天麻蜜環(huán)菌質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立△

賀敬霞，黨艷妮，張笑笑，黃壯壯，王益民，張?chǎng)?，陳衍?

1.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712042；

2.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，陜西 西安 710075

天麻Gastrodia elataBl.為蘭科植物天麻的干燥塊莖，具有息風(fēng)止痙、祛風(fēng)通絡(luò)等作用，臨床用于治療癲癇、高血壓、小兒驚風(fēng)等病癥，蜜環(huán)菌為蜜環(huán)菌屬的寄生真菌，具有祛風(fēng)通絡(luò)、強(qiáng)筋骨等作用，用于治療癲癇、佝僂等病癥[1-2]。蜜環(huán)菌與天麻兩者是共生且相互不可或缺的一部分，天麻通過(guò)蜜環(huán)菌中菌絲體獲取營(yíng)養(yǎng)，蜜環(huán)菌則寄生于天麻。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前天麻蜜環(huán)菌已分離鑒定出近百種化合物，包括嘌呤類、半倍萜類、有機(jī)酸、總黃酮、氨基酸等，具有調(diào)血脂、抗腫瘤、抗炎、抗驚厥等生理活性[3-4]。天麻蜜環(huán)菌作為天麻蜜環(huán)菌片、復(fù)方天麻蜜環(huán)菌片等中藥制劑的主要原料，具有治療眩暈、頭痛、驚風(fēng)癲癇、腰膝酸痛等作用。隨著天麻蜜環(huán)菌用藥廣泛與常態(tài)化，其藥品質(zhì)量、藥物療效與用藥安全等是需要關(guān)注的，故天麻蜜環(huán)菌質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立是非常必要的。目前已頒布天麻蜜環(huán)菌片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[5]，而天麻蜜環(huán)菌藥材相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未建立，也未有測(cè)定蜜環(huán)菌中染料木素及麥角甾醇方法的相關(guān)報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)建立天麻蜜環(huán)菌薄層色譜鑒別方法，染料木素、麥角甾醇高效液相色譜法（HPLC）并測(cè)定其二氧化硫殘留量，為天麻蜜環(huán)菌質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；DHG-9140B 型恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SQP型電子天平［德國(guó)賽多利斯（北京）有限公司］；薄層色譜定量點(diǎn)樣毛細(xì)管（天津市思利達(dá)科技有限公司）；KQ-800KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JT108-1RW型中藥二氧化硫檢測(cè)儀（菏澤市牡丹區(qū)俊藤電子儀器有限公司）；UPT-I-10T 型優(yōu)普系列反滲透超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）。

1.2 試藥

30%過(guò)氧化氫溶液（天津歐博凱化工有限公司）；0.1%氫氧化鈉滴定液（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；鹽酸（北京化工廠，分析純）；硫酸（洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司，分析純）；甲酸（天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠，分析純）；G-硅膠薄層板（青島海洋化工有限公司、青島海浪化工有限公司）；甲基紅、乙酸乙酯、石油醚（60～90 ℃）、香草醛（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純）；無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）；甲醇［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］；對(duì)照品麥角甾醇（中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度≥96.2%，批號(hào)：111845-201604）；對(duì)照品染料木素（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，批號(hào)：20130412）。

蜜環(huán)菌對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121244-201202）；天麻蜜環(huán)菌（神華藥業(yè)公司，批號(hào)分別為20180918、20200921、20200922）。

2 方法與結(jié)果

2.1 天麻蜜環(huán)菌的薄層色譜鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱取批號(hào)分別為20180918、20200921、20200922的天麻蜜環(huán)菌樣品各1 g，分別置具塞錐形瓶中，精密加入石油醚（60～90 ℃）10 mL，超聲40 min（100 Hz，260 W），取出，濾過(guò)，濾液濃縮至約1 mL，作為供試品溶液。另取天麻蜜環(huán)菌對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液，照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)。

2.1.2 對(duì)照藥材溶液的制備 同2.1.1項(xiàng)下方法。

2.1.3 薄層色譜條件 參照《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)》天麻蜜環(huán)菌片薄層色譜鑒別法[5]，吸取上述2種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一羧甲基硅膠鈉為黏合劑的G硅膠薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯（9∶1）為展開(kāi)劑，飽和30 min，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，在110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視，供試品色譜中，在對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 天麻蜜環(huán)菌薄層鑒別圖

2.1.4 優(yōu)化后薄層色譜條件 照薄層色譜法，吸取以上各溶液5μL，分別點(diǎn)于同一羧甲基硅膠鈉為黏合劑的G 硅膠薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（36.0∶8.0∶0.5）為展開(kāi)劑，飽和30 min 后，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸顯示劑溶液，在105 ℃烘約5 min，見(jiàn)圖1。

由圖1 可知，改進(jìn)后薄層色譜相對(duì)應(yīng)點(diǎn)分離度較好，且與前期對(duì)比有3個(gè)較明顯的點(diǎn)出現(xiàn)。

2.2 二氧化硫殘留量測(cè)定

2.2.1 3%過(guò)氧化氫配制 精密量取30%過(guò)氧化氫20 mL置具塞瓶中，后加入180 mL水，搖勻備用。

2.2.2 指示劑配制 精密稱取甲基紅12.5 mg 置于具塞瓶中，加入無(wú)水乙醇5 mL，超聲助溶，配制撐質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL-1甲基紅乙醇溶液，備用。

2.2.3 氫氧化鈉溶液配制 精密吸取0.1 mol·L-1氫氧化鈉滴定液10 mL 置于具塞瓶中，加水90 mL稀釋，搖勻，配制成濃度為0.01 mol·L-1氫氧化鈉溶液，備用。

2.2.4 鹽酸溶液配制 精密吸取濃鹽酸24.8 mL 置具塞瓶中，加水25.2 mL 稀釋，搖勻，配制成濃度為6 mol·L-1鹽酸溶液，備用。

2.2.5 二氧化硫測(cè)定 參考《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版[6]，分別稱定3 批蜜環(huán)菌樣品各10 g，置三頸圓底燒瓶中，加水400 mL。打開(kāi)回流冷凝管開(kāi)關(guān)，將冷凝管上端口處連接橡膠導(dǎo)氣管，置于100 mL 錐形瓶底部。錐形瓶?jī)?nèi)加入3%過(guò)氧化氫溶液50 mL 作為吸收液，使用前加入2.5 mg·mL-1甲基紅乙醇溶液指示劑3滴，并用0.01 mol·L-1氫氧化鈉滴定液滴定至黃色。開(kāi)通氮?dú)?，調(diào)節(jié)氣流約至0.2 L·min-1，打開(kāi)封液漏斗使6 mol·L-1鹽酸溶液10 mL流入蒸餾瓶，立即加熱使三頸燒瓶?jī)?nèi)的溶液至沸（沸點(diǎn)設(shè)置為102 ℃，保持2 min），并保持微沸（99 ℃）90 min后停止加熱。吸收液放冷后，置于磁力攪拌器上不斷攪拌，用氫氧化鈉滴定液滴定至黃色，持續(xù)時(shí)間20 s不褪，并將滴定結(jié)果用空白驗(yàn)證。空白為未加樣品的水溶劑。按公式（1）計(jì)算供試品中二氧化硫殘留量，不同批次二氧化硫測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同批次蜜環(huán)菌二氧化硫殘留量測(cè)定結(jié)果

式中A為供試品溶液消耗氫氧化鈉滴定液的體積（mL）；B為空白消耗氫氧化鈉滴定液體積（mL）；C為NaOH滴定液濃度（mol·L-1）；0.032為1 mL 氫氧化鈉滴定液（1 mol·L-1）相當(dāng)于二氧化硫的量（g）；W為供試品的質(zhì)量（g）。

2.3 染料木素、麥角甾醇含量測(cè)定

2.3.1 溶液的制備

2.3.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定麥角甾醇、染料木素對(duì)照品適量，置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度線，配制為質(zhì)量濃度分別為368、490 μg·mL-1混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3.1.2 供試品溶液 稱取天麻蜜環(huán)菌樣品1 g，置具塞瓶中，加10 倍量80%乙醇，超聲處理30 min（250 W，100 kHz），取出，濾過(guò)，備用。

2.3.2 色譜條件 參考文獻(xiàn)［7］，通過(guò)試驗(yàn)確定最佳色譜條件，色譜柱：AgilentEclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B）；梯度洗脫（0～10 min，50%A；10～20 min，50%～100%A；20～40 min，100%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：染料木素260 nm，麥角甾醇280 nm；體積流量：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL，得供試品及對(duì)照品色譜圖，見(jiàn)圖2。

圖2 天麻蜜環(huán)菌色譜圖

2.3.3 方法學(xué)考察

2.3.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，逐倍稀釋，并加甲醇定容至刻度線，搖勻，得系列濃度對(duì)照品，按2.3.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，染料木素回歸方程：Y=80 262X-345 092（r=0.999 5），表明在3.829～245.000μg·mL-1線性良好。麥角甾醇回歸方程：Y=16 027X+39 452（r=0.999 8），表明在1.893～368.440 μg·mL-1線 性良好。

2.3.3.2 精密度考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液，按2.3.2 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6 次，得染料木素、麥角甾醇對(duì)照品峰面積RSD分別為0.58%、0.93%，均小于2.0%。表明儀器精密度良好。

2.3.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按2.3.1.2 項(xiàng)下方法，取同一批天麻蜜環(huán)菌樣品（批號(hào)：20180918）平行制備6 份供試品溶液，按2.3.2 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算染料木素、麥角甾醇含量，并得其RSD 分別為2.80%、2.92%，均小于3%，該方法重復(fù)性良好。

2.3.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，按2.3.2 項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，得染料木素、麥角甾醇峰面積的RSD 分別為1.30%、2.66%，均小于3%，表明樣品及對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.3.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱定天麻蜜環(huán)菌樣品0.5 g，置于具塞瓶中，按當(dāng)前樣品含量100%比例加入染料木素、麥角甾醇對(duì)照品，按2.3.1.2 項(xiàng)下方法平行制備6份樣品溶液，在2.3.2項(xiàng)下方法測(cè)定峰面積，計(jì)算加樣回收率及RSD，得染料木素、麥角甾醇平均加樣回收率分別為102.90%、101.29%，RSD分別為0.93%、1.62%，說(shuō)明該操作方法良好。

2.3.4 不同批次天麻蜜環(huán)菌含量測(cè)定 稱定3 批天麻蜜環(huán)菌樣品各1 g，精密稱定，按照2.3.1.2 項(xiàng)下制備樣品溶液，在2.3.2 項(xiàng)下色譜條件下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同批次蜜環(huán)菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別分析

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)展開(kāi)劑（石油醚-乙酸乙酯-甲酸）、顯示劑（1%硫酸乙醇、0.5%香草醛冰乙酸、1%香草醛硫酸）、溫濕度（溫度5～40℃，濕度15%～75%）進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，采用石油醚-乙酸乙酯-甲酸（36.0∶8.0∶0.5）為展開(kāi)劑、1%香草醛硫酸為顯示劑，供試品色譜中，與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)顯示清晰，且該方法適用性較好，可用于天麻蜜環(huán)菌藥材的鑒別。

3.2 二氧化硫殘留量

傳統(tǒng)中醫(yī)藥中，通常采用硫黃熏蒸中藥材，以延長(zhǎng)貯存時(shí)間，避免藥材發(fā)霉腐敗，而過(guò)量二氧化硫殘留破壞人體正常的氧化作用與代謝，引起呼吸系統(tǒng)類疾病及產(chǎn)生不良反應(yīng)，嚴(yán)重會(huì)產(chǎn)生急性中毒癥狀[8]。因此，各國(guó)對(duì)中藥材的二氧化硫殘留量制定了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，《韓國(guó)藥典》第10版要求殘留量低于30 mg·mL-1，《日本藥局方》第17版與《美國(guó)藥典》第43版要求殘留量低于50 mg·mL-1，《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版也對(duì)中藥材二氧化硫的殘留量進(jìn)行限定，如山藥低于10 mg·kg-1、牛膝不超過(guò)400 mg·mL-1[9]。目前，未有天麻蜜環(huán)菌二氧化硫殘留量的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)對(duì)各批次的天麻蜜環(huán)菌測(cè)定，得其二氧化硫殘留量低于20 mg·mL-1，與傳統(tǒng)硫黃熏蒸中藥材不同，天麻蜜環(huán)菌通過(guò)培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得而未進(jìn)行硫黃熏蒸。參考相關(guān)研究資料，探究天麻蜜環(huán)菌二氧化硫殘留原因：1）藥材自身含有的硫苷及硫衍生物在加熱后降解而生成二氧化硫；2）在培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)吸收培養(yǎng)液中的硫酸根，之后代謝而形成結(jié)合與流離態(tài)的亞硫酸根；3）植物通過(guò)氣孔吸收大氣中的二氧化硫，以及水中、土壤中的硫化物被植物吸收后，使其含有一定流離態(tài)和結(jié)合態(tài)的含硫成分[10-12]。結(jié)合天麻蜜環(huán)菌目前已知的化合物，如氨基酸類、有機(jī)酸類、多糖類，其中均未含硫元素及其硫衍生物。同時(shí)，其培養(yǎng)過(guò)程密閉，二氧化硫來(lái)源于空氣幾率較小，故猜測(cè)可能來(lái)源于內(nèi)源性硫酸根，因在培養(yǎng)過(guò)程培養(yǎng)液中加入硫酸鎂溶液后逐漸代謝產(chǎn)生亞硫酸根[13]。

3.3 染料木素、麥角甾醇含量測(cè)定

前期對(duì)不同提取溶劑：水、20%～80%乙醇、20%～100%甲醇進(jìn)行考察，測(cè)定結(jié)果顯示，當(dāng)提取溶劑為水、20%乙醇、20%甲醇時(shí)，染料木素、麥角甾醇均未出峰，當(dāng)提取溶劑為40%乙醇、40%甲醇、60%甲醇時(shí)未測(cè)出染料木素，當(dāng)溶劑為80%乙醇時(shí)染料木素、麥角甾醇含量均達(dá)到最佳，故選用80%乙醇作為提取溶劑。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證表明，采用HPLC 測(cè)定天麻蜜環(huán)菌中染料木素、麥角甾醇的方法操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、靈敏度高，可用于其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立。