血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞體外分離純化方法的優(yōu)化

稂翠玲 孫斌 雷紅召 馬玉春 董長憲

[摘要]目的：尋找更高效的嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，為嬰幼兒血管瘤的研究提供基礎(chǔ)的科研保證。方法：選取增生期嬰幼兒血管瘤手術(shù)標(biāo)本，采用組織塊貼壁法與酶消化法結(jié)合進(jìn)行原代培養(yǎng)；二代細(xì)胞進(jìn)行流式分選，取CD31陽性的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。分別進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞表面標(biāo)記物免疫熒光鑒定、細(xì)胞表面標(biāo)記物流式鑒定。結(jié)果：培養(yǎng)48～72h清晰可見組織塊周圍細(xì)胞游出，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞呈長梭形及多邊形，2周左右部分可形成“血管腔樣”結(jié)構(gòu)，20d可鋪滿平傳代；細(xì)胞流式測定CD31陽性率達(dá)98.4%，VWF與CD31雙陽率90.3%，免疫熒光染色CD31、VWF均呈陽性表達(dá)。結(jié)論：組織塊與消化結(jié)合法經(jīng)流式分選后可獲得高純度的內(nèi)皮細(xì)胞，為下一步研究嬰幼兒血管瘤增生消退機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]嬰幼兒血管瘤；細(xì)胞培養(yǎng)；流式分選；組織塊與酶消化法；血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]R732.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2018）04-0061-03

Flow Separation was Combined with Tissue Block and Digestion to Train the Endothelial Cells of Hemangioma

LANG Cui-ling， SUN Bin， LEI Hong-zhao， MA Yu-chun， DONG Chang-xian

（Department of Hemangioma Surgery，Henan University Henan Provincial People's Hospital，Zhengzhou 450003，Henan，China）

Abstract： Objective To explore the endothelial cell culture method of more efficient infant hemangioma ，to provide the basic research guarantee for the research of hemangioma of infants. Methods In order to select the surgical specimens of the hemangioma of the hyperplasia， the primary culture was carried out by means of Tissue block adherent and enzyme digestion. Two generations of cells were selected for flow separation， and CD31 positive cells continued to be cultured.It were respectively carried out to observe the cell of morphology， immunofluorescence identification of cell surface marker， of fluid identification of cell surface marker. Results The cells in the tissue block around the tissue block could be clearly visible from 48-72 hours. The nuclei were clear， the cells were long fusiform and polygons， and the portion could form "blood vessel cavity" structure in about 2 weeks. The positive rate of CD31 was 98.4%， the VWF and CD31 were 90.3%， and the immunofluorescence staining CD31 and VWF were positive. Conclusion The high purity endothelial cells can be obtained after the flow separation of the means of tissue block and digestive association， which lays the foundation for the next study on the mechanism of proliferation and regression of hemangioma of infants.

Key words： infant hemangioma； cell culture ； flow separation；tissue block and enzyme digestion method； hemangioma endothelial cells

嬰幼兒血管瘤（Infantile hemangioma）是來源于內(nèi)皮細(xì)胞的先天性良性腫瘤，好發(fā)于面頸部（60%）[1-2]，可造成皮膚色素沉著，瘢痕甚至畸形等，但其病因和發(fā)病機(jī)制目前并不清楚[3-4]，組織病理學(xué)證實(shí)血管瘤增生期可發(fā)現(xiàn)大量微血管內(nèi)皮細(xì)胞增生[5-6]。嬰幼兒血管瘤研究的標(biāo)本大多數(shù)來源于病理組織，若進(jìn)行分子生物學(xué)水平研究，則純度不足。因此，要從細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究血管瘤的發(fā)病機(jī)制、提純目的細(xì)胞，嬰幼兒血管瘤體外細(xì)胞培養(yǎng)是關(guān)鍵一步。本次實(shí)驗(yàn)采用組織塊貼壁法與酶消化法結(jié)合，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選培養(yǎng)原代內(nèi)皮細(xì)胞取得了較理想的結(jié)果，現(xiàn)將該方法報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本：3～6個(gè)月齡增生期嬰幼兒血管瘤手術(shù)標(biāo)本（由筆者醫(yī)院提供），經(jīng)臨床及病理科醫(yī)生確診，倫理審查通過，已簽知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材：手術(shù)刀、眼科剪、24孔板、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、離心機(jī)（湘儀 L1500）、超凈臺(tái)（美國）、倒置相差顯微鏡（日本）、5%CO2培養(yǎng)箱（美國）、水浴鍋（金壇市華峰）、熒光顯微鏡（日本）、流式分選儀（Beckman Coulter Moflo- 美國）、流式檢測儀（BD美國）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑：EGM-2培養(yǎng)基（美國）、胎牛血清（Hyclone，美國）、0.25%胰蛋白酶（Sigma，美國）、PBS液（索萊寶，國產(chǎn)）、兔抗人VWF單抗（Abcam，英國）、鼠抗人CD31單抗（Biolegend，美國）、DAPI（索萊寶，國產(chǎn)）、封片膠（美國）、破膜劑（翊圣，上海）、10%山羊血清（索萊寶，國產(chǎn)）、4%多聚甲醛、甲醇等。

1.4 方法

1.4.1 原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)：將手術(shù)取出的新鮮標(biāo)本放入含雙抗的PBS液的離心管內(nèi)，立即送到細(xì)胞室的超凈臺(tái)，用含雙抗的PBS液沖洗3～5遍，液體直至肉眼觀澄清液體為止；用手術(shù)刀切成約為3mm3大小的組織塊，用PBS液洗2～3遍，然后用0.25%胰蛋白酶在37℃水浴鍋振蕩消化15～20min；眼科剪剪約為1mm3大小組織塊放入培養(yǎng)瓶，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱4～6h后加入1.5ml含10%的FBS的EGM-2培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，24h補(bǔ)加培養(yǎng)基。以后每隔1～2d換一次液。

1.4.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：每日在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.4.3 流式細(xì)胞分選：取二代內(nèi)皮細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，PBS洗一遍后CD31單抗（1︰200）室溫孵育40～60min，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)（1×107/ml），用70μm的細(xì)胞過濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，移入流式管中，避光置冰上送分選室，進(jìn)行分選，留取CD31陽性的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4.4 細(xì)胞生長觀察：取分選CD31陽性的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行消化，消化完成后，加入含20%胎牛血清培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打漩渦混勻后制成細(xì)胞懸液，制成單細(xì)胞懸液（1×105個(gè)/ml），接種于24孔板中，500μl/孔，再于每孔中加入1ml完全內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液，輕輕搖晃24孔板使細(xì)胞分散均勻，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每隔1天隨機(jī)選擇3孔消化吹打并計(jì)數(shù)，取3孔平均值，以時(shí)間（d）為橫軸，細(xì)胞數(shù)（1×104個(gè)/ml）為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4.5 免疫熒光鑒定：將分選后培養(yǎng)（三代）的內(nèi)皮細(xì)胞接種于放有細(xì)胞爬片的6孔培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)待細(xì)胞長至80%后取出細(xì)胞爬片，PBS液清洗2～3次，4%的多聚甲醛固定10min；PBS液洗3次/3min；1.5% H2O2 37℃孵育15min；10%山羊血清室溫，封閉30min；加入CD31單抗（1∶200）、VWF單抗（1∶500）避光，4℃過夜；PBS洗2～3遍/次，加入10%DAPI染細(xì)胞核；PBS液清洗后封片，免疫熒光顯微鏡觀察，拍照。

1.4.6 流式細(xì)胞儀鑒定：將分選后培養(yǎng)（三代）的內(nèi)皮細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，PBS液洗1～2遍/1min，1 000r/min離心10min，棄上清；計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)（5×105/ml）；加入CD31單抗（1∶100），室溫孵育30min；80%甲醇4℃固定5min；1 000r/min離心10min，棄上清；PBS液洗2～3遍/1min，1 000r/min離心10min，棄上清；加入1.5ml破膜劑，室溫，15min，1 000r/min離心10min，棄上清；10%山羊血清室溫封閉30min后，VWF單抗（1∶300），1 000r/min離心10min，PBS液500μl重懸細(xì)胞，送至流式細(xì)胞鑒定。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：培養(yǎng)48～72h組織塊周圍可見游離出細(xì)胞（見圖1A），呈梭形、多邊形，細(xì)胞核清晰；72h后去除組織，2周左右可見部分形成“血管腔樣”結(jié)構(gòu)（見圖1B），20d左右瓶底鋪滿80%以上傳代（見圖1C）。

注：A.嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞從組織塊爬出（3d）；B.嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞部分有形成“血管腔樣結(jié)構(gòu)”（14d）；C.原代嬰幼兒血管瘤（2代）

圖1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察圖（40×）

2.2 流式細(xì)胞分選：可見明顯CD31陽性峰（見圖2）。

圖2 CD31 陽性分選

2.3 細(xì)胞生長曲線圖：分選后細(xì)胞24h內(nèi)無明顯生長，48h開始增殖（3.58±0.1）×104個(gè)/孔，4～9d細(xì)胞分裂增殖加速（13.97±0.4）×104個(gè)/ 孔，逐漸進(jìn)入對數(shù)生長期，10d以后進(jìn)入平臺(tái)期（16.75±0.05）×104個(gè)/孔，細(xì)胞計(jì)數(shù)無明顯增加，此時(shí)，細(xì)胞生長穩(wěn)定（見圖3）。隔天在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并記錄細(xì)胞數(shù)目，以時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)目為縱軸，繪制生長曲線。

圖3 細(xì)胞生長曲線

2.4 免疫熒光鑒定：VWF可見陽性呈綠色熒光細(xì)胞（見圖4A）；CD31陽性表達(dá)呈紅色表達(dá)（見圖4B）；VWF/CD31雙陽為黃綠色，藍(lán)色為細(xì)胞核（見圖4C）。

注：A.VWF陽性表達(dá)；B.CD31陽性表達(dá)；C.VWF/CD31陽性表達(dá)

圖4 免疫熒光鑒定圖（100×）

2.5 流式細(xì)胞鑒定：CD31單陽性率達(dá)98.4%，CD31、VWF雙陽性率90.3%見（見圖5）。

注：A.空白（Q3陰性對照）；B.Q1為CD31陽性表達(dá)；C.Q2為CD31/VWF共表達(dá)；D.P2為CD31陰性區(qū)；E.P3為CD31陽性區(qū)

圖5 流式細(xì)胞鑒定圖

3 討論

目前，對嬰幼兒血管瘤的增殖和消退的確切機(jī)制尚不清楚[7-9]，組織病理學(xué)證實(shí)血管瘤是以血管內(nèi)皮細(xì)胞增生為主與成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞構(gòu)成的良性腫瘤。從細(xì)胞水平、生物分子水平研究嬰幼兒血管瘤的發(fā)病機(jī)制，需要有高效的方法分離獲得高純度的內(nèi)皮細(xì)胞。本次實(shí)驗(yàn)采用的組織法與消化結(jié)合法，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選再培養(yǎng)可得到較高純度的內(nèi)皮細(xì)胞，有效去除組織中雜細(xì)胞，并通過細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞表面標(biāo)記物免疫熒光鑒定，細(xì)胞表面標(biāo)記物流式細(xì)胞鑒定為血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞。

培養(yǎng)原代細(xì)胞方法主要有消化法和組織塊法[10-11]，消化法容易獲得細(xì)胞但是血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞和雜細(xì)胞混合在一起不宜純化；組織塊法可得到純度高的細(xì)胞易于純化，但是得到細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞游出時(shí)間長，采用消化法和組織塊法結(jié)合可取得較好的效果[12]。然而，在血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)過程中最關(guān)鍵的就是去除雜細(xì)胞對細(xì)胞進(jìn)行分離、純化。常用的分離純化的方法有磁珠分選法[13-14]、流式分選法、酶消化法、機(jī)械刮除法[15]、差速貼壁法[16]等，機(jī)械刮除法和相差速貼壁法因過程較復(fù)雜目前較少用。流式細(xì)胞分選可得到較高純度的細(xì)胞而且用時(shí)較短，可用三個(gè)字形容“快、精、準(zhǔn)”，操作便捷、流程少、減少污染幾率。流式分選與磁珠分選相比純度及精確度更高。故本次研究采取消化法與組織塊法結(jié)合，流式分選后經(jīng)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物CD31鑒定純度可達(dá)98.4%，CD31與VWF雙陽率達(dá)90.3%。

流式分選使用時(shí)應(yīng)注意幾點(diǎn)要求：細(xì)胞的數(shù)量不低于1×106個(gè)/ml、抗體孵育時(shí)間30～60min、抗體要與細(xì)胞數(shù)量有一定的比例。但是由于代價(jià)較高、分選環(huán)境（相對無菌間）較高、細(xì)胞數(shù)量較多，故多在做分子、基因等對細(xì)胞純度和數(shù)量有較高要求時(shí)，才選用此方法。然而，目前國內(nèi)外對血管瘤的研究早已不再局限于細(xì)胞水平，已逐步拓展至分子、基因的層次。因此，傳統(tǒng)的組織塊法、消化法、組織塊與消化法結(jié)合培養(yǎng)方法已不能滿足研究需要，傳統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法與流式分選技術(shù)的結(jié)合，勢在必行。

總之，本研究提供的嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞來源，使大家不僅能從細(xì)胞水平上研究嬰幼兒血管瘤發(fā)病機(jī)制，而且在基因分子水平上進(jìn)一步研究。另外聯(lián)合組織塊法、消化結(jié)合法和流式細(xì)胞分選技術(shù)進(jìn)行原代血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞體外分離和純化，操作過程簡單、易行，可得到較高純度的細(xì)胞，對下一步研究血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特性十分有利。

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