紅桿天麻共生蜜環(huán)菌篩選初探

李曉東, 雷 萍, 付玉平, 蒙 琳,張羽翅,王詠梅,楊 楊,敬 丹

(1.陜西省略陽縣中藥材技術(shù)推廣服務(wù)中心，陜西 略陽 724300；2.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043)

蜜環(huán)菌(Armillariamellea)屬擔(dān)子菌綱，白蘑科、蜜環(huán)菌屬兼寄生性真菌，除本身能作為藥用外，它常常與名貴中藥材天麻、豬苓共生，為其提供營養(yǎng)。蜜環(huán)菌具有生態(tài)、物種、遺傳、形態(tài)多樣性[1]，不同的地理區(qū)域分布著不同種類的蜜環(huán)菌[2]。陜西略陽秦嶺南麓，由三個中山區(qū)和三個淺山區(qū)構(gòu)成，最高海拔2 425 m，最低海拔587 m，年平均降雨量達(dá)826.2 mm[3]，良好的地理氣候環(huán)境孕育豐富野生蜜環(huán)菌資源。目前種植最廣、最多的是紅桿天麻，而與之共生蜜環(huán)菌因繁育多代，已出現(xiàn)嚴(yán)重退化現(xiàn)象。蜜環(huán)菌多代應(yīng)用會出現(xiàn)明顯的菌種退化與變異[4]；生產(chǎn)中常用老化的天麻栽培菌材反復(fù)轉(zhuǎn)接，菌種嚴(yán)重退化，菌索長勢衰退[5]。實(shí)踐表明，蜜環(huán)菌多代繁殖后，其侵染菌棒皮內(nèi)菌絲發(fā)黃、變暗；菌索分支變少、顏色呈黑褐色，不發(fā)紅，頂部無白色的生長點(diǎn)，菌索呈空殼狀，髓心疏松菌絲極少，用手輕拉，便斷裂，表現(xiàn)出嚴(yán)重的退化現(xiàn)象。為此，筆者進(jìn)行野生蜜環(huán)菌菌株采集、分離篩選研究，以期為紅桿天麻共生蜜環(huán)菌篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

51個與野生天麻共生的野生蜜環(huán)菌菌索樣、蜜環(huán)菌A9(對照)。櫟樹木材(青岡)、珍珠巖、樹葉，PDA固態(tài)培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿，250 mL錐形瓶。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 選擇優(yōu)株 將樣材料帶回后，分別與500 g櫟樹木材(青岡)和500 g干凈濕潤的青岡樹葉混合，在同一環(huán)境室內(nèi)種入珍珠巖中進(jìn)行培養(yǎng)，20 d。將菌索生長快、無腐爛、無霉菌，性狀優(yōu)良的菌索生長點(diǎn)為首選材料(菌株)。

1.2.2 優(yōu)選分離菌株培養(yǎng) 在超凈工作臺，用尖頭鑷子取優(yōu)選分離的蜜環(huán)菌菌株菌索白嫩生長點(diǎn)0.5～1 cm左右，用無菌水沖洗后，尖端朝下豎直插入PDA培養(yǎng)基內(nèi)，25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，獲取菌絲體后，再擴(kuò)大培育。

1.2.3 優(yōu)選菌株分子生物學(xué)鑒定 委托陜西理工大學(xué)生物學(xué)院實(shí)驗(yàn)室將優(yōu)選分離擴(kuò)大培育的菌株及對照菌株(A9)再進(jìn)行培養(yǎng)皿活化培養(yǎng)后，用蜜環(huán)菌菌株按照基因組瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證、PCR擴(kuò)增18S rRNA序列 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證；將條帶切割，分別合并，進(jìn)行PCR膠回收，具體操作步驟參照天根生化科技有限公司《DNA純化回收試劑盒》，送交測序公司測序，分析軟件MEGA4.0，構(gòu)建進(jìn)化樹，對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.4 蜜環(huán)菌伴栽天麻試驗(yàn) 按照《略陽縣天麻栽培技術(shù)》統(tǒng)一規(guī)范技術(shù)，在海拔600～1 420 m區(qū)域八個村進(jìn)行蜜環(huán)菌L1、L2、L3、L4、A9與天麻蒴果伴栽試驗(yàn)。每個菌株隨機(jī)抽查3窩，每窩翻3根菌棒。種植2個月后觀察菌索、天麻種子生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生蜜環(huán)菌優(yōu)選結(jié)果

在不同海拔有豐富櫟類殼斗科植物生長的地區(qū)采集51個蜜環(huán)菌菌株，共獲得4株優(yōu)良蜜環(huán)菌菌株，分別為L1(西淮壩楊樹峁，海拔1 264.1 m)；L2(甘肅陽壩，海拔1 104 m)；L3(郭鎮(zhèn)灣里，海拔1 172.8 m)；L4(五龍洞，海拔951.6 m)。

表1 優(yōu)良野生蜜環(huán)菌采集位置

由此可見，優(yōu)良野生蜜環(huán)菌生長地在海拔900～1 300 m。陜西略陽具有典型的秦巴山地特征，又是我國天麻傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)，具有豐富的野生蜜環(huán)菌資源，可以認(rèn)為該地區(qū)是優(yōu)良野生蜜環(huán)菌自然生長分布區(qū)域之一。

2.2 優(yōu)選蜜環(huán)菌菌株三級種培養(yǎng)結(jié)果

由陜西略陽縣鴻福菌種廠，將試管轉(zhuǎn)入已制作好的母種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接培養(yǎng)三級種。結(jié)果見表2。

表2 優(yōu)選蜜環(huán)菌菌株三級種培養(yǎng)結(jié)果

由表2 可知，L1、L3、L4蜜環(huán)菌菌株生長表現(xiàn)各不相同，顏色均比較好、相比較菌絲長、生長優(yōu)良。

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

所選菌株分別送陜西微生物研究所、陜西理工大學(xué)分別鑒定，結(jié)果顯示相似度由低到高是L3菌屬于Armillaria(蜜環(huán)菌屬)，與Armillariagallica較為接近，相似度97%;L4菌屬于Armillaria(蜜環(huán)菌屬)，與Armillariagallica接近，相似度97%；L1菌屬于Armillaria(蜜環(huán)菌屬)，與Armillariagallica接近，相似度99%；可以認(rèn)為A9、L1、L2和L4均為蜜環(huán)菌。

經(jīng)過對5種蜜環(huán)菌的培養(yǎng)，其中L1、L3與L4進(jìn)行了培養(yǎng)皿活化培養(yǎng)，以及液體培養(yǎng)。由于母種污染，L2和A9沒擴(kuò)大培養(yǎng)。L1、L3與L4的培養(yǎng)皿活化培養(yǎng)，顯示蜜環(huán)菌活力大小由高到底為：L1>L3>L4(圖1)。

L1蜜環(huán)菌 L3蜜環(huán)菌 L4蜜環(huán)菌

2.4 伴栽天麻試驗(yàn)結(jié)果

篩選獲得蜜環(huán)菌菌株與A9(對照)菌索外殼都呈現(xiàn)較厚而菌索皮層較薄，中腔充滿濃密的疏松菌絲，生命力旺盛。在土壤缺水偏干的環(huán)境中，L1長勢較好，抗旱能力強(qiáng)，菌絲粗狀；其次是L4，L2、L3；在海拔600～1 420 m,L1、L2、L3號表現(xiàn)長勢旺盛；A9號(對照)在各試驗(yàn)點(diǎn)缺水偏干的環(huán)境中長勢弱，但在水分充足條件下，其生命力旺盛，分枝多，菌絲略細(xì)；L4、A9蜜環(huán)菌顏色紅褐色稍偏紅為主，L1、L2、L3菌索顏色稍深些紅棕色或褐色為主。從天麻萌發(fā)情況看(表3、續(xù)表3)，L1、L3、L4、A9(對照)在1 000 m海拔以下的長壩、仙臺壩、兩流水、跑馬村、明水壩、葦子溝等幾處萌發(fā)好，接菌快，后期整體天麻產(chǎn)量都好。有可能這些地區(qū)溫度適宜，對天麻生長有很大促進(jìn)作用。

表3 優(yōu)選蜜環(huán)菌大田伴栽天麻試驗(yàn)結(jié)果

2.5 子實(shí)體培養(yǎng)提取純菌絲結(jié)果

將蜜環(huán)菌母種活化、擴(kuò)大培養(yǎng)后，進(jìn)行蜜環(huán)菌子實(shí)體誘導(dǎo)(圖2)。在黑暗培養(yǎng)獲得的蜜環(huán)菌至于恒溫光照培養(yǎng)箱中，設(shè)置條件：18℃，晝夜交替培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為60%，水分設(shè)置為95%。注意保持水分潮濕環(huán)境。觀察出菇情況。L1、L3子實(shí)體誘導(dǎo)取得成功，但沒有獲得有效蜜環(huán)菌純菌絲。后期還需繼續(xù)培養(yǎng)子實(shí)體產(chǎn)生的孢子作為種源，然后進(jìn)行分離培養(yǎng)出純的菌絲體，今后，應(yīng)加強(qiáng)保種和子實(shí)體培養(yǎng)提取純菌絲工作，以減緩多代繁育退化的速度。

蜜環(huán)菌的活化

3 小結(jié)與討論

蜜環(huán)菌是天麻供給營養(yǎng)的載體，野生資源有一定的分布范圍，其活力直接影響天麻的產(chǎn)量，目前從野生天麻變型與伴生蜜環(huán)菌分布看，不同天麻種、變型對蜜環(huán)菌是有區(qū)別的，陜西略陽紅桿天麻多分布在海拔900～1 300 m，烏桿天麻多分布在海拔1 500～2 000 m，是否存在不同變型天麻生長對蜜環(huán)菌需求不同，國內(nèi)尚未有此報(bào)道，后期還需要進(jìn)一步研究。同時(shí)，在科學(xué)采集野生蜜環(huán)菌資源時(shí)，建議根據(jù)其蜜環(huán)菌生境，采取自然保存，減少人工保存成本，恢復(fù)抗性，以保護(hù)蜜環(huán)菌資源，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)利用。