短蛸微衛(wèi)星多重PCR體系建立及交配模式分析*

劉文芬 馮艷微 王衛(wèi)軍 陳建強(qiáng) 楊建敏

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201306；2. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 煙臺(tái) 264006)

短蛸(Amphioctopus fangsiao)俗稱坐蛸、飯蛸、八帶，屬頭足綱(Mollusca)，八腕目(Octopoda)，無須亞目(Incirrata)、蛸科(Octopodidate)、蛸屬(Octopus)，主要群體棲居于溫帶偏北海域，在黃、渤海產(chǎn)量較大，是我國北部沿海蛸類中最重要的經(jīng)濟(jì)種之一(張龍崗等, 2009)。短蛸肉質(zhì)鮮美，具有較高的食用和藥用價(jià)值，國內(nèi)市場及加工出口發(fā)展迅速，具有廣闊產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景。然而，由于市場消費(fèi)需求的不斷增長，對短蛸的捕撈強(qiáng)度不斷增大，使得其自然資源日漸枯竭，對短蛸進(jìn)行全人工養(yǎng)殖勢在必行。交配期是頭足類繁殖行為的重要時(shí)期，具有復(fù)雜的求偶、交配和繁殖策略(Hanlon et al, 1996)。交配行為模式研究能為短蛸的人工繁育及種質(zhì)資源保護(hù)提供重要的基礎(chǔ)資料。目前，有關(guān)短蛸人工育苗、精莢超微結(jié)構(gòu)、攝食行為、營養(yǎng)成分、遺傳多樣性以及免疫應(yīng)答機(jī)制等已展開諸多研究(朱文博等, 2015; Yang et al, 2011; 王衛(wèi)軍等,2017; 薛靜等, 2015; 張龍崗等, 2009; 張冉冉等,2015)，繁殖行為學(xué)的研究相對匱乏，只有張學(xué)舒(2002)和王衛(wèi)軍等(2010)對其進(jìn)行了初步研究。

研究動(dòng)物的交配模式最直觀的方法是實(shí)地觀察，但對于活性強(qiáng)的水生動(dòng)物而言難度較大。而且，觀察到多重交配行為并不代表多重受精成功，真正的雌性混交動(dòng)物，其后代中應(yīng)存在多父性現(xiàn)象，而多父性通過個(gè)體直接觀察很難判斷。微衛(wèi)星標(biāo)記，又稱簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeats, SSR)具有共顯性、高多態(tài)性、高保守性、檢測快速等特點(diǎn)，是理想的親權(quán)鑒定標(biāo)記(Buresch et al, 2001; 李佳凱等, 2014;汪金海等, 2017)。微衛(wèi)星多重 PCR可在同一反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)位點(diǎn)，較傳統(tǒng) PCR省時(shí)、高效、成本低，可有效減少靶基因片段的假陽性現(xiàn)象(羅偉等, 2013; 李東宇等, 2016)。

本研究利用實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記，選擇多態(tài)性高、特異性好、片段大小適中的位點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化組合，構(gòu)建微衛(wèi)星多重 PCR體系，對短蛸親體和幼體進(jìn)行親權(quán)鑒定，旨在分析其交配模式，為短蛸的種質(zhì)資源保護(hù)及人工繁育提供科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用親體與幼體樣品于2015年采集于山東省海洋資源與環(huán)境研究院東營基地。將野生雄蛸和雌蛸于池中暫養(yǎng)，待其交配產(chǎn)卵后雄蛸陸續(xù)死亡，取19個(gè)雄蛸(編號♂1～♂19)腕部組織于無水乙醇中，–20℃保存?zhèn)溆?。受精卵?jīng)雌蛸40 d護(hù)卵孵化后，獲得短蛸幼體，隨機(jī)選取4個(gè)雌蛸(編號♀1～♀4)及對應(yīng)幼蛸共104個(gè)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 短蛸基因組DNA的提取和檢測 用CTAB法(Winnepenninckx et al, 1993)抽提 DNA，于 30 μl 1×TE Buffer(pH=8.0)溶解，用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性，Thermo Scientific NanoDrop?OneC超微量紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度和純度，將DNA濃度調(diào)至50 ng/μl，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星多重 PCR的設(shè)計(jì)和優(yōu)化 在實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記中，根據(jù)擴(kuò)增條帶清晰度、亮度及多態(tài)性選用 12個(gè)位點(diǎn)(未發(fā)表)，分別為 DS140，DS135，DS226，DS94，DS150，DS35，DS16，DS132，DS290，DS157，DS169，DS271。依據(jù)各位點(diǎn) PCR退火溫度、等位基因大小范圍、是否存在非特異性條帶、引物間是否存在較強(qiáng)的互補(bǔ)性，挑選引物序列間互不干擾、擴(kuò)增片段長度不重疊、退火溫度相近的位點(diǎn)構(gòu)建多重PCR。首先進(jìn)行兩位點(diǎn)的組合實(shí)驗(yàn)，在二重PCR基礎(chǔ)上不斷調(diào)整引物濃度構(gòu)建多重PCR。

利用建立的多重 PCR分別對 19個(gè)候選父本、4個(gè)母本及對應(yīng)的104個(gè)幼蛸進(jìn)行特異性擴(kuò)增。多重PCR 反應(yīng)體系為 10 μl，包括模板 DNA 1.0 μl (50 ng)，10 × PCR buffer(Mg2+plus) 1.0 μl，2.5 mmol/L dNTPs 1.0 μl，10 μmol/L 正反引物共 2.0 μl，5 U/μl Taq DNA聚合酶 0.05 μl，ddH2O 4.9 5μl。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，退火溫度45 s，72℃延伸45 s，循環(huán)35次；最后，72℃延伸6 min；4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物通過8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色，于Bio-5000 plus電泳掃描儀拍照保存，以10 bp DNA Marker為參考標(biāo)準(zhǔn)對目的條帶判讀。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用 CERVUS 3.0進(jìn)行親子鑒定分析，母本已知，具體參數(shù)設(shè)置為候選父本19，模擬子代數(shù)為 10000，親本檢測率 100%，分型誤差率1%，位點(diǎn)檢測率100%，95%的置信區(qū)間。

2 結(jié)果

2.1 短蛸微衛(wèi)星多重PCR體系的構(gòu)建

12個(gè)位點(diǎn)經(jīng)優(yōu)化組合后得到4組三重PCR，三重PCR體系引物的位點(diǎn)組合、重復(fù)單元、堿基序列、產(chǎn)物大小、退火溫度詳見表1。其中，3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)DS169、DS152、DS271構(gòu)建的多重PCR在短蛸子代中的部分?jǐn)U增結(jié)果見圖1。圖1中3個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增片段長度不重疊，能清晰區(qū)別和有效判讀目的條帶，本研究構(gòu)建的微衛(wèi)星多重 PCR反應(yīng)體系可用于親權(quán)鑒定分析。

2.2 短蛸交配模式分析

利用4組三重PCR體系，使用CERVUS 3.0對4個(gè)母本、104個(gè)子代及19個(gè)候選父本進(jìn)行親權(quán)鑒定，基于似然法從非排除親本中選出最可能親本。分析結(jié)果如下：104個(gè)子代鑒定率為94.23%(98/104)，♀1組幼蛸有12個(gè)個(gè)體鑒定到父本(12/14)，父本為♂2、♂7或♂16；♀2組幼蛸有40個(gè)個(gè)體檢測到父本(40/41)，父本有 7個(gè)，為♂2、♂3、6、♂7、♂10、♂12或♂15；♀3組和♀4組分別鑒定出19、27個(gè)幼蛸個(gè)體(19/21、27/28)，父本分別為♂2、♂3和♂2、♂3、♂7、♂10。每組樣品親子鑒定結(jié)果見表2。

3 討論

微衛(wèi)星通常作為單個(gè)位點(diǎn)以 PCR方式擴(kuò)增，此過程需要一定時(shí)間和成本。多重 PCR在微衛(wèi)星遺傳分析中可以節(jié)省大量時(shí)間、成本和工作量，也可以在PCR操作過程中減小人為的誤差(Porta et al, 2006)，在分析大量實(shí)驗(yàn)樣本時(shí)，多重 PCR技術(shù)的優(yōu)勢更加明顯。20世紀(jì)80年代，Chamberlain等(1988)首次嘗試了多重PCR反應(yīng)模式。目前，多重PCR擴(kuò)增體系已廣泛應(yīng)用于一些水產(chǎn)動(dòng)物的親權(quán)鑒定、遺傳多樣性研究中，例如大黃魚(Larimichthys crocea)(李佳凱等,2014)、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)(羅偉等,2013)、長牡蠣(Crassostrea gigas)(紀(jì)仁平等, 2015)等。理想的多重 PCR要求在同一反應(yīng)體系完成多個(gè)位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增，并非單一 PCR的簡單組合，要針對目的產(chǎn)物，反復(fù)試驗(yàn)綜合分析，構(gòu)建最優(yōu)的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件(陳明潔等, 2005)。本研究主要優(yōu)化引物濃度和退火溫度，在二重PCR基礎(chǔ)上進(jìn)行三重PCR實(shí)驗(yàn)，直至各產(chǎn)物條帶清晰能明顯區(qū)分，得到最優(yōu)組合。利用構(gòu)建的4組三重PCR體系，104個(gè)子代鑒定率達(dá)到94.23%(98/104)，成功率較高。研究表明，分子標(biāo)記的選擇在很大程度上影響著親子關(guān)系鑒定的結(jié)果，用于親子關(guān)系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)量越大、多態(tài)性越高，則鑒定的成功率和準(zhǔn)確率越高(Jerry et al,2004)。本研究需增加更多的微衛(wèi)星標(biāo)記以提高鑒定成功率。

表1 短蛸4組微衛(wèi)星三重PCR體系特征Tab.1 Characteristics of four microsatellite multiplex PCRs in A. fangsiao

圖1 3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)DS169、DS152和DS271構(gòu)建的多重PCR在短蛸子代中部分?jǐn)U增結(jié)果Fig.1 The partial amplification results of multiplex PCR consist of three microsatellites DS169, DS152, and DS271 in offsprings of A. fangsiaoM: DNA marker; 1～4: ♀1的 4個(gè)子代(Four offsprings of ♀1 group)

交配模式分析有助于全面了解水產(chǎn)動(dòng)物復(fù)雜的繁殖行為，能為其人工繁育、增養(yǎng)殖、遺傳育種及人工放流等多個(gè)方面提供重要支撐。傳統(tǒng)的交配模式研究方法主要基于野外或人工養(yǎng)殖觀察，其結(jié)果易受外界條件影響。隨著多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)在親權(quán)鑒定方面的應(yīng)用，生物交配模式研究已從宏觀深入到微觀，結(jié)果更具可靠性。Stanback等(2002)利用小衛(wèi)星 DNA標(biāo)記研究犀鳥(Tockus monteiri)的交配模式，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)為多配型，而野外觀察結(jié)果屬單配型。Buresch等(2001)用微衛(wèi)星標(biāo)記對槍烏賊(Loligo pealeii)卵群進(jìn)行分析，證實(shí)了槍烏賊為一雌多雄交配模式。本研究利用構(gòu)建的微衛(wèi)星多重PCR體系對4組短蛸親本和子代樣品進(jìn)行親權(quán)鑒定，結(jié)果顯示，4組短蛸父本數(shù)分別為3、7、2和4，證明短蛸存在多雌多雄交配模式。多雌多雄交配模式是水產(chǎn)動(dòng)物對環(huán)境及人為捕撈壓力的一種適應(yīng)，能有效提高等位基因遺傳多樣性以及子代遺傳變異類型，對穩(wěn)定其種群結(jié)構(gòu)、提高繁殖效率和子代質(zhì)量起到積極作用。采用實(shí)地觀察方法進(jìn)行交配模式研究時(shí)，觀察到多重交配行為并不代表多重受精成功。本研究，4組樣品經(jīng)鑒定涉及到的候選父本為8個(gè)，說明其余11個(gè)父本未參與交配或交配后受精未成功。

表2 短蛸4組樣品的親子鑒定結(jié)果Tab.2 The paternity results of the four group of offsprings in A. fangsiao

本研究4組樣品中父本♂2的后代比例分別高達(dá)71.43%(10/14)、 60.98%(25/41)、 85.71%(18/21)和75%(21/28)，遠(yuǎn)超過其他父本，說明參與受精并受精成功的精子多數(shù)來自♂2，♂2在精子競爭或隱性雌性選擇中占有優(yōu)勢。精子競爭是指來自2個(gè)或2個(gè)以上雄性個(gè)體的精子為爭奪對卵的受精權(quán)而展開的競爭，它屬于交配后性選擇，實(shí)質(zhì)是一種行為學(xué)現(xiàn)象，一種用來保證自己精子高受精率的繁殖策略(Hanlon et al,1996)。在對無針烏賊(Sepiella japonica)、金烏賊(Sepia esculenta)、克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)等多種水生生物研究中也證明了精子競爭現(xiàn)象的存在(Wada et al, 2006; 汪金海等, 2017; 宋亮等, 2013)。雄性的精子競爭根據(jù)最后交配雄性子代比例可分為 3類(Birkhead et al, 1990)：最先雄性精子優(yōu)先、最后雄性精子優(yōu)先和無雄性精子優(yōu)先。繁殖期的頭足類交配前為爭奪雌性配偶會(huì)展開斗爭，實(shí)質(zhì)也屬精子競爭。關(guān)于短蛸屬于哪類精子競爭、交配前雌性(或雄性)對雄性(雌性)是否有行為選擇需進(jìn)一步深入研究。

本研究利用微衛(wèi)星標(biāo)記親子鑒定技術(shù)研究短蛸的交配模式，將為短蛸種質(zhì)資源保護(hù)及人工繁育提供科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)，為海洋頭足類性選擇機(jī)制及物種進(jìn)化等研究提供基礎(chǔ)資料。構(gòu)建的多重 PCR體系也將有助于長蛸、真蛸、烏賊等近緣物種的種質(zhì)資源研究。

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