益生菌發(fā)酵胡蘿卜汁活性成分與抗氧化活性研究

陳永芳，胡榮康，2，吳林秀，2，巫夢(mèng)婷，鐘思敏，劉 斌，2*

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；

2.國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002）

胡蘿卜是傘形科胡蘿卜屬的一年生或兩年生的草本植物，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。其含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、胡蘿卜素、β-類胡蘿卜素和維生素C，其中維生素的含量達(dá)1%。但是由于胡蘿卜自身的異味以及貯藏過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生辛辣味的口感，并不能被大眾所接受[2]。乳酸菌發(fā)酵在過(guò)去的幾十年里因其提高原料的營(yíng)養(yǎng)、生理和風(fēng)味等特性而受到越來(lái)越多的關(guān)注[3]。

已有報(bào)道指出[4]，乳酸菌在果蔬發(fā)酵過(guò)程中對(duì)營(yíng)養(yǎng)功能成分能夠產(chǎn)生有益影響，其中包括酚類物質(zhì)、有機(jī)酸和游離氨基酸等。SEELAM D N S等[5]用天然分離的球形芽孢桿菌發(fā)酵胡蘿卜汁，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中的總酚和抗氧化性都要高于未發(fā)酵組，并且菌株存活率達(dá)到7.8×107CFU/mL，表現(xiàn)出良好的感官品質(zhì)和豐富的營(yíng)養(yǎng)成分。徐萌萌[6]從發(fā)酵胡蘿卜汁中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了16種游離氨基酸，并且含有6種必需氨基酸，游離氨基酸總含量達(dá)到8.836 mmol/kg。王俊華等[7]研究發(fā)酵前后胡蘿卜汁中的有機(jī)酸含量變化發(fā)現(xiàn)，乳酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸含量增加，推斷其可能是乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中的主要代謝物。胡蘿卜富含豐富的β-類胡蘿卜素和維生素C因而具有較強(qiáng)的抗氧化性，不僅如此，研究發(fā)現(xiàn)乳酸發(fā)酵能夠防止抗壞血酸的降解，同時(shí)能夠維持總抗氧化能力[8]。

本研究利用鼠李糖乳桿菌對(duì)胡蘿卜汁進(jìn)行發(fā)酵，比較發(fā)酵前后酚類物質(zhì)含量、有機(jī)酸、游離氨基酸、抗氧化活性的變化情況，以期為發(fā)酵胡蘿卜汁的深度開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCC編號(hào)1.3724。

1.1.2 藥品及試劑

沒食子酸、兒茶素、綠原酸、槲皮素、山奈酚、乙酸、丙酸、丁酸、草酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海麥克林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海源葉生物有限公司；其余試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Eyelan-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：東京理化器械株式會(huì)社；Agilent 1260高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國(guó)Agilent公司；DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀：日本HITACHI公司；Uvmini-1240紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；MK3酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 制備發(fā)酵胡蘿卜汁

新鮮制備的胡蘿卜汁，使用NaHCO3調(diào)節(jié)pH至6.5，在80℃條件下殺菌20 min，所得果汁冷卻后加入葡萄糖至終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，4℃條件下儲(chǔ)存。

向1 L胡蘿卜汁中接入約106CFU/mL鼠李糖乳桿菌，將接種后的胡蘿卜汁放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置發(fā)酵培養(yǎng)48 h至發(fā)酵果蔬汁中含有約109CFU/mL的鼠李糖乳桿菌，將相同實(shí)驗(yàn)條件下以未接種的胡蘿卜汁作為對(duì)照。

1.3.2 鼠李糖乳桿菌發(fā)酵對(duì)胡蘿卜汁中酚類物質(zhì)影響

參照PAIVA F F等[9]的方法并略有修改，提取發(fā)酵前后游離態(tài)酚類物質(zhì)，HPLC進(jìn)行測(cè)定。向50 mL胡蘿卜汁中加入2倍體積冰預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)80%丙酮，均質(zhì)后離心收集上清液，將上清液旋蒸至無(wú)水狀態(tài)后，用雙蒸水溶解殘余物，定容至10 mL，HPLC測(cè)定含量。

參照FINOCCHIARO F等[10]的方法并略有修改，提取發(fā)酵前后結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)，HPLC進(jìn)行測(cè)定。向50 mL胡蘿卜汁中加入2倍體積冰預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)80%丙酮，均質(zhì)后離心收集沉淀，加入40 mL 4 mol/L NaOH溶液，充入適量氮?dú)夂竺芊庹袷?h，加入6mol/LHCl溶液調(diào)節(jié)pH值至1，抽濾去除殘?jiān)蠹尤?倍體積乙酸乙酯萃取5次，45℃條件下旋蒸至無(wú)水狀態(tài)，用水溶解殘余物，定容至10 mL，HPLC測(cè)定含量。

1.3.3 鼠李糖乳桿菌發(fā)酵對(duì)胡蘿卜汁中有機(jī)酸的影響

稱取0.5 g發(fā)酵前后的樣本液，加入0.5 mL預(yù)冷的乙酸乙酯，移入EP管內(nèi)，超聲提取60 min，離心取上清液，殘?jiān)?.2 mL乙酸乙酯超聲20 min，離心取上清，合并上清，用乙酸乙酯定容至1 mL，混勻，針頭式過(guò)濾器過(guò)濾后HPLC進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 鼠李糖乳桿菌發(fā)酵對(duì)胡蘿卜汁中游離氨基酸的影響

吸取5mL樣本液至水解管中，向水解管內(nèi)加5mL6mol/L HCl混勻后，繼續(xù)加入5 mL 6 mol/L HCl，向水解管內(nèi)滴加3～4滴苯酚。將水解管冷凍3～5min，接到真空泵的抽氣管上，0 Pa抽真空后充入氮?dú)?，重?fù)抽真空，充入氮?dú)?次后將水解管封口。將封口的水解管放在110℃電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)水解22 h，自然冷卻至室溫。

打開水解管，將水解液過(guò)濾至50 mL容量瓶?jī)?nèi)，用少量水多次沖洗水解管，合并水洗液和水解液，用水定容至50 mL，振蕩混勻。吸取1 mL濾液移入至15 mL試管內(nèi)，在45℃條件下減壓干燥，干燥后殘留物用1 mL水溶解，再減壓干燥，最后蒸干。向干燥后的試管內(nèi)加入1 mL pH 2.2的檸檬酸鈉緩沖液，振蕩混勻后過(guò)0.22 μm濾膜，用于氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)。

1.3.5 測(cè)定方法

清除DPPH自由基能力：按照參考文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行測(cè)定。

DPPH自由基的清除率=

式中：Ax為樣品與DPPH反應(yīng)的吸光度值；Ax0為用蒸餾水代替DPPH的吸光度值；A0為蒸餾水代替樣品的吸光度值，重復(fù)3次。

清除羥基自由基能力：按照參考文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行測(cè)定。

羥基自由基清除率=

式中：Ax為樣品的吸光度值；Ax0為用蒸餾水代替H2O2的吸光度值；A0為蒸餾水代替樣品的吸光度值，重復(fù)3次。

總還原力的測(cè)定：按照參考文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵前后胡蘿卜汁中的酚類物質(zhì)的比較

鼠李糖乳桿菌發(fā)酵胡蘿卜汁發(fā)酵前后結(jié)合態(tài)和游離態(tài)的多酚和黃酮含量變化情況見圖1。由圖1可知，鼠李糖乳桿菌發(fā)酵后胡蘿卜汁中的游離態(tài)酚類物質(zhì)含量明顯增加（P＜0.05），而結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)的含量明顯下降（P＜0.05），發(fā)酵后沒食子酸、兒茶素、綠原酸、槲皮素和山奈酚的含量分別為（0.21±0.02）μg/mL、（7.85±0.18）μg/mL、（150.54±6.52）μg/mL、（0.65±0.10）μg/mL和（0.19±0.02）μg/mL，比未發(fā)酵胡蘿卜汁中酚類物質(zhì)含量分別提高了34.17%、14.77%、9.94%、243.91%和49.18%，槲皮素的含量明顯升高。

圖1 鼠李糖乳桿菌發(fā)酵前后胡蘿卜汁中結(jié)合態(tài)和游離態(tài)的多酚和黃酮含量變化Fig.1 Changes of the contents of combined and free polyphenols and flavonoids in carrot juice before and after fermentation withL.rhamnus

2.2 乳酸菌發(fā)酵前后胡蘿卜汁中的有機(jī)酸含量的比較

鼠李糖乳桿菌發(fā)酵胡蘿卜汁發(fā)酵前后有機(jī)酸的含量變化情況見圖2。由圖2可知，鼠李糖乳桿菌發(fā)酵后胡蘿卜汁中的草酸含量沒有明顯變化，發(fā)酵后乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酸和丁酸含量明顯增加（P＜0.05），相較于未發(fā)酵中有機(jī)酸含量分別增加了0.463 mg/mL、5.376 mg/mL、0.256 mg/mL、1.009 mg/mL、0.371 mg/mL、0.218 mg/mL和0.312 mg/mL。

圖2 鼠李糖乳桿菌發(fā)酵前后胡蘿卜汁中有機(jī)酸含量變化Fig.2 Changes of organic acid content in carrot juice before and after the fermentation withL.rhamnus

2.3 益生菌發(fā)酵前后胡蘿卜汁中的游離氨基酸含量的比較

鼠李糖乳桿菌發(fā)酵前后胡蘿卜汁中的游離氨基酸種類及含量的變化情況見表1。由表1可知，發(fā)酵前胡蘿卜汁中共檢測(cè)到17種氨基酸，含量最高的分別是天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸。發(fā)酵后胡蘿卜汁中游離氨基酸與發(fā)酵前相比，蘇氨酸[（0.13±0.004 8）mg/g]、絲氨酸[（0.25±0.006）mg/g]、甘氨酸（（0.34±0.008 4）mg/g]、蛋氨酸[（0.05±0.007）mg/g]和賴氨酸[（0.12±0.0044）mg/g]這5種氨基酸含量明顯升高（P＜0.05）；天冬氨酸（（0.3±0.0036）mg/g）和谷氨酸[（0.46±0.007）mg/g]含量呈明顯下降趨勢(shì)（P＜0.05）。

表3 鼠李糖乳桿菌發(fā)酵前后胡蘿卜汁中游離氨基酸含量變化Table 3 Changes of free amino acids content in carrot juice before and after fermentation withL.rhamnus mg/g

2.4 益生菌發(fā)酵對(duì)胡蘿卜汁的抗氧化活性的影響

鼠李糖乳桿菌發(fā)酵前后胡蘿卜汁對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除率見圖3。由圖3可知，發(fā)酵后的胡蘿卜汁的抗氧化活性明顯增加（P＜0.05），與發(fā)酵前后酚和黃酮含量的變化趨勢(shì)相符。發(fā)酵后的胡蘿卜汁對(duì)DPPH和羥基自由基的清除率分別為70.6%和26.45%，相比起發(fā)酵前的清除率分別提高了30.42%和21.45%。

圖3 鼠李糖乳桿菌發(fā)酵前后胡蘿卜汁對(duì)DPPH、羥基自由基清除率變化Fig.3 Changes of free radical scavenging rate of carrot juice on DPPH and hydroxyl free radical before and after fermentation withL.rhamnus

鼠李糖乳桿菌發(fā)酵胡蘿卜汁前后總還原力的變化見圖4。由圖4可知，總還原力在發(fā)酵后顯著增加（P＜0.05）。發(fā)酵后胡蘿卜汁的總還原力的吸光度值為0.58±0.01，發(fā)酵后的胡蘿卜汁比發(fā)酵前總還原力提高了28.89%。

圖4 鼠李糖乳桿菌發(fā)酵前后胡蘿卜汁總還原力變化Fig.4 Changes of total reducing power of carrot juice before and after fermentation withL.rhamnus

3 討論

乳酸菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)最重要的益生菌群，乳酸菌發(fā)酵能夠釋放果蔬中的酚類物質(zhì)、有機(jī)酸和游離氨基酸等功能性物質(zhì)的含量，提高生物利用率、增強(qiáng)抗氧化性和抑制糖尿病相關(guān)酶的能力。

酚類是一種易被氧化的物質(zhì)，能夠有效的在細(xì)胞和生理水平上防止氧化[14]。果蔬中的酚類物質(zhì)主要以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)存在，CHU Y F等[15]對(duì)胡蘿卜中酚類物質(zhì)含量和抗氧化能力的研究表明胡蘿卜中的酚類物質(zhì)以游離態(tài)為主，結(jié)合酚的含量同樣占總酚含量的24%左右。目前，相較于結(jié)合酚，游離酚因其易開發(fā)，生理活性強(qiáng)的特點(diǎn)受到越來(lái)越多的關(guān)注。乳酸菌發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生阿魏酸酯酶等酚酸酯酶水解果蔬中的部分結(jié)合酚，釋放果蔬中的游離酚，并且釋放大量的有機(jī)酸，防止酚類物質(zhì)的降解，從而提高了抗氧化活性。某些乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中，也會(huì)產(chǎn)生一些酚酸脫羧酶，這種能使酚類物質(zhì)之間相互轉(zhuǎn)化。由此可見，乳酸菌發(fā)酵而導(dǎo)致果蔬酚類物質(zhì)間的相互轉(zhuǎn)化，能明顯改變其抗氧化性[16]。

乳酸菌發(fā)酵主要通過(guò)同型發(fā)酵和異型發(fā)酵兩種代謝途徑。同型發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌參與糖酵解、三羧酸循環(huán)等途徑產(chǎn)生乳酸，并且伴隨丙酮酸和琥珀酸等部分中間產(chǎn)物[17]。異型發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌除了產(chǎn)生乳酸和乙酸等主要產(chǎn)物之外，還會(huì)產(chǎn)生少量的甲酸、丁酸和琥珀酸等代謝產(chǎn)物[18]。胡蘿卜汁經(jīng)過(guò)鼠李糖乳桿菌發(fā)酵后乳酸、檸檬酸、琥珀酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量明顯增加（P＜0.05），而蘋果酸的含量顯著減少（P＜0.05），這可能涉及到乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中的一種特殊代謝途徑（蘋果酸-乳酸發(fā)酵）[19]。本研究結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌在發(fā)酵胡蘿卜汁過(guò)程中，蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸，蘋果酸含量由發(fā)酵前的（0.506±0.045）mg/mL下降為發(fā)酵后的（0.043±0.002）mg/mL。

胡蘿卜汁經(jīng)過(guò)鼠李糖乳桿菌發(fā)酵后天冬氨酸和谷氨酸的含量明顯下降。七谷圭等[20]發(fā)現(xiàn)某些乳酸菌能夠?qū)⑻於彼嶂脫Q成丙氨酸，不僅能夠增強(qiáng)菌的繁殖力還能夠降低酸味增加適口性。谷氨酸是合成γ-氨基丁酸重要的前體物質(zhì)，乳酸菌發(fā)酵能夠?qū)⒐劝彼徂D(zhuǎn)化成為具有降血壓功能的γ-氨基丁酸[21]。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)初步探討了鼠李糖乳桿菌在果蔬發(fā)酵過(guò)程中對(duì)其活性成分與抗氧化活性的影響，結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌發(fā)酵后胡蘿卜汁中的游離態(tài)酚類物質(zhì)含量明顯增加（P＜0.05），而結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)的含量明顯下降（P＜0.05），其中槲皮素相較于發(fā)酵前提高了243.91%；發(fā)酵后乳酸含量最高，比發(fā)酵前提高了5.376 mg/mL；發(fā)酵后蘇氨酸（0.13mg/g）、絲氨酸（0.25mg/g）、甘氨酸（0.34mg/g）、蛋氨酸（0.05mg/g）和賴氨酸（0.12mg/g）含量均明顯升高（P＜0.05）。

發(fā)酵后的胡蘿卜汁對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除率分別為70.6%和26.45%，比發(fā)酵前分別提高了30.42%和21.45%。

發(fā)酵后的胡蘿卜汁總還原力吸光度值為0.58±0.01，比和發(fā)酵前提高了28.89%。

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