18O標(biāo)記聯(lián)合高效液相色譜-高分辨率質(zhì)譜技術(shù)定量測(cè)定阿膠中的明膠

沙小梅，胡姿姿，涂宗財(cái),,*，張路正，李 鑫，王 輝，張 露，黃 濤

（1.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022；2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

阿膠是傳統(tǒng)中藥之一，由驢皮中的主要成分膠原蛋白部分?jǐn)嗔讯a(chǎn)生，被廣泛用于補(bǔ)充血紅細(xì)胞和血紅蛋白[1-2]。除了補(bǔ)血功效，阿膠還具有增強(qiáng)免疫力[3]和抗疲勞活性[4]。阿膠與人參、鹿茸并稱為最有價(jià)值的3 種傳統(tǒng)中藥材[5]，此外，含有阿膠的零食和營(yíng)養(yǎng)品也備受歡迎。目前，阿膠已廣泛銷往多個(gè)地區(qū)，尤其是亞洲國(guó)家，如中國(guó)、日本、韓國(guó)、馬來(lái)西亞等。

近年來(lái)，由于高需求和有限的驢皮供應(yīng)，大量其他種類的明膠被加入阿膠產(chǎn)品，由此引發(fā)的阿膠摻假事件使得消費(fèi)者對(duì)阿膠產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生了擔(dān)憂和困惑。市場(chǎng)上，每年明膠產(chǎn)量大約為326 000 t，其中95%以上的明膠源于豬和牛[6-7]。在摻假的阿膠產(chǎn)品中，發(fā)現(xiàn)了大量的牛皮明膠和豬皮明膠。阿膠、牛皮明膠和豬皮明膠均屬于哺乳動(dòng)物明膠，同源性非常高。對(duì)于哺乳動(dòng)物明膠來(lái)源的鑒定，國(guó)內(nèi)外科研工作者采用了許多方法進(jìn)行攻關(guān)，包括高效液相色譜法[8]、磷酸鈣沉淀法[9]、紅外光譜法[10-11]、電泳技術(shù)[12]、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定[13]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)[14-16]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[17-19]等。其中，基于明膠的特征性多肽檢測(cè)，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用被認(rèn)為是一種有效的明膠鑒定方法[20]。Cheng Xianlong等[21]運(yùn)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定了5 種明膠（阿膠、牛皮明膠、豬皮明膠、龜甲膠和鹿角膠），然而每種明膠中只鑒定了一個(gè)特征性多肽。課題組在前期研究中，通過(guò)高效液相色譜-高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（high performance liquid chromatography-linear ion trap/Orbitrap high-resolution mass spectrometry，HPLCLTQ/Orbitrap MS/MS）系統(tǒng)研究了阿膠、牛皮明膠和豬皮明膠的鑒定。在目標(biāo)明膠含量低于10%時(shí)，于3 種明膠混合物中，分別找到了5、11 個(gè)和15 個(gè)阿膠、牛皮明膠和豬皮明膠的特征性多肽。明膠溯源是識(shí)別阿膠摻假的第一步，若能進(jìn)一步確定各明膠的精確含量將為阿膠品質(zhì)監(jiān)控提供技術(shù)支撐。

由于具有簡(jiǎn)單、高效、特異性標(biāo)記于精氨酸或賴氨酸殘基的C端等優(yōu)點(diǎn)，胰蛋白酶催化的18O標(biāo)記法廣受歡迎[22-24]。本課題組通過(guò)胰蛋白酶催化的18O標(biāo)記和生物質(zhì)譜技術(shù)建立了純明膠（牛皮明膠、豬皮明膠）的定量方法[25]，但是否能用于明膠混合物中對(duì)目標(biāo)明膠進(jìn)行定量還有待進(jìn)一步研究。因此，本實(shí)驗(yàn)選定阿膠和牛皮明膠為研究對(duì)象，通過(guò)兩部分研究建立阿膠的定量方法。首先，通過(guò)檢測(cè)18O標(biāo)記情況和18O/16O比值，分析18O標(biāo)記和生物質(zhì)譜技術(shù)是否能用于阿膠定量。其次，以不同比例混合阿膠和牛皮明膠，分別測(cè)定混合物中阿膠和牛皮明膠的添加量，分析18O標(biāo)記和生物質(zhì)譜技術(shù)在明膠混合物中定量目標(biāo)明膠的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿膠 山東東阿阿膠公司；牛皮明膠（G9382）、胞內(nèi)蛋白酶賴氨酸-C（Lys-C） 美國(guó)Sigma公司；O（97%） 美國(guó)Cambridge Isotope Laboratories公司；胰蛋白酶、ProteaseMax表面活性劑 美國(guó)Promega Corporation公司；所有其他的試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HPLC 日本Shimadzu公司；C18柱 美國(guó)Phenomenex公司；LTQ/OrbitrapVelos質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；超純水設(shè)備 德國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 阿膠樣品的預(yù)處理

在50 ℃水浴鍋中，用去離子水溶解阿膠，制備40 mg/mL的溶液。將阿膠溶液置于離心機(jī)中，14 000×g離心20 min。冷卻后，上清液進(jìn)一步通過(guò)0.45 μm的過(guò)濾器處理，得到的濾液凍干，備用。

1.3.2 明膠樣品的酶解

將阿膠、牛皮明膠及其混合物（阿膠和牛皮明膠以10∶1、1∶1和1∶10質(zhì)量比混合制得）溶解于20 mmol/L的Tris-鹽酸緩沖液（pH 8.0，含有50 mmol/L的氯化鈉、50 mmol/L的氯化鈣），制成1 mg/mL的溶液。100 μL的明膠溶液和100 μL的Tris-鹽酸緩沖液混勻后，加入ProteaseMax表面活性劑使其在混合溶液中的質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 mg/mL。加入15 μL的二硫蘇糖醇（100 mmol/L），置于95 ℃水浴鍋中加熱5 min，冰浴冷卻。加入30 μL的烷基化試劑（100 mmol/L的碘乙酰胺），并于常溫下暗室放置20 min。加入20 μL的Lys-C（0.05 μg/μL），置于37 ℃酶解4 h。加入20 μL的胰蛋白酶（0.1 μg/μL），混合溶液于37 ℃酶解過(guò)夜。

1.3.3 純明膠酶解物的18O標(biāo)記

50 μL胰蛋白酶（0.1 μg/μL）加入純明膠酶解液中，混合均勻。將溶液分成兩等份，凍干。每份凍干樣中加入色譜級(jí)乙腈80 μL，采用真空離心機(jī)在室溫下去除乙腈。向一份干樣中加入10 μL色譜級(jí)乙腈和40 μL H218O，另一份干樣中加入10 μL色譜級(jí)乙腈和40 μL H216O，置于30 ℃孵化過(guò)夜。標(biāo)記結(jié)束后，采用半胱氨酸烷基化的方法使胰蛋白酶失活，將副反應(yīng)（即標(biāo)記后的18O被16O替代）速率降至最低。胰蛋白酶的滅酶方案是在Staes等[26]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方案基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)適當(dāng)修飾而確定。10 μL三（2-羧乙基）膦（50 mmol/L）置于一個(gè)離心管中，干燥；15 μL碘乙酰胺（100 mmol/L）置于另一個(gè)離心管中，暗室下干燥。將18O標(biāo)記好的樣品轉(zhuǎn)移至裝有三（2-羧乙基）膦的離心管中，37 ℃孵化60 min；再將溶液轉(zhuǎn)移至裝有碘乙酰胺的離心管中，37 ℃暗室孵化90 min。16O標(biāo)記的樣品也要進(jìn)行胰蛋白酶的酶解處理。上述步驟完成后，將樣品置于-80 ℃冰箱貯藏備用。

1.3.4 高效液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)

運(yùn)用高效液相色譜-質(zhì)譜對(duì)明膠酶解液（18O標(biāo)記物和16O標(biāo)記物以不同比例混合）檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)參數(shù)主要包括液相工作條件和質(zhì)譜參數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)中的液相色譜具有2 個(gè)泵，流速為50 μL/min，采用的柱子為C18柱（2.0 mm×100 mm）。流動(dòng)相A為5%的乙腈和95%的水，含有體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸。流動(dòng)相B為95%的乙腈和5%的水，含有體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸。明膠酶解液梯度洗脫條件：0～5 min，2% B；40 min，20% B；42 min，95% B。明膠酶解液上樣量為3 μg，液相中的流出組分直接注入LTQ/Orbitrap質(zhì)譜檢測(cè)，采用HCD斷裂收集到的一級(jí)質(zhì)譜，鑒定明膠的特征性多肽。碰撞能量設(shè)置為35%，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為90 s。

1.3.5 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

采用數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換軟件Thermo proteome discoverer將raw格式數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成mgf，再提交至處理軟件Mascot Daemon檢索，數(shù)據(jù)庫(kù)為實(shí)驗(yàn)室自設(shè)數(shù)據(jù)庫(kù)（包含牛皮和豬皮I型膠原蛋白序列）。檢索參數(shù)包括：半胱氨酸經(jīng)碘乙酰胺（C）為固定修飾；氧化（P、K）為可能性修飾；最大的未酶切位點(diǎn)為5；一級(jí)質(zhì)譜錯(cuò)誤率為±0.025‰；二級(jí)質(zhì)譜錯(cuò)誤率為±0.5 Da。當(dāng)Mascot分?jǐn)?shù)大于40時(shí)，多肽峰被認(rèn)定為陽(yáng)性鑒定或準(zhǔn)確度極高（P＜0.05）[27]。目標(biāo)多肽為基于阿膠或牛皮明膠獨(dú)一無(wú)二的特征性多肽[17]。

1.3.618O/16O比值計(jì)算

18O標(biāo)記的多肽與16O標(biāo)記的多肽含量比可以通過(guò)單一同位素質(zhì)譜峰的峰高計(jì)算?？紤]到13C的干擾和一個(gè)18O原子的并入，18O/16O比值的計(jì)算公式如下[29-30]：

其中：I0、I2和I4分別為檢測(cè)到的沒(méi)有被18O標(biāo)記的多肽單一同位素質(zhì)譜峰、質(zhì)量增加2 Da的質(zhì)譜峰和質(zhì)量增加4 Da的質(zhì)譜峰的相對(duì)強(qiáng)度；m0、m2和m4分別表示理論上的多肽單一同位素質(zhì)譜峰、質(zhì)量增加2 Da的質(zhì)譜峰和質(zhì)量增加4 Da的質(zhì)譜峰的相對(duì)強(qiáng)度。在本研究中，根據(jù)Johnson和Muddiman的報(bào)道[28]，m4/m0和m2/m0的值分別用2×10-12Mr3.2684和3×10-7Mr1.9241代替（Mr為多肽的相對(duì)分子質(zhì)量）。本實(shí)驗(yàn)中的阿膠和牛皮明膠定量，分別選取5 個(gè)和10 個(gè)特征性多肽質(zhì)譜峰，計(jì)算各個(gè)質(zhì)譜峰18O/16O比值的平均值用于減小錯(cuò)誤率。

2 結(jié)果與分析

2.1 18O標(biāo)記阿膠的特征性多肽分析

課題組前期研究結(jié)果表明，18O標(biāo)記法結(jié)合生物質(zhì)譜技術(shù)能用于純牛皮明膠的定量[25]。為研究混合物中阿膠和牛皮明膠的定量，本實(shí)驗(yàn)首先以純阿膠為研究對(duì)象，研究18O標(biāo)記法結(jié)合生物質(zhì)譜技術(shù)定量阿膠的可行性?；谇捌谘芯拷Y(jié)果（在目標(biāo)明膠含量低于10%時(shí)，于阿膠、牛皮明膠和豬皮明膠混合物中，分別鑒定了5、11 個(gè)和15 個(gè)阿膠、牛皮明膠和豬皮明膠的特征性多肽），選取5 個(gè)特征性多肽用于阿膠的定量研究，其氨基酸序列和相對(duì)分子質(zhì)量如表1所示。

圖1 對(duì)比16O和18O標(biāo)記后阿膠特征性多肽的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 1 Comparison of mass spectra of donkey-hide gelatin peptides after 16O and 18O labeling

圖1A為阿膠α1鏈的特征性多肽1066GEAGPAGPA GPIGPVGAR1083的16O標(biāo)記多肽一級(jí)質(zhì)譜圖，實(shí)測(cè)m/z 765.905 52+與理論m/z 765.904 82+十分匹配，此外，MS/MS（圖譜未展示）證明了此特征性多肽的氨基酸序列。經(jīng)過(guò)18O標(biāo)記后，即圖1B，這個(gè)多肽的m/z轉(zhuǎn)變成了767.909 52+，增加的4.008 0 Da與理論質(zhì)量增加量4.008 5 Da非常接近，MS/MS（圖譜未展示）亦證明了氨基酸序列的正確性和多肽C端氨基酸殘基Arg1083已被兩個(gè)18O原子標(biāo)記。類似地，圖1C中，m/z 802.921 52+的一級(jí)質(zhì)譜峰來(lái)源于阿膠α2鏈977GE*PGPVGSVGPVGAVGPR994。對(duì)應(yīng)地，圖1D中，經(jīng)過(guò)18O標(biāo)記后，802.921 52+的質(zhì)譜峰消失，伴隨著一個(gè)新的質(zhì)譜峰804.928 22+出現(xiàn)，兩個(gè)質(zhì)譜峰的質(zhì)量差4.013 4 Da與理論上18O標(biāo)記后的理論質(zhì)量差4.008 5 Da匹配度良好。另外，利用MS和MS/MS檢測(cè)其余3 個(gè)特征性多肽經(jīng)16O和18O標(biāo)記的質(zhì)譜圖，確定了它們的C端精氨酸殘基都能被兩個(gè)18O原子標(biāo)記。上述結(jié)果說(shuō)明胰蛋白酶催化的18O標(biāo)記法能用于標(biāo)記阿膠的特征性多肽。

2.2 純阿膠中18O/16O比值的測(cè)定結(jié)果

為了進(jìn)一步確定18O標(biāo)記法是否能用于阿膠定量，以5 個(gè)不同質(zhì)量比（20∶1、10∶1、5∶1、1∶1和1∶5）混合18O和16O標(biāo)記的阿膠酶解物進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)，通過(guò)特征性多肽的18O/16O實(shí)測(cè)比值與混合比例的偏差檢測(cè)定量方法的準(zhǔn)確度。

圖2為阿膠16O標(biāo)記多肽（m/z為733.348 22+）和18O標(biāo)記多肽（m/z為735.352 72+）以不同比例混合后經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)到的一級(jí)質(zhì)譜圖，這兩個(gè)質(zhì)譜峰的信噪比（RSN）都很高，而且，兩個(gè)峰代表的18O/16O比值在外觀上十分接近實(shí)際混合比例（20∶1、10∶1、5∶1、1∶1和1∶5）。此外，基于18O和16O標(biāo)記的5 個(gè)特征性多肽的質(zhì)譜峰峰高，計(jì)算18O/16O平均值，并與實(shí)際混合比例進(jìn)行比較。如表1所示，當(dāng)18O和16O標(biāo)記物以20∶1、5∶1、1∶1和1∶5混合，5 個(gè)特征性多肽的實(shí)測(cè)平均比例分別為19.66±0.62、10.24±0.41、5.01±0.32、1.00±0.05和0.20±0.01。18O/16O實(shí)測(cè)值與實(shí)際混合比值十分接近，偏差很小，說(shuō)明基于18O標(biāo)記和生物質(zhì)譜技術(shù)建立的阿膠定量方法具有高準(zhǔn)確性。

表1 阿膠的特征性多肽的18O/16O相對(duì)比例定量Table1 Quanti fi cation of relative 18O/16O ratios of the marker peptides for donkey-hide gelatin

表2 明膠混合物中阿膠的定量Table2 Quanti fi cation of donkey-hide gelatin from its mixtures with bovine-hide gelatin

表3 明膠混合物中牛皮明膠的定量Table3 Quanti fi cation of bovine-hide gelatin from its mixtures with donkey-hide gelatin

圖2 阿膠的特征性多肽472GE*PGPTGL*PGP*PGER486的18O和16O標(biāo)記物以不同比例混合后檢測(cè)到的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of peptide 472GE*PGPTGL*PGP*PGER486 from donkey-hide gelatin with various 18O/16O ratios

2.3 明膠混合物中阿膠的定量

在阿膠摻假中，常將阿膠與其他種類的明膠混合，因此，分別以質(zhì)量比1∶10、1∶1和10∶1混合阿膠和牛皮明膠，利用18O標(biāo)記和生物質(zhì)譜技術(shù)定量混合物中的阿膠。在上樣時(shí)，混合純阿膠酶解物的18O標(biāo)記物1.5 μg和混合明膠酶解物的16O標(biāo)記物1.5 μg，即混合明膠中16O阿膠質(zhì)量分別為0.136、0.750 μg和1.364 μg。換言之，測(cè)定1∶10、1∶1和10∶1的阿膠-牛皮明膠混合物時(shí)，阿膠酶解物的18O/16O比值分別為11、2和1.1。

圖3為明膠混合物中阿膠特征性多肽472GE*PGPTGL*PGP*PGER486的18O和16O標(biāo)記物的一級(jí)質(zhì)譜圖。即使有牛皮明膠的干擾，16O標(biāo)記多肽（m/z為733.34962+）和18O標(biāo)記多肽（m/z為735.353 92+）的質(zhì)譜峰都具有很高的RSN，而且兩個(gè)峰代表的18O/16O比值在外觀上十分接近實(shí)際的18O/16O比值，即11、2和1.1。

圖3 在阿膠和牛皮明膠混合物中檢測(cè)到的阿膠特征性多肽472GE*PGPTGL*PGP*PGER486的18O和16O標(biāo)記物的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of peptide 472GE*PGPTGL*PGP*PGER486 for donkey-hide gelatin from its mixtures with bovine-hide gelatin

表2列出了利用5個(gè)特征性多肽對(duì)明膠混合物中阿膠進(jìn)行定量的檢測(cè)結(jié)果。當(dāng)阿膠與牛皮明膠以質(zhì)量比1∶10、1∶1和10∶1混合時(shí)，上樣的溶液中含有的阿膠質(zhì)量分別為0.136、0.750 μg和1.364 μg，阿膠中18O/16O比值分別為11、2和1.1?；诎⒛z的5個(gè)特征性多肽的結(jié)果平均值，當(dāng)阿膠與牛皮明膠以質(zhì)量比1∶10、1∶1和10∶1混合時(shí)，檢測(cè)到的阿膠質(zhì)量分別為（0.137±0.006）、（0.764±0.026）μg和（1.322±0.043）μg，檢測(cè)到的18O/16O比值分別為10.98±0.46、1.97±0.06和1.14±0.04，測(cè)定結(jié)果與實(shí)際阿膠質(zhì)量、18O/16O比值十分接近，偏差很小，說(shuō)明聯(lián)合18O標(biāo)記和生物質(zhì)譜技術(shù)可用于明膠混合物中阿膠的定量。

2.4 明膠混合物中牛皮明膠的定量

阿膠和牛皮明膠以質(zhì)量比10∶1、1∶1和1∶10混合制備明膠混合樣品，利用18O標(biāo)記和生物質(zhì)譜技術(shù)定量混合物中的牛皮明膠時(shí)，上樣溶液包含1.5 μg純牛皮明膠酶解物的18O標(biāo)記物和1.5 μg混合明膠酶解物的16O標(biāo)記物，即混合明膠中16O牛皮明膠質(zhì)量分別為0.136、0.750 μg和1.364 μg。換言之，測(cè)定質(zhì)量比為10∶1、1∶1和1∶10的阿膠與牛皮明膠混合物時(shí)，牛皮明膠酶解物的18O/16O比值分別為11、2和1.1。

圖4為明膠混合物中牛皮明膠特征性多肽977GE*PGPAGAVGPAGAVGPR994的18O和16O標(biāo)記物的一級(jí)質(zhì)譜圖。即使有阿膠的干擾，16O標(biāo)記多肽（m/z為766.894 22+）和18O標(biāo)記多肽（m/z為768.898 52+）的質(zhì)譜峰都具有很高的RSN，而且兩個(gè)峰代表的18O/16O比值在外觀上十分接近實(shí)際的18O/16O比值，即11、2和1.1。

表3列出了利用10 個(gè)特征性多肽定量明膠混合物中牛皮明膠的檢測(cè)結(jié)果。當(dāng)阿膠與牛皮明膠以質(zhì)量比10∶1、1∶1和1∶10混合時(shí)，上樣溶液中含有的牛明膠質(zhì)量分別為0.136、0.750 μg和1.364 μg，牛皮明膠中18O/16O比值分別為11、2和1.1?；谂Ｆっ髂z的10 個(gè)特征性多肽的結(jié)果平均值，當(dāng)阿膠與牛皮明膠以質(zhì)量比10∶1、1∶1和1∶10混合時(shí)，檢測(cè)到的牛皮明膠質(zhì)量分別為（0.137±0.007）、（0.752±0.018）μg和（1.351±0.040）μg，檢測(cè)到的18O/16O比值分別為10.71±0.44、2.02±0.02和1.12±0.04，測(cè)定結(jié)果與實(shí)際牛皮明膠質(zhì)量和18O/16O比值十分接近，偏差很小，說(shuō)明18O標(biāo)記和生物質(zhì)譜技術(shù)可用于明膠混合物中牛皮明膠的定量。同理，若阿膠中摻入其他種類的明膠，如豬皮明膠，亦可運(yùn)用此方法進(jìn)行定量。

圖4 在阿膠和牛皮明膠混合物中檢測(cè)到的牛皮明膠特征性多肽977GE*PGPAGAVGPAGAVGPR994的18O和16O標(biāo)記物的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of peptide 977GE*PGPAGAVGPAGAVGPR994 for bovine-hide gelatin from its mixtures with donkey-hide gelatin

3 結(jié) 論

本研究運(yùn)用胰蛋白酶催化的18O標(biāo)記法和生物質(zhì)譜技術(shù)對(duì)明膠混合物中的阿膠和牛皮明膠進(jìn)行定量分析，為阿膠品質(zhì)監(jiān)控提供技術(shù)支撐。經(jīng)胰蛋白酶催化，阿膠的特征性多肽均能被H218O的2 個(gè)18O原子標(biāo)記，引起質(zhì)量增加4 Da。當(dāng)18O和16O標(biāo)記物以20∶1、10∶1、5∶1、1∶1和1∶5混合時(shí)，選取的5 個(gè)阿膠特征性多肽實(shí)測(cè)平均比例分別為19.66±0.62、10.24±0.41、5.01±0.32、1.00±0.05和0.20±0.01，表明定量方法的準(zhǔn)確度高。當(dāng)阿膠與牛皮明膠以質(zhì)量比1∶10、1∶1和10∶1混合時(shí)，采用18O標(biāo)記法和生物質(zhì)譜技術(shù)，檢測(cè)到阿膠質(zhì)量分別為（0.137±0.006）、（0.764±0.026）μg和（1.322±0.043）μg，檢測(cè)到的牛皮明膠質(zhì)量分別為（1.351±0.040）、（0.752±0.018）μg和（0.137±0.007）μg，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際值十分接近。由此可見(jiàn)，聯(lián)合胰蛋白酶催化的18O標(biāo)記法和生物質(zhì)譜技術(shù)可用于阿膠產(chǎn)品的品質(zhì)監(jiān)測(cè)。

本研究對(duì)阿膠和牛皮明膠混合物中的目標(biāo)明膠進(jìn)行了定量檢測(cè)，并未考慮食品基質(zhì)（如黃酒、豆油、冰糖等）對(duì)明膠定量效果的影響，后續(xù)將以阿膠模擬產(chǎn)品和市售阿膠產(chǎn)品為對(duì)象開(kāi)展進(jìn)一步的研究，以保證18O標(biāo)記法和生物質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)阿膠中各類明膠添加量的準(zhǔn)確性。

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