乳鐵蛋白-乳清分離蛋白乳狀液微聚集體構(gòu)建與酶交聯(lián)對(duì)其流變學(xué)特性的影響

李 昕，王 旭，劉佳煒，李 鈺，許朵霞*，曹雁平*

（北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048）

肥胖和超重屬于過量脂肪積累，會(huì)引發(fā)心臟病和其他慢性疾病，損害健康，近年來(lái)引起了全世界的關(guān)注[1-2]。高脂肪含量的食品（如蛋黃醬、調(diào)味汁、巧克力和植脂奶油等）是導(dǎo)致肥胖的主要原因[3-5]，然而，減少脂肪含量會(huì)降低食品流變等特性，影響其口感與飽腹感，成為開發(fā)低脂食品的瓶頸[6-7]。

食品乳狀液中帶相反電荷的微滴通過控制異型聚集效應(yīng)，產(chǎn)生微滴間靜電相互作用與空間聚集作用，形成具有特定三維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的微聚集體，該結(jié)構(gòu)具有一定的剛性，可提高體系流變特性，從而使得低脂含量產(chǎn)品可達(dá)到高脂肪含量的口感[8-10]。Mao Yingyi等[11]研究了2 種帶異型電荷的蛋白質(zhì)乳狀液微滴間異型聚集效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)β-乳球蛋白微滴與乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）微滴混合比率影響微聚集體尺寸分布，以一定比例混合時(shí)，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分布的微聚集體，具有高度的穩(wěn)定性和高黏度特性。

采用酶法交聯(lián)，促使帶相反電荷的微滴相互聚集，可以增強(qiáng)其剪切時(shí)的穩(wěn)定性[12]。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是一種具有蛋白質(zhì)交聯(lián)潛力的酶，能夠催化蛋白質(zhì)和肽鍵中谷氨酰胺和許多伯胺之間的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)[13-15]。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)牛奶蛋白溶液導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成，直接結(jié)果是導(dǎo)致其黏度和凝膠化程度增加[16-17]。

乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）經(jīng)常被用作乳化劑，通過防止乳狀液中的過氧化物滲透延緩分散相的氧化[18-21]。LF是一種優(yōu)良的乳化劑，可吸附到油-水界面產(chǎn)生陽(yáng)離子乳狀液，具有增強(qiáng)鐵的傳遞和吸收等多種生物活性功能，是一種較理想的功能性食品配料[22-25]。LF乳狀液微滴與WPI乳狀液微滴在pH 6.0條件下帶有相反的電荷，傾向于通過靜電吸引作用相互聚集。

本研究制備了LF乳狀液和WPI乳狀液，將2 種微滴按不同含量異型聚集形成微聚集體，進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對(duì)WPI-LF乳狀液微聚集體流變特性的影響，不僅能夠豐富異型聚集效應(yīng)構(gòu)建微聚集體理論，還將為開發(fā)低脂食品載體提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)，具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WPI（純度97.6%） 美國(guó)Davisco公司；LF（純度99.3%） 美國(guó)Hilmar公司；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 上海源葉生物科技有限公司；中鏈甘油三酸酯（C8～C10）奎斯特（上海）國(guó)際有限公司；N a O H、H C l、NaH2PO4、Na2HPO4國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

B25model剪切儀 上海貝而特流體設(shè)備有限公司；M-110P微射流納米均質(zhì)機(jī) 加拿大Microfluidics公司；Zetasizer Nano-ZS90動(dòng)態(tài)激光光散射儀 英國(guó)Malvern公司；MCR102剪切流變儀 奧地利安東帕（中國(guó)）有限公司；Eutech pH700 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LUMiSizer快速穩(wěn)定性分析儀 德國(guó)LUM公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省予華儀器有限公司；BSA124S-CW分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 磷酸鹽緩沖液的制備

準(zhǔn)確稱取一定量的NaH2PO4和Na2HPO4溶解于超純水中，配制成1 mmol/L NaH2PO4和Na2HPO4溶液，兩者按一定質(zhì)量比混合形成粗磷酸鹽緩沖溶液，再用1 mol/L HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0。

1.3.2 乳狀液的制備

1.3.2.1 WPI和LF乳狀液的制備

分別準(zhǔn)確稱取一定量的WPI、LF，溶解于1 mmol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖溶液中，40 ℃中等速度攪拌2 h，25 ℃靜置溶脹過夜，使用前40 ℃中等速度攪拌30 min，確保WPI、LF充分溶解，分別制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% WPI、質(zhì)量分?jǐn)?shù)7% LF溶液為水相。分別準(zhǔn)確稱取一定量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%甘油三酸酯作為油相。高速乳化均質(zhì)機(jī)19 000 r/min剪切5 min，邊剪切邊緩慢地將油相倒入水相中，形成粗乳狀液；粗乳狀液通過微射流進(jìn)一步均質(zhì)最終分別制得100 g WPI乳狀液和LF乳狀液，均質(zhì)壓力為50 MPa，均質(zhì)3 次。

1.3.2.2 LF-WPI微聚集體的制備

將LF乳狀液和WPI乳狀液按不同LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）均勻混合制成混合LF-WPI乳狀液，通過異型聚集，形成微聚集體。

1.3.2.3 LF-WPI微聚集體酶交聯(lián)

分別將LF乳狀液、WPI乳狀液和LF-WPI乳狀液微聚集體（根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選定LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%時(shí)為最佳比例）加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，使最終乳狀液中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%，混合均勻，25 ℃酶處理反應(yīng)48 h[26]。

1.3.3 LF-WPI乳狀液微聚集體粒徑、Zeta電位的測(cè)定

采用動(dòng)態(tài)激光光散射儀測(cè)定乳狀液平均粒徑和Zeta電位，測(cè)試溫度為25 ℃，折射率為1.45。為減小多重光散射對(duì)測(cè)量的誤差，樣品在分析測(cè)試前用1 mmol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖液稀釋400 倍。每個(gè)樣品分析重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值表示。

1.3.4 LF-WPI微聚集體物理穩(wěn)定性的測(cè)定

應(yīng)用LUMiSizer穩(wěn)定性分析儀測(cè)定乳狀液的穩(wěn)定性。通過加速離心使樣品發(fā)生沉降、乳析、絮凝等不穩(wěn)定性現(xiàn)象，通過近紅外光照射樣品池測(cè)定透射光的強(qiáng)度，同時(shí)測(cè)定時(shí)間和樣品在樣品池中的位置得到樣品的不穩(wěn)定性指數(shù)。不穩(wěn)定性指數(shù)越小，表明乳狀液越穩(wěn)定；相反，不穩(wěn)定性指數(shù)越大，表明乳狀液越不穩(wěn)定。取約0.4 mL乳狀液，均勻注射至樣品試管底部，溫度設(shè)定為25 ℃，離心轉(zhuǎn)速為2 500 r/min，樣品的透射率的特征線每30 s記錄一次，共255 次。

1.3.5 LF-WPI微聚集體剪切流變特性的測(cè)定

采用流變儀分析微聚集體流變特性。選擇型號(hào)為CP-50-1的不銹鋼平板轉(zhuǎn)子，測(cè)量時(shí)的平板轉(zhuǎn)子間距設(shè)定為0.1 mm。取適量乳狀液滴于測(cè)試平臺(tái)上，加樣時(shí)注意保持樣品均勻，防止產(chǎn)生氣泡。剪切速率為2～200 s-1，測(cè)試溫度為25 ℃，每個(gè)樣品分析重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，所有乳狀液制備實(shí)驗(yàn)平行3 次，實(shí)驗(yàn)測(cè)定重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)LF-WPI乳狀液微聚集體粒徑的影響

圖1 LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)LF-WPI乳狀液微聚集體粒徑的影響Fig.1 Inf l uence of content of LF-coated droplets on particle size of LF-WPI emulsions

如圖1所示，乳狀液的粒徑大小取決于LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)，當(dāng)LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%～50%時(shí)，隨著LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，乳狀液粒徑逐漸增大；當(dāng)LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，乳狀液的粒徑達(dá)到最大，而后隨著LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增加，乳狀液的粒徑逐漸減少。乳狀液粒徑的增大是由于LF微滴與WPI微滴異型聚集形成微聚集體。當(dāng)LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，即LF乳狀液-WPI乳狀液質(zhì)量比為1∶1時(shí)，形成的微聚集體粒徑最大，表明二者之間形成的異型聚集效應(yīng)最強(qiáng)，形成的微聚集體尺寸最大。

2.2 LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)LF-WPI乳狀液微聚集體Zeta電位的影響

圖2 LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)LF-WPI乳狀液微聚集體Zeta電位的影響Fig.2 Inf l uence of content of LF-coated droplets on Zeta potential of LF-WPI emulsions

如圖2所示，乳狀液的Zeta電位值大小取決于LF微滴與WPI微滴含量。在pH 6條件下，WPI微滴帶負(fù)電荷（-34.8 mV），LF微滴帶正電荷（18.4 mV）。隨著LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，乳狀液Zeta電位呈現(xiàn)由負(fù)變正的趨勢(shì)。當(dāng)LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，乳狀液Zeta電位為0 mV。微聚集體Zeta電位變化是由于LF微滴與WPI微滴之間的靜電相互作用，表明LF微滴與WPI微滴之間通過靜電相互作用發(fā)生異型聚集，形成微聚集體。據(jù)報(bào)道，異型聚集形成的微聚集體的電荷取決于不同微滴的相對(duì)比例[27]，與本研究結(jié)果一致。

2.3 LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)LF-WPI乳狀液微聚集體物理穩(wěn)定性的影響

圖3 LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)LF-WPI乳狀液微聚集體物理穩(wěn)定性的影響Fig.3 Inf l uence of content of LF-coated droplets on physical stability of LF-WPI emulsions

不穩(wěn)定性指數(shù)越小，表明乳狀液越穩(wěn)定。如圖3所示，隨著LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，乳狀液不穩(wěn)定性指數(shù)呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢(shì)，當(dāng)LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，乳狀液穩(wěn)定性最好。這是由于LF微滴與WPI微滴通過異型聚集效應(yīng)，形成特定的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高乳狀液的物理穩(wěn)定性[12]。由圖4可知，與單一WPI、LF乳狀液相比，通過異型聚集效應(yīng)形成微聚集體的透光度明顯降低，穩(wěn)定性提高[28]。

圖4 不同組成LF-WPI乳狀液微聚集體整體透光度的變化Fig.4 Changes in integral transmission of pure and mixed LF-WPI emulsions

2.4 LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)LF-WPI乳狀液微聚集體流變特性的影響

由圖5a可知，隨著剪切速率的增加，乳狀液黏度呈現(xiàn)先變小后平穩(wěn)的趨勢(shì)，單一LF、WPI乳狀液與不同組成的LF-WPI乳狀液均為剪切變稀流體。不同LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)LF-WPI乳狀液微聚集體剪切流變的黏度由大到小的排列順序?yàn)椋?0%＞60%＞40%＞70%＞80%＞30%＞90%＞20%＞10%＞100%＞0%。隨著LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，乳狀液黏度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，乳狀液黏度達(dá)到最大，可能是因?yàn)樾纬傻奈⒕奂w粒徑較大，聚集效應(yīng)最強(qiáng)，從而提高體系的剪切流變特性[29-30]。

圖5b為剪切速率為96 s-1（模擬人體口腔速率）時(shí)對(duì)應(yīng)的乳狀液黏度，當(dāng)LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%～50%時(shí)，乳狀液黏度逐漸增大，當(dāng)LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%～100%時(shí)，乳狀液黏度逐漸減小，當(dāng)LF微滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的乳狀液黏度（9.3 mPa·s）為L(zhǎng)F乳狀液黏度（4.3 mPa·s）的2.2 倍，是WPI乳狀液黏度（2.5 mPa·s）的3.72 倍。研究結(jié)果表明，通過異型聚集效應(yīng)，LF-WPI乳狀液微聚集體的黏度明顯變大，可能是因?yàn)樾纬傻奈⒕奂w的粒徑增大，同時(shí)形成特定的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因此，在剪切時(shí)形成阻礙作用力，從而增大其黏度值。

圖5 LF微滴含量對(duì)LF-WPI乳狀液微聚集體流變特性的影響Fig.5 Inf l uence of content of LF-coated droplets on rheological properties of LF-WPI emulsions

2.5 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對(duì)不同組成的LF-WPI乳狀液微聚集體流變特性的影響

圖6 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對(duì)不同組成LF-WPI乳狀液流變特性的影響Fig.6 Effect of transglutaminase on rheological properties of pure and mixed LF and WPI emulsions

由圖6a可知，隨著剪切速率的增加，乳狀液黏度呈現(xiàn)先減小后平穩(wěn)的趨勢(shì)，乳狀液為剪切變稀流體。加入1.5%轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與未加酶的LF-WPI乳狀液微聚集體相比，黏度顯著增大。

圖6b為剪切速率為96 s-1（模擬人體口腔速率）時(shí)對(duì)應(yīng)的乳狀液黏度，結(jié)果表明，加入1.5%轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，LF-WPI乳狀液微聚集體變化顯著，加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶后的微聚集體黏度（106 mPa·s）為不加酶時(shí)（9.3 mPa·s）的11.4 倍；WPI乳狀液和LF乳狀液加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與未加酶組黏度差別不大。研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶促使LF-WPI乳狀液微聚集體發(fā)生交聯(lián)，形成特定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而提高體系的黏度。

2.6 異型聚集效應(yīng)和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對(duì)LF-WPI乳狀液微聚集體構(gòu)建的模擬

圖7 異型聚集效應(yīng)與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對(duì)LF-WPI乳狀液微聚集體構(gòu)建的模擬Fig.7 Schematic of heteroaggregation and enzymatic cross-linking of LF-WPI emulsion

圖7 為模擬異型聚集效應(yīng)和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)對(duì)LF-WPI乳狀液微聚集體的影響，通過異型聚集效應(yīng)LF微滴和WPI微滴靜電相互作用聚集形成微聚集體；通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)，LF微滴和WPI微滴形成特定的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，促使乳狀液交聯(lián)。

3 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，通過異型聚集效應(yīng)，LF-WPI乳狀液微聚集體的物理穩(wěn)定性和流變特性均提高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)50% LF乳狀液的LF-WPI乳狀液微聚集體的不穩(wěn)定性指數(shù)最?。?.022）；與單一WPI和LF乳狀液相比，其微聚集體流變學(xué)特性黏度值分別為單一乳狀液的3.72 倍和2.2 倍，粒徑、物理穩(wěn)定性與流變特性的峰值最大。通過添加轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，促使微聚集體酶交聯(lián)形成特定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步增加了乳狀液的流變特性，與未加酶的乳狀液微聚集體相比，加酶后的乳狀液微聚集體的黏度值為原來(lái)的11.4 倍，為脂肪模擬物的研究提供了一定的理論數(shù)據(jù)。

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