胡文康,孫 莉,熊 坤,付 彬,沈婉瑩,付彩霞,高 冰,汪 超,徐 寧*
(1.湖北工業(yè)大學(xué) 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心,湖北 武漢 430068;
2.湖北省恩施土家族苗族自治州食品藥品檢驗檢測中心,湖北 恩施 445000;3.湖北土老憨調(diào)味食品股份有限公司,湖北 宜昌 443000)
豆醬是以豆類為主要原料,利用米曲霉等多種微生物共同發(fā)酵而制成的一種風(fēng)味食品[1]。豆醬是我國歷史悠久的傳統(tǒng)發(fā)酵品,其的出現(xiàn)可以追溯到周朝,是最早關(guān)于我國先民制作豆醬所使用原料及工藝的文字記錄。豆醬制作過程中的每一環(huán)節(jié)都至關(guān)重要,而制曲過程更是其中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié),在制曲過程中,許多因素都會影響最終豆醬成曲的質(zhì)量。制曲過程為微生物的生長提供一系列條件,使其能夠大量繁殖,從而可以產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶等。酶的種類及活力的強弱直接決定了原料中蛋白質(zhì)、淀粉類物質(zhì)等的水解效果,最終影響所產(chǎn)豆醬風(fēng)味、口感和品質(zhì)。
紫蘇(Perilla frutescens)別名紅蘇、赤蘇,系一年生唇形科草本植物[2]。紫蘇的營養(yǎng)豐富,其中含有蛋白質(zhì)、多種維生素及礦物質(zhì),還含有多酚、α-亞麻酸、黃酮和紫蘇醇等活性物質(zhì)[3]。這些物質(zhì)使得紫蘇具有抗氧化[4]、延緩機體衰老、改善記憶力的能力,同時兼具抗菌[5]、抗過敏[6]、抑制腫瘤[7]、降血脂[8]等多種作用。紫蘇曾經(jīng)被忽視的狀況隨著人民群眾生活水平的日益提高而逐漸消失,其作為一種藥食兼用植物[9-10]已經(jīng)在食品、醫(yī)藥以及香料等行業(yè)大放異彩[11-13],市面上出現(xiàn)越來越多紫蘇產(chǎn)品。利用紫蘇和大豆共同發(fā)酵生產(chǎn)的紫蘇豆醬,能夠充分發(fā)揮紫蘇的營養(yǎng)價值和獨特風(fēng)味,豐富傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品的種類。
多酚是一種具有抗衰老、消除自由基和抗氧化作用的食品抗氧劑[14]。作為豆醬主要原料的大豆中有多種含酚結(jié)構(gòu)的大分子物質(zhì),在發(fā)酵時通過米曲霉等作用將會產(chǎn)生對豆醬風(fēng)味和功能具有貢獻的酚類物質(zhì)。此外酚類也是紫蘇中主要的次生代謝產(chǎn)物,通過微生物發(fā)酵有利于酚類物質(zhì)的溶出。
本研究根據(jù)豆醬制曲過程中影響成曲品質(zhì)的主要因素進行試驗,在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以成曲中總酚含量做為響應(yīng)值進行響應(yīng)面試驗,得到紫蘇豆醬最優(yōu)制曲工藝,為紫蘇豆醬制備提供理論性參考。
紫蘇粉:湖北土老憨生態(tài)農(nóng)業(yè)集團;黃豆、面粉:市售;米曲霉(Aspergillus oryzae)AS 3.951(滬釀 3.042)、黑曲霉Aspergillusniger)AS3.350:湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心;福林酚、碳酸鈉和甲醇:國藥集團化學(xué)試劑有限公司;沒食子酸(純度為99%):阿拉丁試劑(上海)有限公司。
ZXSR-1270生化培養(yǎng)箱:上海智城分析儀器制造有限公司;UV-1601紫外可見分光光度計:北京瑞利分析儀器有限公司;YM50-FY50壓力蒸汽滅菌器:上海三申醫(yī)療器械有限公司;Biosafer-10D臺式凍干機:賽飛中國有限公司;CT15RE離心機:日立工機株式會社。
1.3.1 成曲工藝流程
1.3.2 制曲環(huán)節(jié)流程
曲料配方為黃豆∶面粉=6.5∶3.5(g∶g),在試驗組中添加紫蘇粉代替部分面粉,再接入霉菌(米曲霉和黑曲霉)制得種曲。黃豆經(jīng)潤水環(huán)節(jié)浸泡后,將黃豆在121℃條件下高壓蒸煮20 min,待其冷卻,接入種曲拌勻。置于制曲室中在34℃條件下培養(yǎng),在培養(yǎng)10~12 h后,對其進行松曲,再培養(yǎng)19~22 h后,進行第二次松曲。將培養(yǎng)溫度調(diào)節(jié)至28~30℃,保持該溫度培養(yǎng)直至制曲結(jié)束。
1.3.3 單因素試驗
將紫蘇粉添加量、米曲霉與黑曲霉的復(fù)配比(以下簡稱為菌種復(fù)配比)、接種量和制曲時間為評價因素,依據(jù)表1中的因素水平和試驗條件,采用1.3.1中的流程進行制曲。得到成曲后,檢測其中的總酚含量??疾煲陨?個因素各對成曲中總酚含量的影響。每個試驗平行進行3次,取其測量結(jié)果平均值。
因素 水平 固定條件
紫蘇粉添加量/%3、7、11、15接種量0.3%、菌種復(fù)配比3∶1、制曲時間40 h接種量/%0.2、0.3、0.4、0.5紫蘇添加量11%、菌種復(fù)配比3∶1、制曲時間40 h菌種復(fù)配比(g∶g)2∶1、3∶1、4∶1、5∶1紫蘇添加量11%、接種量0.3%、制曲時間40 h制曲時間/h 36、40、44、48紫蘇添加量11%、接種量0.3%、菌種復(fù)配比3∶1
1.3.4 制曲工藝最優(yōu)參數(shù)的確定
在1.3.3中所述單因素試驗的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken原理[15],設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面分析試驗,其因素與水平見表2。
表2 制曲工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface analysis for koji-making technology optimization
1.3.5 總酚的提取及含量測定
成曲中總酚的提取方法參考XU L等[16]的報道,稱取10g冷凍干燥的成曲樣品,溶于100mL體積分數(shù)70%的甲醇溶液中,室溫超聲處理15min,隨后在離心機中以10000r/min轉(zhuǎn)速離心10 min。殘余底液繼續(xù)用上述方法提取,共提取3次。合并3次離心所得的上清液用于檢測總酚含量。
總酚含量檢測方法參考XU B J等[17]的報道。取0.5 mL樣品于10 mL比色管中,加入5.0 mL 10%福林酚后,室溫條件下靜置。待其反應(yīng)5 min后,再加入4 mL 7.5%Na2CO3溶液,并用去離子水補充至10 mL,搖至均勻,室溫條件下靜置。靜置1 h后在波長760 nm處測其吸光度值。以沒食子酸為標準品作標準曲線,結(jié)果以每克樣品中含有的沒食子酸當(dāng)量(gallic acid equivalent,GAE)表示(mg GAE/g)。
1.3.6 數(shù)據(jù)分析
上述試驗所得數(shù)據(jù)使用Design Expert 8.0.5b及SPSS軟件進行處理。
2.1.1 紫蘇粉添加量對成曲中總酚含量的影響
紫蘇中含有大量的酚類物質(zhì),而酚類物質(zhì)具有較強的抗氧化活性,發(fā)酵可顯著提高原料中酚類物質(zhì)的含量[18]。以不加紫蘇的組別作為空白對照,紫蘇粉添加量對成曲中總酚含量的影響見圖1。由圖1可知,總酚含量隨著紫蘇粉添加量的增加,出現(xiàn)了先升后降的趨勢,在紫蘇粉添加量為11%時,成曲中總酚的含量達到最高,為5.74 mg GAE/g,與對照組相比,提高了39.6%;繼續(xù)添加紫蘇粉至15%時,比對照組提高了22.8%。適量加入紫蘇粉的確可以提高成曲中總酚含量,但過量加入紫蘇粉,其含有的黃酮、多酚等物質(zhì)反而會抑制微生物的生長,影響酶系的分泌,進而造成成曲中總酚含量降低。故在響應(yīng)面優(yōu)化試驗中將紫蘇粉添加量定為7%、11%和15%。
圖1 紫蘇粉添加量對成曲中總酚含量的影響Fig.1 Effects of different perilla powder addition on the content of total phenols in finished koji
2.1.2 接種量對成曲中總酚含量的影響
以不加紫蘇的組別作為空白對照,接種量對成曲中總酚含量的影響見圖2。由圖2可知,當(dāng)接種量為0.3%時,成曲中總酚含量達到最大,為5.81mgGAE/g,當(dāng)接種量>0.3%時,成曲中總酚含量開始減少,這是由于接種量過大會使得曲料內(nèi)菌種的數(shù)量增加,使其對原料中可利用營養(yǎng)物質(zhì)的競爭加劇,導(dǎo)致其中部分菌體由于無法獲得充足的養(yǎng)分而生長遲緩,進而影響到了最終菌種孢子的成熟,蛋白酶、纖維素酶和果膠酶等酶系的分泌也隨之減少,因此成曲中酚類物質(zhì)含量反而下降[19]。故在響應(yīng)面優(yōu)化試驗中將接種量定為0.3%、0.4%和0.5%。
圖2 接種量對成曲中總酚含量的影響Fig.2 Effects of inoculum on the content of total phenols in finished koji
2.1.3 菌種復(fù)配比對成曲中總酚含量的影響
米曲霉單菌種制曲存在曲酶系不足的缺陷,而通過多菌種混合制曲不僅可以彌補這一不足,同時還可以提高所制成曲中的總酚含量,這能增加其抗氧化活性物質(zhì),提高成曲的品質(zhì),以不加紫蘇的組別作為空白對照,不同米曲霉與黑曲霉的復(fù)配比對總酚含量的影響見圖3。由圖3可知,當(dāng)米曲霉與黑曲霉的比例為3∶1(g∶g)時,成曲中總酚含量達到最大,為6.02mgGAE/g。而加大這一比例后,其總酚含量反而減少,這可能是因為黑曲霉接種比例的減少,導(dǎo)致成熟的黑曲霉孢子數(shù)不足,影響酶的分泌,從而使成曲中酚類物質(zhì)含量下降。故在響應(yīng)面優(yōu)化試驗中將米曲霉與黑曲霉的復(fù)配比定為3∶1、4∶1和5∶1(g∶g)。
圖3 菌種復(fù)配比對成曲中總酚含量的影響Fig.3 Effects of different compound strains ratio on the content of total phenols in finished koji
2.1.4 制曲時間對成曲中總酚含量的影響
制曲時間過短,會導(dǎo)致菌絲不能充分生長,且影響成曲品質(zhì),總酚含量較低;而制曲時間過長,則會沾染產(chǎn)生雜菌,導(dǎo)致最后成曲質(zhì)量及其中總酚含量下降。以不加紫蘇的組別作為空白對照,制曲時間對成曲中總酚含量的影響見圖4。由圖4可知,制曲時間同為36 h時,加入紫蘇后的成曲中酚含量為4.02 mg GAE/g,與不加紫蘇的組相比,減少了6.9%,這可能是由于紫蘇要比黃豆含有更多的纖維素,需要米曲霉耗費更多的時間去合成分泌纖維素酶,使纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖等物質(zhì)。而隨著制曲時間的延長,成曲中總酚含量隨之急劇上升,之后的回落是由于制曲時間太長,酚類物質(zhì)有所氧化。在制曲時間為44 h時存在峰值,總酚含量為5.60mgGAE/g。故響應(yīng)面優(yōu)化試驗中將制曲時間定為40 h、44 h、48 h。
圖4 制曲時間對成曲中總酚含量的影響Fig.4 Effects of koji-making time on the content of total phenols in finished koji
2.2.1 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果
應(yīng)用Box-Behnken原理進行響應(yīng)面試驗,選擇紫蘇粉添加量、接種量、菌種復(fù)配比和制曲時間4個因素為自變量,以成曲中總酚含量(Y)為響應(yīng)值,進行試驗,試驗結(jié)果見表3。
表3 制曲工藝優(yōu)化響應(yīng)面分析試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 3 Results and analysis of response surface analysis for koji making technology optimization
使用Design Expert 8.0.5b軟件,通過其中Box-Behnken Design模型處理表3數(shù)據(jù),二次響應(yīng)面回歸擬合得到成曲中總酚含量與紫蘇粉添加量、接種量、菌種復(fù)配比和制曲時間四因素之間的回歸方程為:Y=5.63-0.17A-0.15B-0.16C-0.027D-0.18AB+0.025AC-5×10-3AD+0.14BC-7.5×10-3CD-0.68A2-0.14B2+0.034C2-0.037D2,對模型進行分差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗,結(jié)果見表4。
由表4回歸方差分析顯著性檢驗表明,該模型回歸顯著(P<0.05),失擬項不顯著,說明該模型與實際實驗擬合較好,故通過響應(yīng)面法對紫蘇曲料的制備工藝進行的優(yōu)化是合理可行的。
表4 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of response surface experiments results
根據(jù)表4中:F(A)=9.00,F(xiàn)(B)=7.23,F(xiàn)(C)=7.96,F(xiàn)(D)=0.24,說明各因素條件對成曲品質(zhì)的影響程度存在差異,按照其影響程度大小排序為紫蘇粉添加量>菌種復(fù)配比>接種量>制曲時間。根據(jù)顯著性結(jié)果可知,回歸方程一次項A和平方項A2對結(jié)果影響極顯著(P<0.01),一次項B和一次項C對結(jié)果影響顯著,其他因素對結(jié)果影響均不顯著。
2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果優(yōu)化與分析
通過Design Expert 8.0.5b軟件,根據(jù)實驗數(shù)據(jù),作出響應(yīng)面分析圖,擬合出一系列響應(yīng)面形狀,從而分析紫蘇粉添加量、接種量、菌種復(fù)配比和制曲時間交互作用對總酚含量的影響,響應(yīng)面結(jié)果見圖5。
根據(jù)響應(yīng)面模型與回歸方程,可得出理論最優(yōu)制曲工藝條件為紫蘇粉添加量6.92%,接種量0.32%,菌種復(fù)配比1.94∶1(g∶g),制曲時間43.04h,總酚含量的理論值為6.07mgGAE/g。在考慮因素實際可操作性后,將上述最優(yōu)制曲工藝條件修改為:紫蘇粉添加量7%,接種量0.3%,菌種復(fù)配比2∶1(g∶g),制曲時間44 h。在該條件下進行平行試驗3次,測量成曲中總酚含量,取平均值,結(jié)果為6.25 mg GAE/g,相對誤差為0.5%,說明回歸方程與實際情況擬合較好。
圖5 紫蘇粉添加量、接種量、制曲時間和菌種復(fù)配比交互作用對紫蘇豆醬成曲中總酚含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interactions between perilla powder addition,inoculum,koji-making time and compound strain ratio on the content of total phenols in finished koji
應(yīng)用響應(yīng)面法,在單因素的試驗的基礎(chǔ)上,通過Box-Behnken Design模型確定了紫蘇豆醬的最優(yōu)制曲工藝,其工藝條件為紫蘇粉添加量7%,接種量0.3%,米曲霉與黑曲霉配比2∶1,制曲時間44h。該條件下所制得成曲中的總酚含量為6.25 mg GAE/g,相對誤差為0.5%。利用紫蘇制備的豆醬,不僅具有明顯的紫蘇風(fēng)味,還比普通豆醬具有更多的酚類物質(zhì),使豆醬的品質(zhì)得到提升,同時賦予豆醬特殊風(fēng)味。
[1]沈憲良.黃豆醬技術(shù)工藝概述[J].食品研究與開發(fā),2012,33(7):238-240.
[2]李 鵬,朱建飛,唐春紅.紫蘇的研究動態(tài)[J].重慶工商大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2010,27(3):271-275.
[3]朱建飛,白紹文,陳 楠,等.紫蘇餅粕多糖的水提工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(1):266-267.
[4]陳小華.紫蘇中天然活性成分的提取與應(yīng)用[J].臨床醫(yī)藥文獻電子雜志,2015(17):3385-3386.
[5]崔綺嫦.芳香食用植物精油抗菌活性及其在中藥健康飲品中的應(yīng)用[D].廣州:廣東工業(yè)大學(xué),2016.
[6]NITTA M,KOBAYASHI H,OHNISHI-KAMEYAMA M,et al.Essential oil variation of cultivated and wildPerilla,analyzed by GC/MS[J].Biochem Syst Ecol,2006,34(1):25-37.
[7]王曉輝.紫蘇化學(xué)成分和抗腫瘤的研究[D].長春:吉林大學(xué),2016.
[8]王婧瑜,王 涵,谷 巖.紫蘇水提取物對高脂血癥小鼠的降血脂及抗氧化作用[J].東北農(nóng)業(yè)科學(xué),2017(1):56-60.
[9]韋保耀,黃 麗,滕建文,等.紫蘇葉抗過敏作用的評價[J].食品科技,2006,31(8):284-286.
[10]霍立娜,王 威,劉 洋,等.紫蘇葉化學(xué)成分研究[J].中草藥,2016,47(1):26-31.
[11]時藝霖,顧憲紅,黃 勇,等.紫蘇籽提取物對蛋雞產(chǎn)蛋高峰后期生產(chǎn)性能、生殖激素及免疫功能的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2015,27(5):1519-1526.
[12]周 丹,韓大慶.紫蘇子油對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J].中草藥,1994(5):251-252.
[13]劉大川,王 靜,蘇望懿,等.紫蘇植物的開發(fā)研究[J].中國油脂,2001,26(5):7-9.
[14]朱建飛,陳玥昕,唐春紅.紫蘇餅中多酚的提取工藝研究[J].中國油脂,2011,36(10):77-80.
[15]徐向宏,何明珠.試驗設(shè)計與Disign-Expert、SPSS應(yīng)用[M].北京:科學(xué)出版社,2010:146-157.
[16]XU L,DU B,XU B.A systematic,comparative study on the beneficial health components and antioxidant activities of commercially fermented soyproducts marketed in China[J].Food Chem,2015,174(3):202-213.
[17]XU B J,CHANG S K C.A comparative study on phenolic profiles and antioxidant activities of legumes as affected by extraction solvents[J].J Food Sci,2007,72(2):159-166.
[18]周曉晶.紫蘇種子脂肪酸、醇提物成分含量分析及其抗氧化活性研究[D].北京:北京林業(yè)大學(xué),2014.
[19]李保英,姜佳麗,蔣予箭.醬油生產(chǎn)中應(yīng)用米曲霉和黑曲霉混合制曲的探索[J].中國釀造,2011,30(12):70-74.