亞麻籽膠-大豆分離蛋白乳狀液微滴聚集體的制備及其流變特性

王 旭 馬寧寧 李 昕 凌 月 許朵霞 肖俊松 曹雁平 孫寶國(guó)

（北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京工商大學(xué)食品學(xué)院 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心食品添加劑與配料北京高校工程研究中心 北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室 北京 100048）

高脂肪含量的食品雖然是導(dǎo)致肥胖的主因，但是，減少脂肪含量，會(huì)劣變食品流變等特性，影響其口感與飽腹感，成為開(kāi)發(fā)低脂食品的瓶頸。采用新方法提高食品體系的流變特性，具有重要的研究?jī)r(jià)值?；谌闋钜何⒌伍g異型聚集效應(yīng)，形成具有特定三維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的微聚集體，成為提高食品乳狀液體系流變特性的新途徑[1-2]。

蛋白質(zhì)、油脂、多糖是食品體系中重要的3類生物大分子，是影響食品結(jié)構(gòu)和質(zhì)構(gòu)的主要因素。在實(shí)際體系中3種分子往往共存，由于兩種分子之間的相互作用，此時(shí)體系的穩(wěn)定性和質(zhì)構(gòu)特性并非這3種分子作用的簡(jiǎn)單加和[3-4]。水包油體系乳狀液的異型聚集為提高食品乳狀液體系流變特性提供了研究思路。本研究基于乳狀液微滴間靜電組裝，構(gòu)建大豆分離蛋白和亞麻籽膠兩種乳狀液異型微聚集體，考察其粒徑大小與分布、zeta-電位、物理穩(wěn)定性、微觀結(jié)構(gòu)、剪切流變與微流變特性，確定最佳混合比例，構(gòu)建具有高流變特性同時(shí)具有良好穩(wěn)定性的異型微聚集體，為脂肪模擬物的研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

亞麻籽膠（FG，純度≥99%），新疆利世得生物科技有限公司；中鏈甘油三酸酯 （MCT，C8-C10），奎斯特（上海）國(guó)際有限公司；大豆分離蛋白（SPI，純度≥90%），美國(guó) Davisco國(guó)際食品公司；NaOH、HCl、NaH2PO4、Na2HPO4，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HD-1型高速乳化均質(zhì)機(jī)，北京華遠(yuǎn)航實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省予華儀器有限公司；M-110EH型微射流儀，加拿大Microfluidics公司；Zetasizer Nano-ZS90激光粒度儀，英國(guó)Malvern公司；Modular Compact Rheometer剪切流變儀，法國(guó)Formulaction公司；微流變儀，法國(guó)Formulaction公司；pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；尼康80 i顯微鏡，日本尼康公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆分離蛋白SPI/MCT乳狀液的制備 準(zhǔn)確稱取一定量的大豆分離蛋白 （SPI），溶解于5 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）中，50℃攪拌2 h，溶脹過(guò)夜，使用前于50℃攪拌30 min，確保SPI充分溶解，制備SPI溶液（1%），形成水相。將溶解好的SPI溶液用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至3.0。準(zhǔn)確稱取一定量的MCT（10%），作為油相。以高速乳化均質(zhì)機(jī)19 000 r/min剪切 5 min，形成粗乳狀液；粗乳狀液通過(guò)微射流進(jìn)一步均質(zhì)得到SPI/MCT乳狀液，均質(zhì)壓力50 MPa，均質(zhì)3次。

1.2.2 亞麻籽膠FG/MCT乳狀液的制備 準(zhǔn)確稱取一定量的亞麻籽膠（FG），溶解于5 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）中，于50℃攪拌2 h，溶脹過(guò)夜，使用前50℃攪拌30 min，確保FG充分溶解，制備FG溶液 （0.6%），形成水相。將溶解好的FG溶液用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至3.0。準(zhǔn)確稱取一定量的MCT（10%），作為油相。在高速乳化均質(zhì)機(jī)19 000 r/min剪切5 min，形成粗乳狀液，將其通過(guò)微射流進(jìn)一步均質(zhì)得到FG/MCT乳狀液，均質(zhì)壓力為50 MPa，均質(zhì)3次。

1.2.3 FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體的制備將1%的SPI乳狀液與0.6%的FG乳狀液按不同比例分別混合（0∶10，1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1，10∶0），混合均勻，用1 mol/L HCl將混合乳狀液pH值調(diào)至3.0，形成不同組成的FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體。

1.2.4 FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體Zeta-電位分析 采用Nano-ZS90激光粒度儀，分析FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體Zeta-電位。為減小多重光散射對(duì)測(cè)量的誤差，樣品在分析測(cè)試前用5 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 3.0）稀釋400倍。每個(gè)樣品分析重復(fù)3次，結(jié)果以平均值表示。

1.2.5 FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體粒徑分析 采用激光粒度儀測(cè)定FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體粒徑。乳狀液（或其稀釋液）的粒徑是衡量乳狀液微聚集體的尺寸分布。為減小多重光散射對(duì)測(cè)量的誤差，樣品在分析測(cè)試前用5 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 3.0）稀釋400倍。每個(gè)樣品分析重復(fù)3次，結(jié)果以粒徑平均值（nm）表示。

1.2.6 FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體物理穩(wěn)定性分析 應(yīng)用Lumisizer穩(wěn)定性分析儀，通過(guò)加速分層和量化沉淀、懸浮的方法（STEP-Technology）快速測(cè)定乳狀液的穩(wěn)定性。不穩(wěn)定性指數(shù)（Instability index）是在離心的過(guò)程中，平行的近紅外光照射在樣本試管上，通過(guò)記錄樣品不同位置的透射率分布的變化，確定乳狀液粒子的遷移過(guò)程。取乳狀液約0.4 mL，均勻注射至樣品試管底部，溫度設(shè)定為25℃，離心轉(zhuǎn)數(shù)為2 500 r/min，樣品的透射率的特征線每30 s記錄1次，共255次。

1.2.7 FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體剪切流變特性分析 采用安東帕流變儀 （MCR-301）測(cè)定FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體在剪切作用力條件下的流變學(xué)特性。根據(jù)樣品特性，選擇型號(hào)為CP-50-1的不銹鋼平板轉(zhuǎn)子，測(cè)量時(shí)的平板轉(zhuǎn)子間距設(shè)定為0.1 mm。加樣時(shí)注意保持樣品均勻，防止氣泡。剪切速率為2～200 s-1，測(cè)量溫度為25℃。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.8 FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體微流變特性分析 采用Rheolaser Master微流變儀分析FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體微流變特性，微流變儀通過(guò)多散斑擴(kuò)散波光譜學(xué)理論分析軟物質(zhì)的微流變特性，通過(guò)專利運(yùn)算法計(jì)算對(duì)應(yīng)相關(guān)時(shí)間的粒子均方根位移（MSD）。將20 mL不同比例的FG乳狀液-SPI乳狀液倒入樣品池內(nèi)，測(cè)量溫度為25℃，放入儀器內(nèi)測(cè)量。通過(guò)廣義的斯托克斯愛(ài)因斯坦關(guān)系式，計(jì)算對(duì)應(yīng)頻率下的黏性指數(shù)（MVI）和彈性指數(shù)（EI）。

1.2.9 FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體微觀結(jié)構(gòu)分析 采用尼康80 i顯微鏡分析FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體的微觀結(jié)構(gòu)。取1滴FG乳狀液-SPI乳狀液置于載玻片上，用60倍油鏡觀察，調(diào)節(jié)顯微鏡焦距至形成清晰的畫(huà)面后，拍照。分析軟件為顯微鏡攝影圖像處理軟件NIS-Elements。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 12.0 for Windows軟件（美國(guó) SPSS公司）進(jìn)行方差分析（ANOVA），顯著性水平為0.05，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 FG乳狀液微滴含量對(duì)FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體Zeta-電位的影響

不同含量的亞麻籽膠（FG）乳狀液微滴對(duì)FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體Zeta-電位的影響如圖1所示。隨著FG乳狀液微滴含量的增大，F(xiàn)G乳狀液-SPI乳狀液微聚集體的Zeta-電位值由正變?yōu)樨?fù)，當(dāng)FG乳狀液微滴含量小于60%時(shí)，乳狀液微聚集體微滴帶正電荷；當(dāng)FG乳狀液微滴含量為60%時(shí)，乳狀液微聚集體的Zeta-電位值接近0；FG乳狀液微滴含量大于60%時(shí)，F(xiàn)G乳狀液-SPI乳狀液微聚集體微滴帶負(fù)電荷。這表明帶異型電荷的FG乳狀液微滴與SPI乳狀液微滴之間通過(guò)靜電相互作用發(fā)生聚集。靜電相互作用是影響FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體的主要作用力。在靜電相互作用下，帶負(fù)電荷的FG-乳狀液微滴吸附至SPI乳狀液微滴上，使得體系的Zeta-電位下降。隨著FG乳狀液含量的繼續(xù)增加 （80%和90%），Zeta-電位值不再顯著降低，與FG乳狀液的Zeta-電位相比，無(wú)顯著性差異。推測(cè)可能是因?yàn)樽懔康腇G乳狀液微滴與SPI乳狀液微滴產(chǎn)生靜電吸附作用，使得微聚集體的zeta-電位不再發(fā)生顯著變化。

圖1 FG乳狀液含量對(duì)FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體Zeta-電位的影響Fig.1 Effect of FG emulsion content on the zeta-potential of the heteroaggregated emulsions of FG-coated droplets and SPI-coated droplets

2.2 FG乳狀液微滴含量對(duì)FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體粒徑的影響

不同含量的FG乳狀液微滴對(duì)FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體粒徑的影響如圖2所示。隨著FG乳狀液微滴含量的增加，F(xiàn)G乳狀液-SPI乳狀液微聚集體的粒徑呈先增大后減小的趨勢(shì)，這主要是因?yàn)閹в胸?fù)電荷的FG乳狀液微滴吸附至SPI乳狀液微滴上，形成微聚集體使粒徑變大。當(dāng)FG乳狀液微滴含量小于30%時(shí)，乳狀液粒徑變化較小，這主要是SPI占主導(dǎo)地位，只有小部分的FG乳狀液微滴通過(guò)靜電相互作用與SPI乳狀液微滴吸附，形成少部分的微聚集體。而后，隨著FG乳狀液微滴的增多，帶負(fù)電荷的FG乳狀液微滴可與帶正電荷的SPI乳狀液微滴相互作用（微滴間和游離FG、SPI分子間）形成具有特定結(jié)構(gòu)的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的微聚集體。當(dāng)FG乳狀液微滴含量為60%時(shí)，乳狀液微聚集體的粒徑最大，F(xiàn)G乳狀液-SPI乳狀液微聚集效應(yīng)最強(qiáng)。隨著FG乳狀液微滴含量的增加，F(xiàn)G乳狀液微滴占主導(dǎo)地位，F(xiàn)G乳狀液-SPI乳狀液微聚集效應(yīng)減弱，表明帶異型電荷的FG乳狀液-SPI乳狀液聚集效應(yīng)的最佳比例為 6∶4。

2.3 FG乳狀液微滴含量對(duì)FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體穩(wěn)定性的影響

采用Lumisizer穩(wěn)定性分析儀，通過(guò)不穩(wěn)定性指數(shù)（Instability Index）分析不同含量的FG乳狀液微滴對(duì)FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體穩(wěn)定性的影響。不穩(wěn)定性指數(shù)越小，乳狀液越穩(wěn)定。從圖3可以看出，隨著FG乳狀液微滴含量的增加，F(xiàn)G-SPI乳狀液微聚集體的不穩(wěn)定性指數(shù)先增大后減小再增大。FG乳狀液含量較少或較多 （0～20%，80%～100%）時(shí)，乳狀液的不穩(wěn)定性指數(shù)較小，表明乳狀液穩(wěn)定性較好，這可能是因?yàn)槿闋钜何⒌?微滴間相互作用較弱，對(duì)乳狀液的穩(wěn)定性影響較小[5]。當(dāng)FG乳狀液含量分布于30%～70%時(shí)，乳狀液的不穩(wěn)定性指數(shù)明顯增大，表明乳狀液微滴間相互作用較強(qiáng)時(shí)，乳狀液的物理穩(wěn)定性被破壞。通常乳狀液界面聚電解質(zhì)之間靜電相互作用強(qiáng)度以及在界面形成的復(fù)合物的性質(zhì)取決于其質(zhì)量分?jǐn)?shù)、本身表面帶電基團(tuán)的分布、分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定以及所帶電荷的分布及密度等[6-7]。此外，從熱力學(xué)方面考慮，進(jìn)一步開(kāi)拓這個(gè)新方法面臨的主要問(wèn)題是乳狀液微聚集體在制備過(guò)程中的絮凝問(wèn)題，即在多糖乳狀液微滴的加入過(guò)程中，其含量的過(guò)小或過(guò)大引起的乳狀液不穩(wěn)定現(xiàn)象[8-9]。由此可知，并不是所有應(yīng)用聚電解質(zhì)微滴及其分子間的相互作用都能提高乳狀液的穩(wěn)定性，乳狀液體系及乳化劑含量選擇不當(dāng)，可能會(huì)導(dǎo)致絮凝，最終導(dǎo)致乳狀液的不穩(wěn)定[10]。當(dāng)FG乳狀液含量為60%時(shí)，乳狀液的不穩(wěn)定性指數(shù)（<0.2）相對(duì)較小，較穩(wěn)定。

圖2 FG乳狀液含量對(duì)FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體粒徑的影響Fig.2 Effect of FG emulsion content on the droplet size of the heteroaggregated emulsions of FG-coated droplets and SPI-coated droplets

2.4 FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體剪切流變特性

不同含量的FG乳狀液微滴對(duì)FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體流變學(xué)特性的影響如圖4所示。隨著剪切速率的增加，F(xiàn)G乳狀液-SPI乳狀液的黏度降低，表明樣品具有假塑性流體特性。這是因?yàn)殡S著剪切速率增加，乳狀液微聚集體內(nèi)部結(jié)構(gòu)打開(kāi)，分子按照剪切速率的方向線性排列[11-12]。從圖4可看出，當(dāng)體系不含有FG時(shí)，SPI乳狀液黏度隨剪切速率的曲線趨于平整，表明SPI乳狀液接近牛頓流體。當(dāng)FG乳狀液濃度增加時(shí)，剪切稀化的特性變得更為明顯。這是因?yàn)殡S著剪切速率的增大，聚集體結(jié)構(gòu)被破壞，剪切變稀，樣品的黏度和剪切應(yīng)力減小[13-14]。60%FG乳狀液-40%SPI乳狀液微聚集體體系黏度比單一的SPI、FG乳狀液顯著增加，可能是因?yàn)槎咴谠摶旌媳壤龝r(shí)，粒徑較大，形成特定的空間結(jié)構(gòu)，從而提高黏度值[15-16]。

圖3 FG乳狀液含量對(duì)FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體不穩(wěn)定指數(shù)變化的影響Fig.3 Effect of FG emulsion content on the instability index of the heteroaggregated emulsions of FG-coated droplets and SPI-coated droplets

圖5是所有乳狀液體系在剪切速率為95.8 s-1時(shí)的黏度，此剪切速率是模擬人體口腔咀嚼速率（100 s-1左右為人體口腔咀嚼速率）[17-18]。同一剪切速率下，F(xiàn)G乳狀液含量為60%時(shí)的FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體體系黏度最大，表明含60%FG乳狀液的體系具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，在此剪切速率下體系對(duì)剪切具有一定的抗性，具有很好的剪切流變黏性[19]。

2.5 FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體微流變特性

采用Formulation微流變分析儀，通過(guò)顆粒均方根位移（MSD）分析不同含量的FG乳狀液微滴對(duì)FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體微流變特性的影響（圖6）。顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)是由顆粒均方根位移（MSD）與時(shí)間關(guān)系曲線來(lái)表征的[20]。MSD曲線反應(yīng)樣品的黏彈性特征。在純黏性流體 （牛頓流體）中，粒子MSD與時(shí)間呈線性增長(zhǎng)；而在一個(gè)黏彈性流體中，粒子的均方根位移受到限制，粒子被困在三維微觀結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)中，從而在MSD與時(shí)間的關(guān)系曲線中形成一個(gè)平臺(tái)區(qū)[21]。

圖4 FG乳狀液含量對(duì)FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體黏度隨剪切速率變化的影響Fig.4 Effect of FG emulsion content on mean viscosity with changing shear rate of the heteroaggregated emulsions of FG-coated droplets and SPI-coated droplets

由圖6可知，乳狀液微聚集體樣品在短的去相關(guān)時(shí)間段，60%FG乳狀液-40%SPI乳狀液微聚集體體系的MSD最小，表明此比例條件下二者微滴間的作用力最強(qiáng)，平臺(tái)區(qū)與時(shí)間軸所形成的面積最小，該體系的黏彈性最高。彈性因子（EI）與樣品的最終流變特征相關(guān)，如凝膠網(wǎng)絡(luò)尺寸、硬度、凝膠化過(guò)程的速度、剪切后恢復(fù)速度等[22]。從圖7看出，含60%FG乳狀液的體系EI最大，體系的彈性最大。MSD曲線平臺(tái)區(qū)后的斜率是樣品的宏觀黏度指數(shù)（MVI），斜率越低，粒子在給定的去相關(guān)時(shí)間內(nèi)運(yùn)動(dòng)的均方位移越小，意味著粒子長(zhǎng)去相關(guān)時(shí)間內(nèi)運(yùn)動(dòng)的布朗運(yùn)動(dòng)速度越慢。粒子移動(dòng)的越慢，樣品的黏度就越強(qiáng)。另一方面，粒子移動(dòng)的越快，樣品的黏度越弱。MVI是計(jì)算斜率值的倒數(shù)，它的變化是與黏度的變化一致的。MVI與樣品的最終特性相關(guān)，如增稠劑的效果、質(zhì)地、口感、流動(dòng)性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性等。圖7顯示含60%FG乳狀液的體系MVI值最大，黏度最大。FG乳狀液含量對(duì)FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體MVI與EI的影響均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，與上述剪切流變分析結(jié)果一致。

2.6 FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體微觀結(jié)構(gòu)

圖5 FG乳狀液含量對(duì)FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體黏度的影響Fig.5 Effect of FG emulsion content on mean viscosity of the heteroaggregated emulsions of FG-coated droplets and SPI-coated droplets

圖6 FG乳狀液含量對(duì)FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體均方根位移曲線的影響Fig.6 Effect of FG emulsion content on the mean square displacement（MSD） curves of the heteroaggregated emulsions of FG-coated droplets and SPI-coated droplets

為了進(jìn)一步觀察FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體的形成情況，采用10×100倍光學(xué)顯微鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)。圖8分別是SPI乳狀液（a），60%FG乳狀液-40%SPI乳狀液微聚集體（b）以及FG乳狀液（c）。從圖8a可看出，SPI乳狀液微滴粒徑小，分布均勻，吸附油滴充分；圖8c中FG乳狀液吸附油滴的效果不如SPI，液滴粒徑較大。由圖8b可看出60%FG乳狀液-40%SPI乳狀液形成均勻的微聚集體，在空間上形成特定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。模擬聚集體的三維結(jié)構(gòu)得出如圖9所示的模型，兩種乳狀液微滴靜電吸附，形成一個(gè)類似足球狀的微聚集體。

圖7 FG乳狀液含量對(duì)FG-SPI微聚集體彈性指數(shù)和宏觀黏度指數(shù)的影響Fig.7 Effect of FG emulsion content on the EI （a） and MVI （b） values of the heteroaggregated emulsions of FG-coated droplets and SPI-coated droplets

圖8 FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體的微觀結(jié)構(gòu)Fig.8 Microstructures of SPI emulsion （a），heteroaggregated emulsions of 60%FG-coated droplets and 40%SPI-coated droplets （b），F(xiàn)G emulsion （c）

圖9 FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體的三維結(jié)構(gòu)模型Fig.9 Three-dimensional structure model of the heteroaggregated emulsions of FG-coated droplets and SPI-coated droplets

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，60%FG乳狀液-40%SPI乳狀液異型聚集時(shí)，粒徑最大，zeta-電位接近0，體系的穩(wěn)定性系數(shù)較小，兩種乳狀液發(fā)生異型聚集，二者之間的穩(wěn)定效應(yīng)主要依靠空間位阻效應(yīng)。剪切流變和微流變學(xué)特性表征了60%FG乳狀液-40%SPI乳狀液體系的高彈性。從微觀結(jié)構(gòu)推測(cè)，形成了一種特定的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，兩種微滴牢牢結(jié)合在一起。本研究通過(guò)異型聚集效應(yīng)，制備高流變特性的FG乳狀液-SPI乳狀液微聚集體，為開(kāi)發(fā)油脂模擬物提供數(shù)據(jù)。