斜生柵藻對不同形態(tài)銻脅迫的響應(yīng)及抗性研究

陳蔚潔，楊愛江,2,3*，胡 霞,2，李 聰，王 麗

(1 貴州大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，貴陽 550025；2 貴州大學(xué) 環(huán)境工程規(guī)劃設(shè)計研究所，貴陽 550025；3 貴州大學(xué) 科技園發(fā)展有限公司，貴陽 550025)

銻(Sb)是一種非生命必需的元素[1]，過去數(shù)十年被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)半導(dǎo)體、制造PET(聚對苯二甲酸乙二酯)的催化劑、剎車片、彈藥、阻燃劑、醫(yī)藥等行業(yè)，有著巨大的市場需求[2]。而中國是世界上主要的產(chǎn)Sb國，約占世界Sb產(chǎn)量的87%[2]。Sb因為其致癌性等各種危害而被歐盟巴塞爾公約列入危險廢物[3]。隨著Sb在各行各業(yè)的大量使用以及Sb礦的大規(guī)模開采，大量Sb進入到大氣、地表水、地下水和土壤中，嚴重威脅環(huán)境安全[4]。朱靜等研究發(fā)現(xiàn)湖南錫礦山(世界銻都)礦區(qū)的溪流中銻濃度為37～241 μmol/L，遠高于中國地表水標準中Sb的含量[5]。伴隨環(huán)境生物學(xué)的發(fā)展，重金屬形態(tài)對各類生物生理生態(tài)效應(yīng)已成為生態(tài)毒理學(xué)的研究熱點。自然環(huán)境中銻表現(xiàn)多種價態(tài)，但主要為三價化合物[Sb(Ⅲ)]和五價化合物[Sb(Ⅴ)]存在，Sb的毒性與其形態(tài)密切相關(guān)，與無機銻相比有機銻的毒性相對較弱，其Sb(Ⅲ)的毒性是Sb(Ⅴ)的10倍以上[1]。

藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者，對水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定有著重要的作用。因其對有毒物質(zhì)較敏感、易獲得、個體小、易繁殖等一系列的優(yōu)點，常作為水體污染的測試材料[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，藻類在重金屬離子脅迫下會對其細胞的分裂、光合放氧和細胞膜透性等產(chǎn)生影響[7]。Maeda 等報道，藻類對高濃度Sb具有生物積累作用[8]，普通小球藻(Chlorellavulgaris)積累的Sb濃度為12 mg·g-1，其生長狀況在高濃度Sb脅迫下并沒有受到明顯影響，這可能是因為普通小球藻有其獨特的解毒機制，即通過將吸收的Sb(Ⅲ)轉(zhuǎn)化為毒性更低的Sb(Ⅴ)，進而保護自身細胞安全[9]。光合作用是綠色植物最重要的生命活動[10]，高濃度的重金屬脅迫會對微藻的光合作用產(chǎn)生影響，造成藻類細胞結(jié)構(gòu)的變化、葉綠體破壞、線粒體損傷，影響植物的光合作用，從而抑制藻細胞生長[11]。Sb對藍藻(Synechocystissp.)的毒性效應(yīng)主要體現(xiàn)在對光合系統(tǒng)的影響上，對光合放氧和光系統(tǒng)中電子傳遞和能量轉(zhuǎn)移等過程產(chǎn)生抑制[12]。斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)也因其易培養(yǎng)且對毒物反應(yīng)敏感等特點常被選作水質(zhì)評價的指示生物[13-14]，本研究主要考察不同濃度Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫下斜生柵藻(自養(yǎng)條件)細胞生長、光合色素含量以及抗氧化酶系統(tǒng)活力等生理方面的變化情況，以便為重金屬脅迫下微藻抗性機理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗主要儀器包括智能人工氣候箱(RXZ-500D型，上海圣科設(shè)備有限公司)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDX-50FBS，上海申安醫(yī)療器械廠)、紫外可見光分光光度計(1800PC，上海美普達)、場發(fā)射掃描電鏡(SIGMA500，德國卡爾蔡司公司)等。本試驗中Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)分別選用酒石酸銻鉀和焦銻酸鉀，均為市售分析純，分別用去離子水配制成終濃度為0、100、200、400、800 μmol/L的銻溶液母液待用；丙二醛(MDA)含量、總超氧化物歧化酶(SOD)活性和過氧化氫酶(CAT)活性測定試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。實驗所用斜生柵藻來自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(FACHB-12)，用BG-11培養(yǎng)基對柵藻擴大培養(yǎng)[16]，選用對數(shù)生長期的藻細胞作為實驗材料。

1.2 材料培養(yǎng)與處理

1.2.1藻種培養(yǎng)首先對柵藻進行擴大培養(yǎng)，再將對數(shù)期的藻接入到500 mL的無菌三角瓶中，并加入不同濃度的Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)溶液，使最終藻液體積為200 mL，后用無菌膜對三角瓶進行封口，放置于人工氣候箱中。氣候箱培養(yǎng)溫度設(shè)置為(25±1)℃，光照強度為2 000 lx，靜置培養(yǎng)。為防止柵藻附著在燒瓶的內(nèi)壁，每6 h搖動1次。

1.2.2實驗處理按照1.2.1所設(shè)定的培養(yǎng)條件培養(yǎng)斜生柵藻，Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ) 各分別設(shè)置5個處理濃度水平，分別為0、100、200、400、800 μmol/L(預(yù)實驗顯示斜生柵藻對此濃度范圍脅迫響應(yīng)的差異較為明顯)，每個濃度水平設(shè)置3個平行重復(fù)。共計培養(yǎng)8 d，期間每天取樣用于測定不同價態(tài)銻脅迫下斜生柵藻的生物量、葉綠素a含量的動態(tài)變化情況。同時，以BG-11培養(yǎng)基作為對照組(CK)，以800 μmol/L Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)溶液脅迫處理作為實驗組，共計培養(yǎng)8 d，每天取樣用于分析丙二醛(MDA)含量及抗氧化酶活性變化情況。

1.3 測定指標及方法

1.3.1生物量藻細胞密度和665 nm處吸光度具有很好的線性關(guān)系。因此，每隔24 h取樣1次，測定665 nm處光密度(OD665)，其生長狀況(生物量)以分光光度計測定的光密度值表示(OD665)[21]。

1.3.2葉綠素a含量取培養(yǎng)8 d后1 mL藻液6 000 r/min離心10 min，用95%乙醇重懸浮提取葉綠素，以95%的乙醇為參比，測定上清液在665 nm與649 nm處的吸光度值(A665和A649)。然后，根據(jù)以下公式計算葉綠素a含量：

葉綠素a含量(μg/mL)=13.7A665-5.76A649

1.3.3藻液丙二醛(MDA)和抗氧化酶活性取經(jīng)過800 μmol/L Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)溶液脅迫處理8 d后的藻液10 mL，6 000 r/min離心10 min，去掉上層清液，剩余藻泥，在冰浴條件下研磨，用蛋白提取液并在冰浴中提取2 h，制備成酶提取液(50 mmol·L-1磷酸緩沖液)。分別用南京建成生物工程研究所開發(fā)的丙二醛(MDA)含量測定試劑盒，以及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性測定試劑盒測定各相應(yīng)成分的含量和活性。

1.3.4Sb脅迫后柵藻微觀形貌變化情況取經(jīng)過100、200、400、800 μmol/L Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)溶液脅迫處理8 d后的藻液，6 000 r/min離心10 min，去掉上層清液，剩余藻泥放置冰箱冷凍后，再經(jīng)冷凍干燥機脫水24 h后，收集藻粉。在2.5%戊二醛中固定2 h，用新鮮配制的0.1 mol/L PBS緩沖液沖洗3次，最后用系列乙醇(脫水劑的乙醇濃度依次為 30%～50%～70%～80%～90%～100%)兩次脫水,醋酸異戊酯置換后，CO2臨界點干燥，取正常清洗干燥后的柵藻，用導(dǎo)電膠粘于樣品臺上，噴金，用場發(fā)射掃描電子顯微鏡進行表面觀測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計制圖采用Origin7.5軟件完成，對葉綠素a含量和抗氧化系統(tǒng)酶活性結(jié)果采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行方差分析和組間差異顯著性檢驗。P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著差異。

斜生柵藻的生長抑制率(I)=(1-N/N0)×100；N0為對照組的吸光度，N為實驗組的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫對斜生柵藻生長的影響

Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫處理斜生柵藻生物量隨著處理時間整體呈上升趨勢(圖1)。其中， 在低濃度(100 μmol/L)的Sb(Ⅲ)脅迫下，斜生柵藻生物量在脅迫初期(1～3 d)受到一定的刺激作用，與對照組均表現(xiàn)出逐漸增加的生長趨勢，而在隨后的脅迫時間內(nèi)表現(xiàn)出明顯抑制；柵藻的生長在200、400和800 μmol/L Sb(Ⅲ)脅迫處理初期就受到極顯著抑制(P<0.01)，且隨著脅迫時間的增加抑制作用表現(xiàn)得更為明顯，三者生物量在脅迫第8天時分別為對照組的64.58%、62.25%、57.0%(圖1，A)。同時，在Sb(Ⅴ)脅迫處理中，100、200和400 μmol/L濃度處理在實驗初期(1～3 d)對柵藻生長產(chǎn)生了一定促進作用，而在隨后的脅迫時間內(nèi)均表現(xiàn)出明顯抑制作用；而800 μmol/L Sb(Ⅴ)濃度處理在實驗期間(1～8 d) 對柵藻生長整體表現(xiàn)強烈抑制作用(P<0.01)，其柵藻生物量在實驗第8天時僅為對照組的51.34%(圖1，B)。可見，斜生柵藻生長在低濃度Sb(Ⅲ)和中低濃度Sb(Ⅴ) 短期處理下得到促進，而在高濃度Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ) 長時間脅迫下受到顯著抑制，且Sb(Ⅲ)的抑制效應(yīng)明顯強于Sb(Ⅴ)。

圖1 不同濃度Sb(Ⅲ)(A)和Sb(Ⅴ)(B)處理下斜生柵藻生長情況Fig.1 The growth of Scenedesmus obliquus under different concentrations of Sb(Ⅲ) (A) and Sb(Ⅴ) (B)

2.2 Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫對斜生柵藻葉綠素a含量的影響

斜生柵藻葉綠素a含量在100、200、400和800 μmol/L的Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)脅迫8 d后變化情況如圖2所示。其中，柵藻葉綠素a含量在低濃度時(100 μmol/L) Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫下比對照組(0 μmol/L)略有增加；但在 200、400和800 μmol/L濃度 Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫下，其葉綠素a含量均比對照組明顯降低，且脅迫濃度越高降低幅度越大。尤其當(dāng)Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)脅迫濃度為800 μmol/L時，柵藻細胞葉綠素a含量均顯著低于對照組，分別為對照組的73.53%和91.37%(P<0.01)。以上結(jié)果說明中高濃度的Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫均明顯降低了斜生柵藻葉綠素a含量，且濃度越高降幅越大，Sb(Ⅲ)降幅又大于Sb(Ⅴ)。

2.3 Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫對斜生柵藻丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響

首先，斜生柵藻丙二醛(MDA)含量隨著800 μmol/L Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫時間的延長而呈升高的趨勢，并不同程度地高于同期對照組，且脅迫時間越長增幅越大 (圖3,A)。其中，Sb(Ⅲ)脅迫處理柵藻MDA含量隨脅迫時間增加而逐漸升高，從脅迫起始時的1.125 4 nmol·mg-1升高至第8天的(2.220 4±0.065) nmol·mg-1；與此同時，Sb(Ⅴ)脅迫處理組MDA含量隨脅迫時間表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢，并在第6天時達到最大值 (1.987 4±0.021) nmol·mg-1，然后出現(xiàn)下降趨勢，在第8天時MDA含量為(1.896 8±0.045)nmol·mg-1，但此時仍顯著高于同期對照組(P<0.01)。Sb(Ⅲ)脅迫處理柵藻MDA含量除脅迫處理第3、4天外均不同程度高于Sb(Ⅴ)脅迫組，尤其是脅迫后期表現(xiàn)得更明顯(P<0.01)。

*和**分別表示處理與對照組間在0.05和0.01水平存在顯著差異；下同圖2 Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫下斜生柵藻葉綠素a含量的變化* and ** indicate significant difference between treatment and control at 0.05 and 0.01 level, respectively; The same as belowFig.2 The chlorophyll a content of S. obliquus under different concentrations of Sb (Ⅲ) and Sb(Ⅴ)

圖3 Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫下斜生柵藻丙二醛含量及抗氧化酶活變化Fig.3 MDA content and antioxidant activities of S. obliquus under Sb(Ⅲ) and Sb(Ⅴ) stress

其次，Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫處理組斜生柵藻超氧化物歧化酶(SOD)活性隨脅迫時間的增加均表現(xiàn)出逐漸上升趨勢，并不同程度地高于同期對照，且處理時間越長差異越大(圖3，B)。其中，對照組柵藻SOD活性先從培養(yǎng)初期的5.324 0 U·mg-1快速上升到第4天的(6.485 4±0.19) U·mg-1，隨后呈現(xiàn)緩慢上升趨勢并趨于平穩(wěn)，第8天達到 (6.407 2±0.23) U·mg-1；Sb(Ⅲ)脅迫組SOD活性在第1～5天呈緩慢上升趨勢，在第7、8天迅速升高，第8天達到最大值(9.033 3±0.086 U·mg-1)； Sb(Ⅴ)脅迫組SOD活性也隨脅迫時間增加而升高，并在第1～5天增加較緩慢，而在第6～8天增加迅速，第8天時達到最大值(8.507 8±0.093 U·mg-1)。

圖4 Sb(Ⅲ)(左)和Sb(Ⅴ) (右)脅迫8 d后斜生柵藻結(jié)構(gòu)變化Fig.4 The superficial structure of S. obliquus stressed with different concentrations of Sb(Ⅲ) (left)and Sb(Ⅴ) (right) after 8 days

再次，隨著脅迫時間的延長，Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫處理柵藻CAT活性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，并均在處理第5天達到最大值，而對照組基本在初始值附件上下波動，且處理組大多數(shù)時間顯著高于同期對照(圖3,C)。其中，Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫處理柵藻CAT活性在第5天時分別為(1.351 7±0.062)和 (1.339 8±0.062)U·mg-1，分別是同期對照組的2.34倍和2.33倍 (P<0.01)，它們在第8天時分別是對照組的2.23倍和1.68倍(P<0.01)。

2.4 Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫對斜生柵藻表面結(jié)構(gòu)的影響

柵藻表面結(jié)構(gòu)在100、200、400和800 μmol/L的Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)脅迫下的表現(xiàn)如圖4所示。在濃度為100 μmol/L的Sb(Ⅲ)脅迫下，能觀察到少量完整的柵藻細胞個體，其他藻體細胞周邊出現(xiàn)出大量的絮狀物，且隨著Sb(Ⅲ)濃度的增加?xùn)旁寮毎砻嫘鯛钗锊粩嘣龆啵辉?00 μmol/L Sb(Ⅲ)脅迫條件下，能清晰觀觀察到柵藻類細胞破損的情況；當(dāng)Sb(Ⅲ)濃度為800 μmol/L時，柵藻細胞出現(xiàn)大面積破損，在其表面附著大量絮狀物。同時，在100 μmol/L的Sb(Ⅴ)脅迫下，能清晰觀察到柵藻個體細胞及周邊的鞭毛，生長良好，與同濃度Sb(Ⅲ)脅迫處理的柵藻表面結(jié)構(gòu)相比，柵藻細胞數(shù)量更多、結(jié)構(gòu)更加完整；隨著Sb(Ⅴ)濃度的增加，柵藻細胞出現(xiàn)溶解破裂的情況?？梢?，Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)不僅對柵藻細胞酶活性影響而且對其細胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生嚴重的破壞。

3 討 論

自然環(huán)境中銻表現(xiàn)多種價態(tài)，但主要為Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)存在[17]，其價態(tài)與生物毒性關(guān)系密切[18]。本研究發(fā)現(xiàn)， Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)對斜生柵藻生長的影響表現(xiàn)在生物量、葉綠素a含量和表面結(jié)構(gòu)多個方面。首先，斜生柵藻生物量在Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)脅迫下均表現(xiàn)出在低濃度促進、高濃度抑制的Hormesis效應(yīng)[19]。相同濃度條件下，柵藻對Sb(Ⅲ)的脅迫響應(yīng)更加敏感，且隨著濃度的增加這一現(xiàn)象更加明顯，生物量呈現(xiàn)明顯下降趨勢。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要原因是由于Sb(Ⅲ) 毒性高于Sb(Ⅴ)[20]。李妍麗[21]、樊香絨等[22]對As(與Sb同一主族)毒性研究過程中也有相似的發(fā)現(xiàn)。其次，本研究中斜生柵藻葉綠素a含量在低濃度的Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫下比對照組略有增加，由于低濃度Sb促進柵藻細胞的生長，從而使得藻柵藻細胞生物量增加，葉綠素a含量隨之升高[23]。由于高濃度的Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)破壞了藻類細胞的葉綠體[24]，其次抑制柵藻生長，葉綠素a含量隨之降低。同時還由于Sb(Ⅲ)毒性更強，從而表現(xiàn)出Sb(Ⅲ)對葉綠素a的影響大于Sb(Ⅴ)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)高濃度Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)脅迫不僅會對柵藻膜的通透性產(chǎn)生嚴重的損害，還造成細胞內(nèi)大量的無機鹽和有機物外滲，表現(xiàn)為細胞表面有大量絮狀物產(chǎn)生，一些細胞出現(xiàn)粘連現(xiàn)象。這主要是由于在Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)脅迫下柵藻細胞破裂后產(chǎn)生的碎片等與細胞粘結(jié)在一起所致[30]。但在相同的濃度下，Sb(Ⅲ)對柵藻細胞的破壞明顯大于Sb(Ⅴ)，從微觀層面佐證了Karadjova的結(jié)論[1]。

MDA為膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，可以作為重金屬脅迫下藻類氧化壓力指標[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組藻類細胞由于生長環(huán)境改變，MDA含量略有增加，但隨時間增加?xùn)旁逯饾u適應(yīng)外部環(huán)境而MDA含量趨于平穩(wěn)。實驗組中Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫斜生柵藻MDA含量隨著脅迫時間增加而上升，表明藻細胞隨著Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)脅迫時間的增加細胞中活性氧化自由基逐漸升高，柵藻細胞受到不同程度的損傷。在Sb(Ⅲ)脅迫第8 d和Sb(Ⅴ)脅迫第6 d，斜生柵藻MDA含量均極顯著高于對照組。由于Sb(Ⅲ)比Sb(Ⅴ)有更強的毒性[1]，柵藻對Sb(Ⅲ)脅迫響應(yīng)更加明顯，而這種不利影響隨脅迫時間的增加而加強，并在第8天表現(xiàn)得尤為明顯。同時，柵藻在Sb(Ⅲ)、Sb(Ⅴ)脅迫下會啟動自身的清除活性氧的抗氧化防御系統(tǒng)[28]，產(chǎn)生抗氧化酶(SOD、CAT)，以維持柵藻細胞體內(nèi)活性氧代謝的相對穩(wěn)定。SOD對抵抗重金屬脅迫下柵藻產(chǎn)生的氧化自由基和維持柵藻體內(nèi)的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用[29]。在Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)實驗組中，柵藻體內(nèi)SOD活性在脅迫處理第5～6天迅速增強，表示氧化自由基不斷增加[28]，在實驗后期(第7～8天)，由于抗氧化體系抗氧化酶不能及時清除過量的氧自由基，SOD活性出現(xiàn)下降的趨勢。CAT是生物體防護機制的中心酶，所有的脅迫都會誘導(dǎo)CAT活性增加。在本研究中Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)脅迫處理柵藻CAT活性分別在第4、5 d顯著提高，明顯高于對照組，表明柵藻為應(yīng)對氧化壓力快速作出抗性反應(yīng)。但在高濃度和長時間的重金屬脅迫下藻類細胞的抗性逐漸減弱直到柵藻細胞死亡，這與劉璐、鄶安琪等研究銅綠微囊藻對鎘脅迫響應(yīng)的結(jié)果相一致[30-31]。

綜上所述，本實驗中，低濃度、短時間Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)處理對斜生柵藻的生物量、葉綠素a含量有促進作用；但隨著脅迫的濃度和時間不斷的增加， Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)對柵藻的生物量和葉綠素a含量產(chǎn)生抑制作用，且其細胞結(jié)構(gòu)破損也隨著濃度的不斷增加而更加嚴重；斜生柵藻在不利的生長環(huán)境中，其自身會啟動清除活性氧的抗氧化防御系統(tǒng)，誘導(dǎo)增強自身抗氧化酶(SOD、CAT)活性，以維持柵藻細胞體內(nèi)活性氧代謝的相對穩(wěn)定。但是，由于斜生柵藻對Sb(Ⅲ) 和 Sb(Ⅴ)脅迫下的抗性過程十分復(fù)雜，所以今后將在植物分子蛋白和遺傳基因等方面探討其抗性機理，為深入研究重金屬脅迫下微藻的抗性機理奠定基礎(chǔ)。

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