(shù)據(jù)分享和橫向比較也存在一定的困難[8-9]。基于分離培養(yǎng)的鑒定方法曾經(jīng)廣泛應(yīng)用于健康者和AD患者皮膚馬拉色菌研究中，大多數(shù)此類方法的研究[4,10]結(jié)果表明，球形馬拉色菌、糠秕馬拉色菌和合軸馬拉色菌是AD患者皮膚的優(yōu)勢菌種。隨著對馬拉色菌微生態(tài)研究深入，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)法的偏向性和局限性使其誤差較大，比較突出的問題是限制馬拉色菌的檢出率很低甚至檢測不到，可能是由于限制馬拉色菌在培養(yǎng)中生長緩慢，常被其他馬拉色菌菌種抑制和掩蓋所致。為避免培養(yǎng)法的局限性，國際上逐漸采用不依賴于培養(yǎng)的分子研究方法(非培養(yǎng)法)來鑒定馬拉色菌菌種。2001年，Sugita等[11]首次報道了一種通過敷貼粘取鱗屑標(biāo)本直接提取馬拉色菌DNA，然后經(jīng)巢式PCR進(jìn)行定性研究的非培養(yǎng)鑒定方法，此方法不僅使菌種檢測靈敏度明顯提高，還避免了培養(yǎng)環(huán)節(jié)對馬拉色菌各菌種生長的影響，可真實反映馬拉色菌原位定植情況。2006年，Sugita等[5]在上述方法的基礎(chǔ)上，采用實時熒光定量 PCR對日本34例AD患者頭頸部、軀干、上肢皮損區(qū)馬拉色菌DNA進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示AD患者頭頸部的馬拉色菌含量是軀干的12.4倍、四肢的6.8倍，其中球形馬拉色菌、限制馬拉色菌分別占馬拉色菌總量的30.3%～34.7%、45.4%～51.0%。此方法可明確馬拉色菌的原位含量和菌種構(gòu)成比例，有助于馬拉色菌的微生態(tài)研究以及相關(guān)疾病的療效判定，已應(yīng)用到多種馬拉色菌相關(guān)疾病和正常健康者的研究中[8,12-13]。2011年，Kaga等[14]又報道了用同樣的方法研究輕、中、重度共56例頭頸部AD患者皮損區(qū)和32例健康對照者相應(yīng)區(qū)域的馬拉色菌含量和構(gòu)成，結(jié)果顯示馬拉色菌含量和構(gòu)成與病情嚴(yán)重程度有關(guān)，重度AD患者馬拉色菌含量是輕、中度患者和健康對照者的2～5倍。Akaza等[15]用實時熒光定量PCR分析日本20例男性AD患者和47例女性AD患者面部、軀干上部馬拉色菌定植情況，結(jié)果表明，中重度女性患者面部馬拉色菌含量多于輕度患者，女性軀干上部和男性兩個部位馬拉色菌含量與病情嚴(yán)重程度無關(guān)。綜上所述，大多數(shù)研究結(jié)果顯示，AD患者面部馬拉色菌含量高于軀干和四肢，菌種構(gòu)成以球形馬拉色菌和限制馬拉色菌為主，但馬拉色菌含量與疾病嚴(yán)重程度之間的關(guān)系尚存爭議。

本研究結(jié)果顯示，AD患者面部皮損區(qū)、非皮損區(qū)和健康對照者面部馬拉色菌屬、球形馬拉色菌、限制馬拉色菌拷貝數(shù)均高于上肢、背部相應(yīng)區(qū)域，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而上肢、背部馬拉色菌含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；AD患者同一部位皮損區(qū)、非皮損區(qū)與健康對照者相應(yīng)區(qū)域馬拉色菌含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；AD患者各部位皮損區(qū)、非皮損區(qū)馬拉色菌含量與病情嚴(yán)重程度無關(guān)；AD患者、健康對照者各部位馬拉色菌菌種構(gòu)成均以球形馬拉色菌和限制馬拉色菌為主。盡管人種、氣候、生活環(huán)境存在一定差異，本研究定量分析結(jié)果與日本學(xué)者[5,14-15]研究結(jié)果基本相符，這也從另一方面說明此方法實驗重復(fù)性較好，可用于多中心不同實驗室的數(shù)據(jù)分享和橫向研究。

AD患者普遍存在皮膚屏障功能障礙，定植于皮膚表面的馬拉色菌容易進(jìn)入體內(nèi)，然后通過特異性IgE抗體和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)釋放炎癥介質(zhì)，這些炎癥介質(zhì)不僅可使局部炎癥加重，引起瘙癢、搔抓，破壞皮膚屏障功能，而且可直接影響與皮膚屏障功能有關(guān)的絲聚蛋白和神經(jīng)酰胺的合成[16-17]，還能抑制皮膚表面具有抵御病原微生物活性的抗菌肽合成[18]，上述效應(yīng)都更加有利于馬拉色菌定植和入侵，形成惡性循環(huán)。此外，由于馬拉色菌是嗜脂性酵母菌，好定植于頭頸部，通過此處進(jìn)入人體的馬拉色菌量較其余部位多，因此該部位的炎癥反應(yīng)和皮膚屏障受損程度更重，也更有利于馬拉色菌在此處的定植和入侵。這些都有可能導(dǎo)致AD患者面部馬拉色菌含量高于其他部位，較正常人更加明顯。

既往有研究[19-21]表明，AD患者(尤其是頭頸部AD患者)血清中抗馬拉色菌特異性IgE抗體水平明顯高于健康對照者，而且血清抗馬拉色菌特異性IgE抗體水平與病情嚴(yán)重程度有相關(guān)性，提示AD患者病情嚴(yán)重程度與進(jìn)入體內(nèi)引起免疫反應(yīng)馬拉色菌的量有關(guān)。由于AD患者多有皮膚屏障功能障礙，進(jìn)入體內(nèi)馬拉色菌的多少不是只由皮膚表面馬拉色菌含量高低來決定的，此外皮損的性質(zhì)、局部免疫反應(yīng)也可能對馬拉色菌定植難易程度有影響，由此可以從理論上推測，AD患者皮膚表面馬拉色菌含量不一定與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。

[1]Bjerre R D, Bandier J, Skov L,etal. The role of the skin microbiome in atopic dermatitis: a systematic review[J]. Br J Dermatol, 2017, 177(5): 1272-1278.

[3]Jagielski T, Rup E, Zió1 kowska A,etal. Distribution of Malassezia species on the skin of patients with atopic dermatitis, psoriasis, and healthy volunteers assessed by conventional and molecular identification methods[J]. BMC Dermatol, 2014, 14: 3.

[4]Prohi A, Jovovi Sadikovi T, Kuskunovi-Vlahovljak S,etal. Distribution of Malassezia Species in Patients with Different Dermatological Disorders and Healthy Individuals[J]. Acta Dermatovenerol Croat, 2016, 24(4): 274-281.

[5]Sugita T, Tajima M, Tsubuku H,etal. Quantitative analysis of cutaneous malassezia in atopic dermatitis patients using real-time PCR[J]. Microbiol Immunol, 2006, 50(7): 549-552.

[6]張學(xué)軍．皮膚性病學(xué)[M]．第8版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：113．

[7]趙辨. 濕疹面積及嚴(yán)重度指數(shù)評分法[J]. 中華皮膚科雜志, 2004, 37(1)：7-8.

[8]Saad M, Sugita T, Saeed H,etal. Molecular epidemiology of Malassezia globosa and Malassezia restricta in Sudanese patients with pityriasis versicolor[J]. Mycopathologia, 2013, 175(1/2): 69-74.

[9]冉玉平. 馬拉色菌及其相關(guān)皮膚病診治進(jìn)展[J]. 皮膚性病診療學(xué)雜志, 2011, 18(3):142-143.

[10] Kim S Y, Lee Y W, Choe Y B,etal. Progress in Malassezia Research in Korea[J]. Ann Dermatol, 2015, 27(6): 647-657.

[11] Sugita T, Suto H, Unno T,etal. Molecular analysis of malassezia microflora on the skin of atopic dermatitis patients and healthy subjects[J]. Nihon Ishinkin Gakkai Zasshi, 2001, 42(4): 217-218.

[12] Zhang E, Tanaka T, Tsuboi R,etal. Characterization of Malassezia microbiota in the human external auditory canal and on the sole of the foot[J]. Microbiol Immunol, 2012, 56(4): 238-244.

[13] Takahata Y, Sugita T, Hiruma M,etal. Quantitative analysis of Malassezia in the scale of patients with psoriasis using a real-time polymerase chain reaction assay[J]. Br J Dermatol, 2007, 157(4): 670-673.

[14] Kaga M, Sugita T, Nishikawa A,etal. Molecular analysis of the cutaneous Malassezia microbiota from the skin of patients with atopic dermatitis of different severities[J]. Mycoses, 2011, 54(4): e24-e28.

[15] Akaza N, Akamatsu H, Sasaki Y,etal. Cutaneous Malassezia microbiota in atopic dermatitis patients differ by gender and body part[J]. Dermatology (Basel), 2010, 221(3): 253-260.

[16] Rerknimitr P, Otsuka A, Nakashima C,etal. The etiopathogenesis of atopic dermatitis: barrier disruption, immunological derangement, and pruritus[J]. Inflamm Regen, 2017, 37: 14.

[17] Koppes S A, Brans R, Ljubojevic Hadzavdic S,etal. Stratum Corneum Tape Stripping: Monitoring of Inflammatory Mediators in Atopic Dermatitis Patients Using Topical Therapy[J]. Int Arch Allergy Immunol, 2016, 170(3): 187-193.

[18] Schmid-Grendelmeier P, Ballmer-Weber B K. Atopic dermatitis -current insights into path physiology and management[J]. Ther Umsch, 2010, 67(4): 175-185.

[19] Glatz M, Bosshard P P, Hoetzenecker W,etal. The Role of Malassezia spp. in Atopic Dermatitis[J]. J Clin Med, 2015, 4(6): 1217-1228.

[20] Brodská P, Panzner P, Pizinger K,etal. IgE-mediated sensitization to malassezia in atopic dermatitis: more common in male patients and in head and neck type[J]. Dermatitis, 2014, 25(3): 120-126.

[21] Glatz M, Buchner M, von Bartenwerffer W,etal. Malassezia spp.-specific immunoglobulin E level is a marker for severity of atopic dermatitis in adults[J]. Acta Derm Venereol, 2015, 95(2): 191-196.