高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測鮮凍肉中違禁注水藥物

李志剛，任 南，馬燕紅*，李瑩瑩，郭文萍

（中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

注水肉[1]是少數(shù)不法商販在利益的驅(qū)動(dòng)下，在宰前或宰后對(duì)牲畜人為地采用注射器、壓力泵等工具，對(duì)豬、牛、羊等注入一定量的水分，以此增加酮體的質(zhì)量[2-3]。不潔凈的水進(jìn)入肌體會(huì)引起體細(xì)胞膨脹性的破裂，導(dǎo)致蛋白質(zhì)流失，降低的肉的品質(zhì)；注水后易造成病原微生物的污染，不僅使肉的營養(yǎng)成分受到破壞，而且還將產(chǎn)生大量的細(xì)菌毒素，甚至引入非肉源性污染物[4]，食用后會(huì)對(duì)食用者的身體造成傷害[5-8]。

目前僅依據(jù)水分含量是否超過GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》判定是否為注水肉。但畜禽肉類水分含量是一個(gè)很復(fù)雜的問題，水分含量受飼養(yǎng)方式、肉的部位、宰殺方式、銷售形式等因素影響[9]。前人采用感官判別法、試紙法[10-11]、近紅外法[12-13]、低場核磁共振法[14-15]、傳感器法[16]等鑒別注水肉。但目前仍無可行的注水肉判別方法。

畜肉注水通常是活體注入，利用機(jī)械泵等強(qiáng)行向動(dòng)物體內(nèi)灌水，此時(shí)由于外部的刺激，動(dòng)物體就會(huì)由于疼痛而產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，在這種條件下宰殺的畜肉會(huì)出現(xiàn)如白肌肉等品質(zhì)較差的肉，大大影響肉的銷售質(zhì)量。為了提高肉的質(zhì)量，確保肉的感官狀態(tài)良好，同時(shí)躲避監(jiān)管及處罰，不法商販對(duì)注水方式進(jìn)行改良，在注水的同時(shí)，為豬、牛、羊等注射一些保水藥物和消炎藥物，便于肌肉蓄積大量水分，并緩解其疼痛感。目前報(bào)道的用于豬肉保水劑的藥物有阿托品、東莨菪堿、山莨菪堿、利多卡因、普魯卡因和沙丁胺醇等[17-18]。殘留的藥物毒性較大，會(huì)引起如反應(yīng)遲頓、精神衰頹、昏迷、口干、瞳孔放大等癥狀[19-21]。該種作案手法不但隱蔽，而且大大改善了畜肉保水的效果，也降低了被查處的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也增加了監(jiān)管的難度。

畜肉中保水劑藥物的檢測方法較少，也未有任何相關(guān)的檢測標(biāo)準(zhǔn)。國內(nèi)外關(guān)于這類藥物的檢測也多見于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[22-25]。所用的方法有氣相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[17,26-28]。為了嚴(yán)厲打擊非法作案手段，加強(qiáng)畜肉屠宰、銷售的監(jiān)管，建立一種畜肉中阿托品、利多卡因、普魯卡因、山莨菪堿、東莨菪堿、沙丁胺醇等藥物準(zhǔn)確、便捷的檢測方法是非常必要且迫切的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿托品、利多卡因、普魯卡因、山莨菪堿、東莨菪堿、沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），甲醇、乙腈（均為色譜純） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；磷酸二氫鉀（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為一級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備

1260超高效液相色譜-6470串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；S-100渦旋儀、SR-IIw振蕩器 日本Taiyo公司；離心機(jī) 日本Hitachi公司；Milli-Q純水儀 美國Millipore公司；Oasis HLB固相萃取柱 沃特世科技（上海）有限公司；固相萃取柱活化流程：甲醇+三級(jí)水活化；三級(jí)水淋洗，甲醇接收。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用甲醇配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃冷藏保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別吸取各標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用甲醇配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用時(shí)將上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用水逐級(jí)稀釋為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用現(xiàn)配。

1.3.2 提取

稱取試料5 g（精確至0.01 g）于50 mL具塞離心管中，加入10 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，加蓋后渦旋2 min，再用振蕩器振蕩10 min，以10 000 r/min離心10 min，上清液倒入25 mL容量瓶中。于殘?jiān)性偌尤?0 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，同法操作，合并兩次上清液。用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液定容至刻線。

1.3.3 凈化

取上清液5 mL至HLB小柱，以小于3 mL/min通過Oasis HLB小柱后，用5 mL水淋洗，棄去全部流出液，在65 kPa的負(fù)壓下，減壓抽干1 min，最后用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈?，加?.00 mL甲酸-水（1∶99，V/V）溶液，渦旋0.5 min，過0.45 μm濾膜，供測定。

1.3.4 儀器條件

色譜條件：色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流動(dòng)相A：甲酸-水（1∶99，V/V）溶液；流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.40 mL/min。洗脫梯度見表1。

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradient elution program

表2 6 種藥物的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)Table2 Mass spectrometric parameters in MRM mode for 6 drugs

質(zhì)譜條件：電噴霧（electrospray ionization，ESI）離子源：正離子模式；毛細(xì)管電壓：3 500 V；干燥氣流速：8 L/min；噴針氣壓力：35 psi；噴嘴電壓：500 V；干燥氣溫度：300 ℃；鞘氣流速：11 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

6 種目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。6 個(gè)化合物均為弱極性化合物，在C18柱上有較好的保留。利多卡因、普魯卡因和沙丁胺醇均含氨基，容易得到帶正電荷的基團(tuán)，在正模式下靈敏度較高，因此選取正ESI模式檢測；在ESI+模式下，通過直接進(jìn)樣法，優(yōu)化各化合物的質(zhì)譜條件，確定各物質(zhì)的母離子的質(zhì)量數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在ESI+模式下，化合物得到[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，以此作為它們的母離子。在此基礎(chǔ)上，選擇兩個(gè)豐度較高的子離子，并優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量，最終選定定量分析的條件，結(jié)果見表2，6 種化合物定量離子流圖見圖2。

圖1 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of the target compounds

圖2 6 種化合物定量離子流圖Fig.2 MRM chromatograms of quantitative ion pairs for 6 compounds

2.2 提取條件優(yōu)化

圖3 提取劑對(duì)回收率的影響（n=3）Fig.3 Effect of extraction solvents on the recoveries (n = 3)

阿托品、山莨菪堿、東莨菪堿等含有活潑的羥基和酯基，普魯卡因、利多卡因和沙丁胺醇為氨基化合物，均極易溶于甲醇和水。對(duì)比了甲醇、水、磷酸鹽作提取溶劑，加標(biāo)量為25 μg/kg時(shí)的回收率。圖3表明，用磷酸鹽緩沖液作提取溶劑時(shí)，平均回收率達(dá)到85%，故本實(shí)驗(yàn)選取磷酸鹽緩沖液作為提取溶劑。

2.3 凈化條件的選擇與優(yōu)化

由于動(dòng)物源性食品基質(zhì)復(fù)雜，選用固相萃取柱可以得到較好的凈化效果。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了HLB、C18柱、MCX柱對(duì)目標(biāo)化合物的選擇性。圖4表明，HLB柱子對(duì)于磷脂和蛋白有較好的去除效果，對(duì)目標(biāo)化合物（添加量為25 μg/kg）回收率均高于C18柱和MCX柱。

圖4 SPE柱對(duì)回收率的影響（n=3）Fig.4 Effect of SPE columns on the recoveries (n = 3)

2.4 方法學(xué)結(jié)果

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是由基質(zhì)中的共提取干擾物與目標(biāo)化合物競爭電離所致[29]，鮮凍肉等肉類由于其脂肪、蛋白含量比較高，在樣品提取的過程中會(huì)由于這些復(fù)雜基質(zhì)而對(duì)結(jié)果的檢出限及回收率造成影響。因此通過配制空白基質(zhì)曲線以及溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)基質(zhì)效應(yīng)來評(píng)價(jià)鮮凍肉的基質(zhì)效應(yīng)大小[30]（基質(zhì)效應(yīng)/%=（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1）×100）。

根據(jù)評(píng)價(jià)指標(biāo)，所得的數(shù)值為負(fù)值時(shí)表示基質(zhì)效應(yīng)為抑制，當(dāng)所得數(shù)值為正值時(shí)表示基質(zhì)效應(yīng)為增強(qiáng)狀態(tài)。由表3可見，沙丁胺醇、普魯卡因、山莨菪堿、東莨菪堿、阿托品、利多卡因基質(zhì)效應(yīng)分別為12%、11.5%、9.8%、10.2%、10.9%、9.5%，6 種化合物的基質(zhì)效應(yīng)都在正的10%左右，因此考察回收率時(shí)，應(yīng)考慮其基質(zhì)效應(yīng)。因此本實(shí)驗(yàn)通過配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線來扣除基質(zhì)帶來的影響。

2.4.2 線性與檢出限和定量限

對(duì)6 種化合物質(zhì)量濃度為0.25～50 μg/L的空白基質(zhì)曲線進(jìn)行測定，得到一系列不同質(zhì)量濃度的色譜圖，以響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制不同化合物的線性方程以及r值，得到6 種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。同時(shí)根據(jù)3 倍信噪比確定6 種化合物的檢出限；以10 倍信噪比確定6 種化合物的定量限，見表3。6 種藥物在0.25～50 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，檢出限和定量限分別為0.5 μg/kg和2.0 μg/kg。

表3 6 種化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限Table3 Regression equations, correlation coeff i cients, LODs and LOQs for 6 drugs

2.4.3 加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

稱取空白樣品6 份，每份5.0 g，分別添加2.0、25、50 μg/kg添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后按1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)方法制備后進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。從表4可知，6 種物質(zhì)回收率在78.07%～96.76%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.4%～2.1%之間，回收率和精密度均符合實(shí)驗(yàn)要求。

表4 不同基質(zhì)中加標(biāo)回收率結(jié)果（n=6）Table4 Recoveries of 6 drug spiked to different matrix samples (n= 6)

2.5 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

采用此方法對(duì)市場上購買的60 件畜肉樣品進(jìn)行檢測，種類包括牛肉、羊肉、豬肉，結(jié)果在1 件牛肉樣品中檢出普魯卡因，含量為3.0 μg/kg，其余樣品均未檢出，同時(shí)對(duì)該陽性樣品按照GB 5009.3—2016進(jìn)行了水分測定，結(jié)果表明該樣品水分超標(biāo)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定畜肉中阿托品、山莨菪堿、東莨菪堿、利托卡因、普魯卡因和沙丁胺醇6 種注水肉中的保水劑，方法簡便、快速，最低檢出限為0.5 μg/kg。系統(tǒng)的方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確、可靠，適用于畜肉中阿托品、山莨菪堿、東莨菪堿、利托卡因、普魯卡因和沙丁胺醇的檢測?？紤]農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告中阿托品及普魯卡因的使用要求，本檢測方法僅作為注水肉判別的輔助手段，同時(shí)可為后續(xù)注水肉完善的鑒別方法提供幫助。

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