藥用淫羊藿開花結實及種子休眠特性研究進展△

閆濱濱，崔欣萍，萬修福，康傳志，王升，孫嘉惠，楊健，張燕

中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700

淫羊藿又名仙靈脾、剛前，是小檗科淫羊藿屬植物的干燥葉，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效[1]340?，F(xiàn)代研究表明，淫羊藿屬植物含有淫羊藿素、淫羊藿苷、去甲基淫羊藿苷、黃酮類、生物堿等成分[2-3]，可用于降血糖、降血壓、鎮(zhèn)咳祛痰平喘、殺菌抗炎、抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤、抗抑郁、抗衰老、提高性機能等[4-12]。隨著我國現(xiàn)代中藥產(chǎn)業(yè)化的迅速崛起，國內(nèi)和國際市場對淫羊藿需求量越來越大，而市場上流通的淫羊藿藥材大部分來自野生資源且為全株挖取。隨著野生藥材的大量采挖，淫羊藿野生資源逐年減少[13-15]，資源和生態(tài)破壞較大。因此，積極開展淫羊藿人工栽培不僅能取得更好的經(jīng)濟效益，還對生態(tài)恢復有一定促進作用。自然條件下的淫羊藿有性生殖能力較弱，開花率和結實率都不超過10%[16-17]。楊利民等[18]研究發(fā)現(xiàn)，朝鮮淫羊藿平均開花率不超過8%，結果率不超過6%，因此，淫羊藿維持種群更新和生長的主要方式為無性繁殖[19]。淫羊藿種子有明顯的休眠現(xiàn)象，自然條件下約1 年才能出苗[17]。另外，淫羊藿屬植物主要生長在陰冷潮濕的山溝中，生境比較特殊，果實成熟后容易自裂，很難準確把握種子采收時間[20]。

雖然淫羊藿種子繁殖較為困難，但種子作為繁殖體，能夠選育出優(yōu)勢種質(zhì)，遺傳性狀十分穩(wěn)定，有利于種源保護，容易實現(xiàn)擴大繁殖。因此，應進一步加強研究，使其能滿足淫羊藿實際生產(chǎn)需求和品種保護。張著林等[21]對粗毛淫羊藿種子的繁殖研究結果顯示，其出苗率最低為17%，最高為55%，由此可見，使用種子繁殖具有一定的可行性。綜上所述，為使藥用淫羊藿植物資源得到可持續(xù)利用，針對淫羊藿開花結實及種子休眠特性開展研究非常重要。

1 淫羊藿的種質(zhì)資源

淫羊藿是小檗科淫羊藿屬植物的統(tǒng)稱，全世界約有68 種，分布于歐洲意大利北部至黑海，非洲北部，亞洲西喜馬拉雅地區(qū)、中國、朝鮮和日本。我國作為該屬的現(xiàn)代地理分布中心，約有40 種，分布于四川、重慶、貴州、湖北、陜西、湖南、甘肅及東北各省。其中，四川是主要分布區(qū)，主產(chǎn)地有雅安、樂山、峨眉山、甘孜、阿壩、宜賓、眉山、成都等[20]。但不是所有淫羊藿都可作為藥用[22]。目前，作為藥用的淫羊藿有十幾種[23]，《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版收載的有5 種，分別為淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.、柔毛淫羊藿E.pubescensMaxim.、箭葉淫羊藿E.sagittatumMaxim.、朝鮮淫羊藿E.koreanumNakai、巫山淫羊藿E.wushanenseT.S.Ying[1]340。除此之外，粗毛淫羊藿E.acuminutumFranch.、天平山淫羊藿E.myrianthumStearn、氈毛淫羊藿E.coactumH.R.Liang&W.M.Yan、黔嶺淫羊藿E.leptorrhizumStearn 為貴州省地方標準收載種[24-29]。

《中國藥典》2020 年版收載的5 種淫羊藿主要分布區(qū)域情況為淫羊藿和柔毛淫羊藿適宜生境面積最大的地區(qū)為四川省，這2 種基原在分布范圍上也存在重合，主要集中于甘肅、陜西和四川省的低海拔林區(qū)[23]；朝鮮淫羊藿作為特有種，僅分布在與朝鮮接壤的遼寧和吉林部分地區(qū)；箭葉淫羊藿主要集中于浙江和安徽交界一帶；巫山淫羊藿分布區(qū)域較廣，集中于川東、渝北、陜南區(qū)域和貴州東南部，少量分布于湖北西部和廣西北部[24]。

2 藥用淫羊藿的開花結實特性

2.1 淫羊藿的開花物候

開花物候是描述植物生活史及其特征的重要表征方式[30-32]，植物個體生殖成功與否、植株間生長、種群動態(tài)等各方面都受植株個體開花物候影響。淫羊藿開花周期為1年1次，早春開花，花期主要集中在2—4 月，因種類和生境條件不同，其開花期有所差異（表1）[33-34]。同一種類不同地點的淫羊藿開花期不同。例如，四川南充地區(qū)的柔毛淫羊藿開花期為3月上旬至4月上旬，而四川雅安地區(qū)的柔毛淫羊藿開花期較長，為2月下旬至4月下旬；四川南充地區(qū)的箭葉淫羊藿開花期為2月上旬至3月下旬，而河南駐馬店地區(qū)的箭葉淫羊藿開花期為3月下旬至4月下旬。相同地點不同種類的淫羊藿開花期有所差異。例如，四川雅安市的綠藥淫羊藿開花期為2 月下旬至4 月下旬，興寶淫羊藿為3 月上旬至3 月下旬，天全淫羊藿的開花期為2月下旬至3月下旬。其開花天數(shù)也有所不同。相同地點不同種類的淫羊藿結實期不同，如四川雅安市的綠藥淫羊藿結實期為3 月上旬至4 月下旬，興寶淫羊藿為3 月中旬至3 月下旬，而天全淫羊藿卻為2月下旬至4月中旬。其結實期天數(shù)也有所差異。

2.2 淫羊藿植株開花結實特點

淫羊藿屬植物的單株開花數(shù)和結實數(shù)因種類和生境不同而不同（表2）[33-34]。同種淫羊藿在不同生境下單株開花數(shù)不同，如柔毛淫羊藿在唐家河自然保護區(qū)、金城山自然保護區(qū)、四川農(nóng)業(yè)大學的單株開花數(shù)差異較大，最少為18朵，最多為51朵。相同生境下不同種類淫羊藿的單株開花數(shù)也不同，如四川雅安市（四川農(nóng)業(yè)大學）的柔毛淫羊藿、綠藥淫羊藿、寶興淫羊藿、天全淫羊藿的單株開花數(shù)均不同。不同種類淫羊藿的單株結實數(shù)差異較大，如柔毛淫羊藿、綠藥淫羊藿、寶興淫羊藿、天全淫羊藿單株結實數(shù)差異較大，最少為2個，最多為81個。

淫羊藿花果期可分為始花期、盛花期、末花期和結實期4個時期。始花期指第一朵花開花的日期，盛花期指80%花序開花的日期，末花期指最后一朵花凋零的日期，結實期指果實50%以上籽粒堅硬日期[20]。研究表明，坐果數(shù)與盛花期、花期持續(xù)時間均呈極顯著正相關，但與始花期無相關關系[33]。譚淋等[35]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，開花期越早，植株結實率越高、種子越飽滿。單株花序的開花順序為花序基部各分支中間花蕾-花序基部兩邊花蕾和花序中部各支的中間花蕾-花序中部各支兩邊花蕾-花序上部花蕾。淫羊藿單花開花動態(tài)一般是花蕾長至一定花長，外萼片開始脫離，花瓣完全開放后開始授粉，授粉成功后，雄蕊與花距脫落，之后花瓣脫落，最終剩下果實[34]。

3 影響藥用淫羊藿開花結實因素

3.1 開花的時空效應對淫羊藿結實的影響

淫羊藿開花結實的影響因素較多，開花時期（時間效應）、花序生長部位（位置效應）、環(huán)境條件、授粉方式、花粉活力、花型等，都對淫羊藿開花率、結實率、種子千粒質(zhì)量有顯著影響。如表3所示，在開花時間效應對淫羊藿的影響中，早期和中期的開花率、結實率、種子千粒質(zhì)量要顯著高于晚期。種子敗育率在晚期較高，而在早期和中期較低[36]。開花時間效應對內(nèi)萼片長、內(nèi)萼片寬、花藥長、花距寬、花距長的影響顯著，其參數(shù)均是早期和中期大于晚期[37]。開花的位置效應對巫山淫羊藿的生殖成功具有顯著影響，其基部和中部的種子敗育率均顯著低于頂部，種子數(shù)量、千粒質(zhì)量均顯著高于頂部[37]。

3.2 環(huán)境因素對淫羊藿開花結實的影響

光照強度、溫度、水分、極端天氣（大風、大雨）等環(huán)境因素對淫羊藿開花結實具有顯著影響。如表3 所示，光照強度對開花結實的影響較明顯。研究表明，在光照強度較低的生長環(huán)境下（高大喬木松樹林下，土壤被松針覆蓋，小草本植株稀疏分布，郁閉度高達80%），朝鮮淫羊藿結實率最高。在光照強度適中的生長環(huán)境下（四面有灌木環(huán)繞，朝鮮淫羊藿生長地方主要分布一些草本植物，郁閉度50%），單株平均開花數(shù)最多且種子千粒質(zhì)量最大[38]。水分對花的形成過程十分必要，如果水分不足，會讓幼穗形成延遲。四川南充市在3—4 月雨水充足，相對濕度保持在70%～94%，這是箭葉淫羊藿生長的重要條件。溫度對開花也有重要影響，在箭葉淫羊藿開花時期，溫度保持在10～13 ℃[39]。極端天氣對開花結實的影響較大，研究表明，低溫陰天單花壽命較長；大雨天氣則單花壽命大大縮短。柔毛淫羊藿的花極容易敗育，特別是在遇到大風雨天氣，不僅花蕾和花朵易被打落或凋謝，同時造成傳粉的昆蟲無法幫助授粉（淫羊藿主要屬蟲媒花），淫羊藿的結實率必然很低[40]。

表3 藥用淫羊藿開花結實影響因素

3.3 花型對淫羊藿結實的影響

巫山淫羊藿的結實特性受到生境和花部特征的雙重影響，其中花型比生境對巫山淫羊藿結實特性影響更為明顯[41]。巫山淫羊藿具有3種花部特征，即雌蕊長度等于或者短于雄蕊（PESS）、雌蕊長于雄蕊（PLS）、雌蕊長于雄蕊并發(fā)生偏離雄蕊的彎曲生長（SAA）的花部特征。不同花部特征的果實飽滿種子數(shù)、敗育數(shù)和敗育率差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而種子數(shù)差異不大。其中，花部特征PESS的飽滿種子數(shù)顯著低于其余2 種花部特征，而花部特征PESS敗育數(shù)和敗育率要顯著高于PLS和SAA。

4 藥用淫羊藿的傳粉特性

淫羊藿主要為異花授粉，屬于蟲媒花，其柱頭可授性及花粉活力均與開花時間有一定的相關性[36,42]。對朝鮮淫羊藿授粉相關研究表明，去雄、自花授粉結實率低，且結出的種子干癟；去雄、異株授粉，不套袋結實率高達90%，單果種子數(shù)也最多，且種子較大而飽滿[42]。巫山淫羊藿自然傳粉的結實率也顯著低于人工異花授粉[36]，說明其采用自花授粉方式不利于結實。淫羊藿主要傳粉者為蜜蜂，傳粉者主要誘物為產(chǎn)生花蜜的花距，缺失花距會影響傳粉者訪問，顯著影響巫山淫羊藿的生殖成功[36]。

朝鮮淫羊藿不同開花狀態(tài)下，柱頭可授性差異較大，在中蕾時柱頭開始具有可授性，隨著花蕾增大，柱頭可授性逐漸增強，至花瓣剛剛張開，花粉散出時最強，然后下降。小蕾時花粉活力最高，其次為盛花期，末花期最低。推測花粉活力的影響因素主要是溫度[43-46]，研究表明，在24 h內(nèi)烏丹蒿傳粉效率與氣溫呈正相關[47]。推測淫羊藿的異花授粉特性是植物自身為了降低氣溫變化對傳粉的影響而作出的相應反應[48]。

5 藥用淫羊藿種子休眠特性

5.1 藥用淫羊藿種子休眠原因

淫羊藿種子有明顯的休眠現(xiàn)象，休眠原因主要為胚形態(tài)后熟與發(fā)芽抑制物。如表4 所示，對巫山淫羊藿研究表明，其種皮沒有明顯吸水障礙，通過解剖觀察發(fā)現(xiàn)，其自然成熟時種胚尚未完全發(fā)育成熟，同時發(fā)現(xiàn)其種皮與胚乳提取物可明顯抑制白菜幼根的生長，說明種子休眠的主要原因為胚形態(tài)后熟及發(fā)芽抑制物[49]。對朝鮮淫羊藿研究表明，其種子同樣存在明顯的形態(tài)后熟現(xiàn)象，種皮透水性好，無機械障礙，種子中含有一定活性的萌發(fā)抑制物質(zhì)[50]。擬巫山淫羊藿[51]與箭葉淫羊藿[52]種子也存在胚形態(tài)后熟及發(fā)芽抑制物導致種子休眠的現(xiàn)象。

表4 藥用淫羊藿種子休眠原因及打破休眠方法

5.2 藥用淫羊藿種子的破眠方法

層積或使用生長調(diào)節(jié)劑處理可打破淫羊藿種子休眠，但不同品種的淫羊藿種子破眠方法并不一致[51]。研究表明，低溫層積較其他方法可顯著促進巫山淫羊藿種胚形態(tài)發(fā)育，發(fā)芽率可由0 提高至79.3%[49]。而朝鮮淫羊藿需要先經(jīng)過暖溫砂藏促進胚的發(fā)育，再經(jīng)過低溫層積加速胚的發(fā)育[50]。擬巫山淫羊藿種子與朝鮮淫羊藿相似，同樣需要先暖溫砂藏再低溫層積，發(fā)芽率可由6.99%提高至90%[51]。層積有利于打破種子休眠，推測是由于層積促使種胚新陳代謝，增加酶活性，有利于種子內(nèi)大分子營養(yǎng)物質(zhì)（脂肪、蛋白質(zhì)等）分解為小分子營養(yǎng)物質(zhì)，供給種胚生長發(fā)育，從而打破休眠[49]。

除了層積處理外，不同生長調(diào)節(jié)劑處理，對種子萌發(fā)也有一定的促進作用。脫落酸（ABA）和GA 為2 種相互拮抗的植物激素，在種子休眠與萌發(fā)中起著重要的調(diào)控作用。ABA 為種子萌發(fā)抑制因子[53-55]，GA為種子萌發(fā)促進因子[56-59]，內(nèi)源ABA/GA水平?jīng)Q定著種子對環(huán)境信號的響應特性，進而使種子表現(xiàn)出休眠或萌發(fā)的現(xiàn)象[60-61]。氟啶酮為ABA 生物合成抑制劑，具有促進種子萌發(fā)的作用[62-63]。單純的試劑處理可能對種子有一定傷害，如GA 具有增加爛種率的風險，因此不同生長調(diào)節(jié)劑配合使用可能對種子解除休眠效果更好。研究表明，10 mg·L-1氟啶酮+300 mg·L-1GA 處理可有效打破巫山淫羊藿種子休眠[49]。生長調(diào)節(jié)劑與層積處理協(xié)同使用，效果也較佳，100 mg·L-1GA 浸泡6 h 后低溫4 ℃層積可有效打破擬巫山淫羊藿種子休眠[51]。各淫羊藿種子具體打破休眠的方法見表4。

6 展望

隨著我國現(xiàn)代中藥產(chǎn)業(yè)化的迅速崛起，國內(nèi)和國際市場對藥用淫羊藿的需求量越來越大[13]。但淫羊藿自然授粉率低、種子敗育率較高、種子形態(tài)參數(shù)較差、種子休眠現(xiàn)象嚴重。因此，針對提高淫羊藿結實率、快速打破種子休眠，提高種子發(fā)芽率的研究勢在必行。根據(jù)目前對淫羊藿開花結實的研究現(xiàn)狀，建議今后從以下方面開展研究：1）加強藥用淫羊藿開花結實影響因素的調(diào)查研究。目前，研究主要針對淫羊藿開花結實的生物學特性，對影響其開花結實的環(huán)境因子還沒有系統(tǒng)地開展，需要從光照、水分、土壤條件、營養(yǎng)條件等多方面進行探索，為提高淫羊藿開花結實率研究奠定基礎。2）種子豐產(chǎn)栽培技術研究。淫羊藿種子產(chǎn)量低，開花結實率不穩(wěn)定，造成該現(xiàn)象的原因可能是營養(yǎng)不足、花粉活力降低[64]、高溫[65]等。其還與整個栽培生產(chǎn)過程有關，需要進一步從種植模式、種植密度[66-68]、授粉技術[69-71]、灌溉[72]、施肥[73-76]、采收期等多方面開展系列研究，以提高其種子產(chǎn)量和質(zhì)量，最終制定科學的淫羊藿良種繁育技術規(guī)程。3）快速高效打破種子休眠技術研究。目前，已經(jīng)明確淫羊藿種子休眠是由于形態(tài)后熟與發(fā)芽抑制物，但尚未建立高效破除種子休眠的技術?？梢詮膶臃e基質(zhì)[77]、層積溫度[78]、層積時間、不同調(diào)節(jié)劑配合處理[57]、調(diào)節(jié)劑與層積協(xié)同使用等方面著手，建立一套成熟的打破種子休眠的技術，同時開展其休眠機制研究。4）良種選育。分別從開花時間、植株性狀、結實率等方面篩選開花結實時間一致、環(huán)境適應能力強、結實率高、產(chǎn)量質(zhì)量均較高的種質(zhì)類型。從種源上解決淫羊藿出苗率與結實率低、種子采收困難等問題。