脊尾白蝦不同蛻皮分期免疫酶、幾丁質(zhì)酶及蛻皮激素的變化*

許 楊 李 健 崔彥婷 馬 驪

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2. 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

蛻皮貫穿甲殼類的整個生活史，與其生長、發(fā)育、繁殖和附肢再生等密切相關(guān)。甲殼類蛻皮發(fā)生的關(guān)鍵因素及其調(diào)控機(jī)制一直是研究的重點(diǎn)(李旭光等,2014)。甲殼動物蛻皮一般分為以下 3種類型：發(fā)育蛻皮是蝦蟹類幼體進(jìn)行變態(tài)發(fā)育，每一期蛻皮都會對幼體的形態(tài)和生理特點(diǎn)產(chǎn)生重要影響。生長蛻皮在胚胎經(jīng)過變態(tài)發(fā)育成幼體后，要經(jīng)過多次蛻皮，使體長體重逐次增加完成生長。蛻皮不僅是舊殼的更新，還包括胃、鰓、腸等的更新及斷肢再生。生殖蛻皮又稱青春期蛻殼或終期蛻殼，卵巢發(fā)育成熟后，在交配前雌性需要蛻殼，個體的某些部位會發(fā)生外部形態(tài)的顯著變化。例如，雌蟹的腹甲可由三角形蛻變成半圓形(Hartnoll, 1974)。

蛻皮主要由互為拮抗的 Y器官分泌的蛻皮激素(MH)(Skinner, 1985)和X器官竇腺復(fù)合體分泌的蛻皮抑制激素(上官步敏等, 1995)共同調(diào)節(jié)。另外，也需要多種酶的參與，如幾丁質(zhì)酶(Chitinase)。幾丁質(zhì)富含于甲殼動物圍食膜及表皮中，其降解與重新合成是蛻皮過程中一個重要的生理過程，而幾丁質(zhì)酶在這一生理過程中起到至關(guān)重要的作用(Funke, 1989; Elyakova,1972; Jeuniaux, 1963)。蛻皮過程會影響到許多生理功能的變化，Hose等(1992)研究表明，在蛻皮過程中蝦體免疫因子會發(fā)生改變，很容易受感染。超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)等是體液防御系統(tǒng)中的重要免疫因子。酚氧化酶(PO)也是甲殼動物重要的識別和防御系統(tǒng)，是衡量免疫功能的重要指標(biāo)(Hernández-López et al, 1996; Smith et al, 1991)。

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)又名白蝦、迎春蝦等，系溫帶海水底棲蝦類，在我國沿海均有分布，尤以黃渤海產(chǎn)量最高(李新正等, 2003)。脊尾白蝦繁殖盛期一般在5～6月和8～9月；雌蝦無納精囊結(jié)構(gòu)，所以產(chǎn)卵前需進(jìn)行交配，交配前雌蝦須進(jìn)行生殖蛻皮。在繁殖期，由于抱卵雌蝦在抱卵期間卵巢可以二次發(fā)育甚至多次成熟，因此，每尾雌蝦在1年內(nèi)可以多次繁殖。本研究以脊尾白蝦為對象，從免疫相關(guān)的SOD、ACP、AKP、PO活力和蛻皮相關(guān)的Chitinase活力、MH濃度變化，初步探究了生長蛻皮、生殖蛻皮2種不同蛻皮分期之間的差異，為甲殼動物蛻皮調(diào)控機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

脊尾白蝦取自山東省日照海辰水產(chǎn)有限公司，均為活力好、體長均勻的健康個體，其中，未性成熟個體體長為(3.22±0.21) cm，體重為(0.49±0.04) g，性成熟個體體長為(5.42±0.34) cm，體重為(1.58±0.22) g。將實(shí)驗(yàn)用蝦暫養(yǎng)于200 L的PVC桶中，每桶50尾，暫養(yǎng)海水鹽度為31，pH為8.2，水溫為24℃，24 h持續(xù)充氧。每天早晚2次飼喂蛤蜊肉，吸污換水1/3，連續(xù)養(yǎng)殖10 d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 2種蛻皮區(qū)分 未性成熟的脊尾白蝦處于生長期，實(shí)驗(yàn)蝦的蛻皮為生長蛻皮。性成熟的實(shí)驗(yàn)蝦分為卵巢發(fā)育蝦和抱卵蝦，其中，卵巢發(fā)育且?guī)в懈顾{(lán)者的蛻皮為生殖蛻皮。根據(jù)中華鋸齒米蝦(Neocaridina denticulata sinensis)(王戰(zhàn)芳, 2014)和凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)(Gao et al, 2015)的方法進(jìn)行蛻皮分期，分為蛻皮間期(C期)、蛻皮后期(軟皮期, AB期)、蛻皮前期(D期, 取自特征明顯的D2亞期)。

1.2.2 樣品采集及處理 實(shí)驗(yàn)用蝦暫養(yǎng)1周后，挑選活力好、無殘缺的個體，用解剖剪剪取尾節(jié)末端，置于倒置顯微鏡觀察分期，并拍照。將確定分期的脊尾白蝦采集血淋巴：每尾蝦取0.1 ml血與0.1 ml預(yù)冷的抗凝劑混合(抗凝劑配方：1.588 g 檸檬酸鈉，3.92 g NaCl，4.56 g 葡萄糖，0.66 g EDTA-2Na，200 ml ddH2O)，4℃ 5000 r/min離心10 min后，留上清液，置于?20℃冰箱保存。每個平行取 3尾，每個蛻皮分期共3個平行。

1.2.3 樣品測定方法 PO、Chitinase、MH測試盒購自上海酶聯(lián)。應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中酶活及激素水平，測定方法參考試劑盒說明書。ACP、AKP、SOD測試盒購自南京建成生物研究所。每100 ml血清在37℃與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個ACP或AKP活力單位(U)。在反應(yīng)體系中，SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的SOD量為1個SOD活力單位(U)。具體操作見說明書。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)，同種蛻皮不同分期、不同種蛻皮同一分期分別利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行Duncan和獨(dú)立t檢驗(yàn)，One-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05為差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚氧化酶(PO)活力在不同蛻皮分期的變化

PO在不同蛻皮期的變化見圖 1。由圖 1可知，生長蛻皮各分期的PO活力差異不顯著。生殖蛻皮各分期的PO活力呈先降低后升高趨勢，且各分期差異顯著(P＜0.05)。間期時(shí)，生長蛻皮和生殖蛻皮的 PO活力差異不顯著；前期時(shí)，生殖蛻皮的PO活力顯著低于生長蛻皮(P＜0.05)；后期時(shí)，生殖蛻皮的 PO活力顯著高于生長蛻皮(P＜0.05)。

圖1 2種蛻皮的各分期酚氧化酶活力變化Fig.1 Variation of the PO activity during different stages of two types of molting同種蛻皮的不同分期用大寫字母表示差異顯著性，不同種蛻皮的同一分期用小寫字母表示。下同Capital letters indicated the significance of the difference during different stages of the same molting type, while lower case letters indicated the same stages of different types of molting. The same as below

2.2 超氧化物歧化酶(SOD)活力在不同蛻皮分期的變化

SOD活力在不同蛻皮期的變化見圖2。由圖2可知，生長蛻皮各分期SOD活力呈逐漸升高趨勢，且差異顯著(P＜0.05)。生殖蛻皮后期的SOD活力顯著低于間期和前期(P＜0.05)，間期和前期SOD活力差異不顯著。間期時(shí)，生殖蛻皮的SOD活力顯著高于生長蛻皮(P＜0.05)，前期二者差異不顯著，后期生殖蛻皮的SOD活力顯著低于生長蛻皮(P＜0.05)。

2.3 酸性磷酸酶(ACP)活力在不同蛻皮分期的變化

ACP活力在不同蛻皮期的變化見圖3。由圖3可知，生長蛻皮各分期ACP活力呈先升高后降低趨勢，且各分期差異顯著(P＜0.05)。生殖蛻皮與生長蛻皮的ACP活力變化趨勢相同；間期、前期、后期時(shí)，生長蛻皮的ACP活力都顯著高于生殖蛻皮(P＜0.05)。

2.4 堿性磷酸酶(AKP)活力在不同蛻皮分期的變化

圖2 2種蛻皮的各分期超氧化物歧化酶活力變化Fig.2 Variation of the SOD activity during different stages of two types of molting

圖3 2種蛻皮的各分期酸性磷酸酶活力變化Fig.3 Variation of the ACP activity during different stages of two types of molting

圖4 2種蛻皮的各分期堿性磷酸酶活力變化Fig.4 Variation of the AKP activity during different stages of two types of molting

AKP活力在不同蛻皮分期的變化見圖4。由圖4可知，生長蛻皮各分期 AKP活力呈先升高后降低趨勢，且各分期差異顯著(P＜0.05)。生殖蛻皮與生長蛻皮的AKP活力變化趨勢相同，間期、前期、后期時(shí)，生長蛻皮的AKP活力都顯著高于生殖蛻皮(P＜0.05)。與ACP變化趨勢相似。

2.5 幾丁質(zhì)酶(Chitinase)活力在不同蛻皮分期的變化

Chitinase活力在不同蛻皮分期的變化見圖5。由圖5可知，生長蛻皮各分期Chitinase活力呈逐漸升高趨勢，且各分期差異顯著(P＜0.05)。生殖蛻皮的Chitinase活力呈先降低后升高趨勢，且各分期差異顯著(P＜0.05)。間期和前期，生長蛻皮的Chitinase活力顯著低于生殖蛻皮(P＜0.05)；后期時(shí)，生長蛻皮的Chitinase活力顯著低于生殖蛻皮(P＜0.05)。

圖5 2種蛻皮各分期幾丁質(zhì)酶活力變化Fig.5 Variation of the chitinase activity during different stages of two types of molting

2.6 蛻皮激素(MH)濃度在不同蛻皮分期的變化

圖6 2種蛻皮各分期蛻皮激素濃度變化Fig.6 Variation of MH concentration during different stages of two types of molting

MH濃度在不同蛻皮分期的變化見圖 6。由圖 6可知，生長蛻皮各分期MH濃度呈逐漸升高趨勢，但前期與間期和后期差異不顯著，后期MH濃度顯著高于間期(P＜0.05)。生殖蛻皮各分期呈先降低后升高趨勢，且各分期差異顯著(P＜0.05)。間期、前期、后期時(shí)，生長蛻皮的 MH濃度都顯著高于生殖蛻皮(P＜0.05)。

3 討論

蛻皮是甲殼動物個體發(fā)育的一個標(biāo)志，也是個體生長的一個必要階段。近年來，甲殼動物蛻皮機(jī)制一直是研究的重點(diǎn)。在生產(chǎn)中，誘導(dǎo)蛻皮可以縮短蛻皮周期、體重增長變快、促進(jìn)抱卵等(張海燕等, 1999;崔青曼等, 2004)。抱卵蝦蟹因外界環(huán)境的刺激導(dǎo)致蛻皮，從而使受精卵脫落的現(xiàn)象，嚴(yán)重制約了苗種的生產(chǎn)，給養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。脊尾白蝦為抱卵繁殖蝦類，同步性成熟較困難，人工控制交尾及幼體培育技術(shù)尚不完善，苗種大部分來自野采親蝦自然繁殖等問題，全人工繁育技術(shù)仍需要進(jìn)一步研究。雌蝦的成熟、交尾與蛻皮密切相關(guān)，因此，本文探究了生殖蛻皮與生長蛻皮過程中卵巢發(fā)育與蛻皮調(diào)控之間的相互關(guān)系，可為蝦蟹類蛻皮機(jī)制的研究提供重要信息，為雌蝦同步性成熟、實(shí)現(xiàn)全人工繁育提供理論依據(jù)。

在甲殼動物中，酚氧化酶原系統(tǒng)在機(jī)體對抗外物入侵過程中起著重要作用。伴隨著顆粒細(xì)胞的脫顆粒和酚氧化酶原系統(tǒng)的激活，酚氧化酶被釋放出來，起識別和調(diào)理作用。血清酚氧化酶活力是蝦類的免疫指標(biāo)之一(陶保華等, 2000)。在 2種蛻皮過程中，生長蛻皮變化差異不大，生殖蛻皮在后期酶活性顯著升高，可能與蛻皮后排卵有關(guān)，這與Alexander等(1992)的研究相似。魚卵中存在著種類豐富的蛋白酶抑制劑成分，除在魚卵中執(zhí)行生理調(diào)節(jié)功能外，在病原生物防御中也起到了重要作用。而蛋白酶抑制劑可以調(diào)節(jié)酚氧化酶的活性、抗菌肽的合成等(Alexander, 1992;Gregorio et al, 2002)?；钚匝醯漠a(chǎn)生與耗氧的高低存在著一定的相關(guān)性，高的耗氧率往往導(dǎo)致高的活性氧水平，而活性氧再由抗氧化系統(tǒng)清除。SOD是唯一以活性氧為底物的抗氧化酶，催化其轉(zhuǎn)化為水和氧氣。蛻皮前后代謝旺盛、耗氧率高，相應(yīng)的活性氧也較高，因此，生長蛻皮前期和后期有著較高的 SOD活力。而生殖蛻皮在間期有著高的SOD活力，后期卻顯著低于生長蛻皮后期，這可能與生殖蛻皮間期卵巢發(fā)育代謝旺盛和后期排卵卵巢退化有關(guān)。作為溶酶體酶的標(biāo)志酶，ACP和AKP是甲殼動物的先天免疫反應(yīng)重要的參與者，同時(shí)也是甲殼動物進(jìn)行酸堿調(diào)控的重要因子(Darnell et al, 1986; Jiang et al, 2015)。生長蛻皮和生殖蛻皮變化趨勢相同，在前期擁有較高活力，但生殖蛻皮各期普遍低于生長蛻皮，這可能與卵巢發(fā)育有關(guān)。在蛻皮過程中，舊的幾丁質(zhì)外殼被幾丁質(zhì)酶降解。對甲殼動物幾丁質(zhì)酶與其蛻皮間的關(guān)系已有不少研究，Espie等(1995)發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生與蛻皮激素分泌量密切相關(guān)，幾丁質(zhì)酶 mRNA的表達(dá)會受到蛻皮激素的調(diào)節(jié)，這與本文中 Chitinase活力與MH濃度變化趨勢相一致。而生長蛻皮和生殖蛻皮過程中，Chitinase活力和MH濃度變化卻不相同，在生殖蛻皮前期驟降可能與性腺發(fā)育有關(guān)，這與羅榮生等(1990)的研究結(jié)果相似，該研究認(rèn)為中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)摘除雙側(cè)眼柄后，血淋巴中20-羥蛻皮酮含量逐漸增高，在第10天后迅速下降，下降可能與性腺發(fā)育有關(guān)。綜上所述，從非特異性免疫、蛻皮相關(guān)酶和蛻皮激素3項(xiàng)指標(biāo)的變化結(jié)果可知，生長蛻皮和生殖蛻皮因?yàn)槁殉驳陌l(fā)育而存在明顯不同。卵巢發(fā)育會導(dǎo)致蛻皮過程中機(jī)體免疫力顯著升高，而使蛻皮相關(guān)酶和激素水平顯著降低。

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