新型在線凈化前處理HPLC-MS/MS測(cè)定香精香料中的麥角甾醇和麥角甾酮

李 晶，倪朝敏，陳建華，米其利，孔維松，王曉輝，楊光宇，李雪梅，楊葉昆*

（云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650106）

香精香料是重要的添加劑，與食品安全休戚相關(guān)，因此對(duì)香精香料進(jìn)行霉變監(jiān)控與預(yù)防具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[1-3]。麥角甾醇和麥角甾酮是真菌細(xì)胞膜中的主要甾體類化合物，主要存在于絕大多數(shù)的真菌細(xì)胞膜中[4]，維系著真菌細(xì)胞的正常代謝[5-8]，據(jù)報(bào)道麥角甾醇的量與真菌的生物量存在著相關(guān)關(guān)系（麥角甾醇可作為評(píng)價(jià)糧食質(zhì)量安全的敏感指標(biāo)之一）；因其在大部分植物中不含有或含量很小，其良好的特異性和穩(wěn)定性使其可作為霉菌污染的標(biāo)記物[9]，作為質(zhì)量安全指標(biāo)在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的研究與應(yīng)用[10-13]。

目前，對(duì)麥角甾酮與麥角甾醇的定性與定量分析研究已經(jīng)很多，主要報(bào)道的方法有毛細(xì)管電泳法[14]、高效液相色譜法[15-20]、液相色譜-質(zhì)譜法[21-22]和氣相色譜-質(zhì)譜法[23-27]等。由于香精香料基質(zhì)復(fù)雜，有些樣品具有高水分高糖分的特點(diǎn)，單純利用液相色譜紫外檢測(cè)存在著定性困難的問(wèn)題，而利用氣相色譜方法存在著前處理復(fù)雜的問(wèn)題，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）在定性和定量方面都具有其優(yōu)點(diǎn)，目前香精香料中麥角甾酮和麥角甾醇同時(shí)測(cè)定的方法還鮮見報(bào)道。

基質(zhì)固相分散前處理是近年來(lái)一種新的固相提取技術(shù)[28]，可以將提取凈化集于一體，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基質(zhì)復(fù)雜樣品的前處理，可以有效避免HPLC-MS/MS由于基體效應(yīng)造成的信號(hào)影響[29]。本研究基于基質(zhì)固相分散處理的原理，設(shè)計(jì)開發(fā)出一種新型的在線凈化前處理裝置，用于基質(zhì)復(fù)雜的香精香料的前處理凈化，方法操作簡(jiǎn)單，凈化萃取濃縮為一體，經(jīng)過(guò)提取凈化后的樣品利用HPLC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定，可以應(yīng)用于香精香料中麥角甾醇和麥角甾酮的監(jiān)控分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥角甾醇、麥角甾酮（純度≥99%） 加拿大Chromadex公司；膽甾烷醇酮-6-酮（純度＞99.0%） 百靈威科技有限公司；甲醇、乙腈、二氯甲烷（均為色譜純）美國(guó)Merk公司；球形硅膠（40～60 μm） 德國(guó)默克公司；硫酸鈉（分析純） 西隴化工有限公司；硫酸鈉于200 ℃烘烤6 h后，冷卻放入磨口塞玻璃瓶?jī)?nèi)，置于干燥器內(nèi)備用；所有實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水（18.2 MΩ·cm），由Milli-Q超純水純化系統(tǒng)制得。

香精香料樣品為某香精香料生產(chǎn)企業(yè)提供，模擬霉變樣品為實(shí)驗(yàn)室自制樣品，采用增加水分后在空氣相對(duì)濕度80%，溫度37 ℃條件下高溫高濕培養(yǎng)加速霉變，直至得到感官明顯能感覺到霉變的樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY超高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；API4000QTRAP質(zhì)譜儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；Milli-Q50超純水儀 美國(guó)Millipore公司；BT224S電子天平（感量0.1 mg） 德國(guó)Sartorius公司；SK5200型超聲波振蕩器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；0.45 μm有機(jī)針式過(guò)濾器 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確稱取5.0 mg（精確至0.1 mg）的麥角甾醇和麥角甾酮于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度均為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使用時(shí)用甲醇稀釋成所需質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

內(nèi)標(biāo)溶液：稱取5.0 mg的膽甾烷醇酮-6-酮至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液；使用時(shí)稀釋成50 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.3.2 HPLC-MS/MS條件

色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLCTMBEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相：A為水，B為HPLC級(jí)甲醇；流動(dòng)相梯度洗脫程序：0.0～6.0 min，95% B遞增至100% B；6.0～7.5 min保持100% B；8.0 min還原為初始狀態(tài)95% B。

質(zhì)譜條件：電離方式：大氣壓化學(xué)電離源；正離子模式掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；電噴霧電壓5 500 V；離子源溫度650 ℃；離子對(duì)的駐留監(jiān)測(cè)時(shí)間100 ms；輔助氣Gas1壓力60 psi；輔助氣Gas2壓力70 psi；各分析物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見表1。

表1 化合物質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Table1 MS parameters of the analytes

1.3.3 樣品前處理

本研究設(shè)計(jì)了一個(gè)基于固相分散萃取和硅膠柱層析的新型在線凈化裝置，如圖1所示。裝置以索式提取裝置為基礎(chǔ)，進(jìn)行了提取凈化固相試劑的裝填，以及方便進(jìn)行溶劑回收的三通閥和用于定量濃縮的有刻度的尾管設(shè)計(jì)。

圖1 樣品前處理裝置的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Schematic of the sample preparation apparatus

處理步驟如下：1）準(zhǔn)確稱取香精或料液樣品1.0 g，加入質(zhì)量濃度為50 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液200 μL，然后加入2.0 g的硅膠和樣品充分研磨均勻；2）在樣品前處理裝置中的填料管中加入一個(gè)篩板以防止硅膠滑落，先加入10 g硅膠，微微振動(dòng)，使硅膠在篩板上形成一層，然后將樣品硅膠加入填料管，稍微振動(dòng)，使之填充嚴(yán)實(shí)，形成樣品硅膠層；之后再在樣品硅膠層鋪2.5 g無(wú)水硫酸鈉，同樣振動(dòng)，使之裝填嚴(yán)實(shí)平整。3）將裝填好的填料管連接上索式提取器，在燒瓶中加入60 mL二氯甲烷，三通閥調(diào)整為填料管連接燒瓶狀態(tài)，水浴60 ℃條件下加熱回流提取樣品45 min。4）樣品提取完后，三通閥調(diào)整為提取管與溶劑回收口相通狀態(tài)，使溶劑從回收口流出，回收溶劑并濃縮樣品直至燒瓶尾管中的樣品溶液濃縮盡干；5）向尾管中加入1 mL乙腈溶解殘余物，溶液用0.45 μm濾膜過(guò)濾后，按選定儀器條件測(cè)定麥角甾醇和麥角甾酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件

2.1.1 樣品前處理裝置

對(duì)于麥角甾醇和麥角甾酮的測(cè)定，樣品前處理一般分為樣品提取、固相萃?。ɑ蛑鶎游觯﹥艋?、濃縮三步；采用的方法多為樣品用溶劑提取，然后用硅膠固相萃取柱（或反相固相萃?。﹥艋?，再供儀器分析用。為簡(jiǎn)化操作，本研究設(shè)計(jì)了一個(gè)帶柱層析功能的索氏提取裝置（圖1），裝置由普通索式提取裝置改裝而來(lái)（球形燒瓶500 mL，抽出筒直徑40 mm，抽出筒長(zhǎng)190 mm），對(duì)抽出筒下端進(jìn)行改裝，加入了1 個(gè)三通閥進(jìn)行溶劑的冷凝或者回收。樣品利用硅膠進(jìn)行基質(zhì)分散，裝填好篩板、硅膠層、樣品硅膠層和無(wú)水硫酸鈉層，將三通閥調(diào)整到提取管與圓底燒瓶相通的狀態(tài)，啟動(dòng)水浴鍋加熱，溶劑蒸發(fā)后再經(jīng)冷凝管回流冷凝到填料管中；溶劑把樣品中的麥角甾醇和麥角甾酮洗脫下來(lái)，通過(guò)硅膠層進(jìn)行凈化，部分極性雜質(zhì)被凈化；回流后的樣品溶液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉層干燥，以便于溶劑回流和冷凝，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的回流提取，樣品中的麥角甾醇和麥角甾酮被完全提取并轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶?jī)?nèi)；然后轉(zhuǎn)換三通閥，讓溶劑從溶劑回收出口流出，這樣圓底燒瓶中的溶液不斷被濃縮，當(dāng)溶劑濃縮到干后，換成反相色譜分析常用溶劑乙腈進(jìn)行殘余樣品的溶解，即可供液相色譜分析用。

2.1.2 前處理溶劑選擇

本研究中樣品前處理的關(guān)鍵步驟是硅膠固相萃取凈化，溶劑的選擇非常重要，溶劑對(duì)硅膠柱的洗脫強(qiáng)度適當(dāng)才能讓麥角甾醇和麥角甾酮從硅膠柱上洗脫，并讓雜質(zhì)更多地保留在柱上，從而達(dá)到樣品凈化的目的。硅膠為極性固定相，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┫疵摽勺岥溄晴薮己望溄晴尥c樣品中的共存組分分離而達(dá)到樣品凈化。由于麥角甾醇和麥角甾酮均為小極性化合物，用溶劑強(qiáng)度相對(duì)弱的溶劑洗脫可把待測(cè)成分完全洗脫下來(lái)，而香精香料中的糖類、有機(jī)酸、酯類、醇類、醛、酮等中大極性的干擾成分大部分保留在硅膠柱，這樣可達(dá)到樣品凈化的效果。通過(guò)實(shí)驗(yàn)石油醚、環(huán)己烷、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷對(duì)樣品的凈化效果，結(jié)果表明石油醚、環(huán)己烷、正己烷溶劑洗脫強(qiáng)度較弱，麥角甾醇和麥角甾酮不能被完全洗脫，回收率低于50%；二氯甲烷和三氯甲烷具有較強(qiáng)的洗脫能力，麥角甾醇和麥角甾酮回收率均在90%以上；實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如果換成極性更大的乙酸乙酯或丙酮作為洗脫溶劑，麥角甾醇和麥角甾酮也能被完全洗脫，但由于洗脫下來(lái)的雜質(zhì)成分也相應(yīng)增加，樣品濃縮時(shí)容易出現(xiàn)沉淀或變渾濁，影響樣品的凈化效果?？紤]到二氯甲烷毒性比三氯甲烷低，而且沸點(diǎn)低，容易實(shí)現(xiàn)回流，因此，本實(shí)驗(yàn)中選擇二氯甲烷作為前處理中的溶劑。

2.1.3 前處理溶劑體積優(yōu)化

在提取實(shí)驗(yàn)中，需在提取裝置中加入足夠量的溶劑，以保持溶劑在前處理過(guò)程中能回流循環(huán)；本實(shí)驗(yàn)中采用體積為50 mL的提取管，實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)提取裝置中的溶劑量達(dá)40 mL時(shí)能保持正?；亓餮h(huán)，溶劑加入量在50～80 mL之間待測(cè)組分的回收率均穩(wěn)定，均在90%以上，繼續(xù)增加溶劑量對(duì)待測(cè)組分的回收率沒有影響，但會(huì)導(dǎo)致樣品前處理的溶劑消耗增加?？紤]到在樣品前處理過(guò)程中溶劑因蒸發(fā)而有少量損失，因此選擇在提取器中加入60 mL的二氯甲烷溶劑。

2.1.4 前處理溫度優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行不同前處理溫度回收率的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二氯甲烷沸點(diǎn)僅為39.8 ℃，當(dāng)水浴溫度超過(guò)45 ℃時(shí)，尾管燒瓶中的溶劑開始沸騰，隨溫度升高，溶劑蒸發(fā)速度迅速加快，當(dāng)溫度達(dá)到55～65 ℃時(shí)溶劑蒸發(fā)速率能達(dá)到5 mL/min左右（稍大于提取管內(nèi)柱層析上的流下速度）。如果溫度低于55 ℃，溶劑蒸發(fā)慢，需延長(zhǎng)樣品處理時(shí)間。由于洗脫流速受硅膠柱的控制，進(jìn)一步升高溫度雖然會(huì)增加溶劑的蒸發(fā)速率，但過(guò)量的溶劑會(huì)從導(dǎo)氣管分流出，不能加快洗脫速率；而且溫度過(guò)高會(huì)增加提取過(guò)程中的溶劑損失，增加樣品前處理過(guò)程中的溶劑消耗并污染實(shí)驗(yàn)室環(huán)境；因此，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化選擇水浴溫度為60 ℃。

2.1.5 前處理提取時(shí)間優(yōu)化

圖2 提取時(shí)間對(duì)回收率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the recovery

選取經(jīng)硅膠基質(zhì)分散的樣品，在60 ℃的水浴中進(jìn)行回流提取，考察提取時(shí)間對(duì)麥角甾醇和麥角甾酮測(cè)定結(jié)果的影響。比較了提取時(shí)間分別為20、25、30、35、40、45、50、60 min的測(cè)定結(jié)果，如圖2所示。結(jié)果表明：提取時(shí)間在40 min以后麥角甾醇和麥角甾酮萃取效率達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值，測(cè)定結(jié)果趨于穩(wěn)定，進(jìn)一步延長(zhǎng)提取時(shí)間則會(huì)導(dǎo)致更多的雜質(zhì)洗脫下來(lái)而影響樣品的凈化效果；為節(jié)約時(shí)間并避免引入更多的干擾成分，本實(shí)驗(yàn)選擇45 min作為樣品提取的最佳時(shí)間。

2.2 HPLC-MS/MS分析條件優(yōu)化

通過(guò)查閱文獻(xiàn)，膽甾烷醇酮-6-酮可用作HPLC-MS/MS測(cè)定甾醇的內(nèi)標(biāo)物[30]，由于它們的化學(xué)性質(zhì)基本相同，可以最大限度地減少因?yàn)闃悠窊p失造成的分析誤差，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性；而且膽甾烷醇酮-6-酮不是香精香料中的固有成分，其保留時(shí)間和待測(cè)組分不重疊，故本實(shí)驗(yàn)中選擇膽甾烷醇酮-6-酮作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

在固定其他條件不變，本研究中優(yōu)化選用大氣壓化學(xué)電離源為離子源，[M+H]+是信號(hào)比較強(qiáng)的離子碎片，其子離子掃描圖見圖3。因此本實(shí)驗(yàn)選擇正離子掃描模式。

由于在大氣壓化學(xué)電離模式下，乙酸銨、乙酸等電噴霧要求較低的揮發(fā)性緩沖鹽會(huì)抑制麥角甾醇等甾體類化合物的有效電離，使其響應(yīng)信號(hào)降低，故優(yōu)選甲醇-水體系作為流動(dòng)相，選擇5 μL進(jìn)樣量，色譜柱溫度為40 ℃。

圖3 麥角甾醇（a）和麥角甾酮的二級(jí)質(zhì)譜圖（b）Fig.3 Tandem mass spectra of the analytes

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1 方法線性關(guān)系、檢出限和定量限結(jié)果

圖4 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.4 MRM chromatograms of standards

以甲醇作為溶劑，配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的方法進(jìn)行分析檢測(cè)，待測(cè)物質(zhì)能在5 min內(nèi)進(jìn)行有效分離，標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖如圖4所示。采用內(nèi)標(biāo)法得到的麥角甾醇和麥角甾酮的線性關(guān)系，檢出限和定量限見表2。其中檢出限和定量限分別取最低質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)10 次進(jìn)樣，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，由3 倍和10 倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差得到。

表2 麥角甾醇、麥角甾酮的線性關(guān)系、檢出限和定量限Table2 Linear regression equations, correlation coeff i cients, limits of detection and quantif i cation for the analytes

以目標(biāo)物質(zhì)的色譜峰面積Y對(duì)其質(zhì)量濃度X（μg/mL）進(jìn)行線性回歸。從表2可以看出，目標(biāo)檢測(cè)物質(zhì)在1.5～250 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999，麥角甾醇定量限為0.98 μg/mL，麥角甾酮定量限為1.16 μg/mL。

2.3.2 重復(fù)性考察結(jié)果

為考察方法的精密度，對(duì)5 種不同類型的模擬霉變香精香料進(jìn)行7 次日內(nèi)重復(fù)測(cè)定，結(jié)果表明，麥角甾醇的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.8%～3.2%之間，麥角甾酮的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.9%～3.4%之間，日內(nèi)測(cè)定結(jié)果方法的日內(nèi)精密度較好。采用所建立的檢測(cè)方法對(duì)5 種類型樣品進(jìn)行了7 d的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，麥角甾醇的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.1%～3.6%之間，麥角甾酮的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.3%～3.5%之間，方法的日間精密度較好。

2.3.3 方法的回收率結(jié)果

選取了5 種不同類型的模擬霉變香精香料，分別進(jìn)行了高（20 μg）、中（10 μg）、低（5 μg）3 個(gè)水平的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，麥角甾醇的回收率在91%～96%之間，麥角甾酮的回收率在86%～93%之間，方法回收率較為理想，可以應(yīng)用于實(shí)際樣品的分析測(cè)定。

2.4 實(shí)際樣品分析

圖5 實(shí)際樣品色譜圖Fig.5 MRM chromatograms of real sample

表3 12 種香精香料中目標(biāo)物質(zhì)含量的測(cè)定Table3 Contents of the target compounds in 12 real samples μg/g

用所建方法對(duì)12 種香精香料樣品進(jìn)行前處理，并用優(yōu)化的方法測(cè)定樣品中麥角甾醇和麥角甾酮含量，圖5為某模擬霉變香料樣品的MRM色譜，分析結(jié)果見表3。其中1、2、7～9為人工加速霉變的模擬樣品（處理方法如2.1節(jié)），并用文獻(xiàn)[21]的方法對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，本方法的分析結(jié)果和對(duì)照方法相符合，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

結(jié)果表明，除5 種人工模擬加速霉變的樣品外，其他企業(yè)在用的香精香料樣品中麥角甾醇和麥角甾酮含量均低于檢測(cè)限，說(shuō)明企業(yè)在用香精香料中暫時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)霉變風(fēng)險(xiǎn)，而本方法可以有效監(jiān)控和檢測(cè)到香精香料樣品的霉變情況。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以麥角甾醇和麥角甾酮為霉變標(biāo)志物，建立了一種新型在線凈化前處理HPLC-MS/MS測(cè)定香精香料中的麥角甾醇和麥角甾酮的方法，用于香精香料樣品霉變情況監(jiān)控的篩查。方法結(jié)合基質(zhì)分散萃取，柱層析以及索式提取創(chuàng)新性的開發(fā)設(shè)計(jì)了一個(gè)在線凈化前處理裝置，集萃取、凈化和濃縮為一體，具有前處理簡(jiǎn)便易操作，穩(wěn)定性強(qiáng)，溶劑可回收等優(yōu)點(diǎn)，方法優(yōu)化了液相色譜和質(zhì)譜的各個(gè)參數(shù)，采用內(nèi)標(biāo)法可以快速、有效地對(duì)香精香料中的麥角甾醇和麥角甾酮進(jìn)行測(cè)定，該方法已經(jīng)應(yīng)用于實(shí)際樣品的測(cè)定，可以對(duì)香精香料的安全風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行有效防控，具有重要應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

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