一株耐高乙醇和低pH己酸產(chǎn)生菌Lysinibacillus fusiformispBE3-ep-SigB的構(gòu)建

薛正楷，楊根慶，張宿義，倪 斌，5

（1.瀘州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 白酒學(xué)院，四川 瀘州 646001；2.瀘州市生物醫(yī)學(xué)工程研究所，四川 瀘州 646000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 新鄉(xiāng) 453003；4.瀘州老窖股份有限責(zé)任公司，四川 瀘州 646002；5.瀘州江潭窖酒業(yè)有限公司，四川 瀘州 646005）

目前，中國(guó)白酒有12種香型，其中濃香型白酒以其芳香濃郁、綿柔甘洌、香味協(xié)調(diào)、入口甜、落口綿、尾凈余長(zhǎng)等特點(diǎn)，成為中國(guó)人青睞的白酒，其年產(chǎn)量占中國(guó)白酒總產(chǎn)量的70%以上。已有研究表明，濃香型白酒的風(fēng)味物質(zhì)有130余種，其中己酸乙酯是濃香型白酒的主體香物質(zhì)，己酸乙酯含量的高低決定著濃香型白酒品質(zhì)的高低[1-3]。

己酸是己酸乙酯的風(fēng)味物質(zhì)前體，其來源于濃香型白酒生產(chǎn)過程中的窖泥微生物，梭菌屬（Clostridium）、芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）等屬的專性厭氧微生物成為產(chǎn)己酸微生物的最重要類群，目前已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)己酸微生物包括Lysinibacillus fusiformis、Clostridium kluyveri、Lysinibacillus sphaericus、Clostridium sartagoneforme等菌株，這些菌株皆為專性厭氧微生物。

σ因子是一類啟始細(xì)菌核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）合成的蛋白質(zhì)，其唯一功能是啟始特定的RNA聚合酶結(jié)合到特定環(huán)境因素誘導(dǎo)下的特定基因的啟動(dòng)子，啟動(dòng)特定基因在特定時(shí)空條件下的轉(zhuǎn)錄，以利微生物抗環(huán)境脅迫的不利影響，被其選擇表達(dá)控制的基因決定于基因的內(nèi)在功能和環(huán)境信號(hào)的雙重作用。σ70因子是一類管家基因SigA基因表達(dá)的分子質(zhì)量70 kDa的蛋白質(zhì)，控制細(xì)胞類大多數(shù)基因的轉(zhuǎn)錄合成；σB屬于選擇性σ因子，為革蘭氏陽性菌特有的一類轉(zhuǎn)錄起始蛋白，其基因?yàn)镾igB，在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）細(xì)胞內(nèi)，σB調(diào)節(jié)大量一般應(yīng)激操縱子的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的200多個(gè)基因參與熱、酸、乙醇、鹽和氧化應(yīng)激性[4-7]。

近年，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（erro-prone polymerasechainreaction，epPCR）突變篩選有義突變，成為微生物育種的重要方法。張賽等[8]運(yùn)用定向進(jìn)化-易錯(cuò)PCR方法獲得了耐高溫和低pH的突變酶，其酶活力比野生酶分別提高了6.5倍、21.0倍和12.6倍；王睿等[9]用同樣的進(jìn)化方法提高了華根霉Rhizopus chinensisCCTCC M201021的脂肪酶活力，其最佳突變株脂肪酶酶活與野生菌株相比分別提高2倍和4倍；汪先薇[10]利用易錯(cuò)PCR構(gòu)建突變庫時(shí)，獲得大片段的基因簇突變庫；王聰?shù)萚11]利用實(shí)時(shí)-熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)（real time-fluorescence quantitive-polymerase chainreaction，RT-FQ-PCR）對(duì)耐高滲基因的表達(dá)變化研究發(fā)現(xiàn)，T酵母能夠耐高滲是由于甘油的合成迅速同時(shí)外排通道被關(guān)閉，使得胞內(nèi)甘油的含量升高，保證T酵母的正常生長(zhǎng)；李璟等[12]采用易錯(cuò)PCR方法對(duì)枯草芽孢桿菌脂肪酶基因lipaseA進(jìn)行定向進(jìn)化，突變株4B2發(fā)酵上清液轉(zhuǎn)化生物柴油的轉(zhuǎn)酯效率較對(duì)照菌pET 32a-lipaseA有明顯提高，前者為79.5%，后者為49.72%。

目前，己酸菌育種菌均采用窖泥分離并產(chǎn)酸鑒定，發(fā)酵條件優(yōu)化后，直接用于生產(chǎn)[13-17]，并對(duì)其抗脅迫能力的研究及基因工程育種，國(guó)內(nèi)外少見報(bào)道。由于產(chǎn)己酸微生物在窖池中伴隨糟醅的發(fā)酵過程，始終處于低pH、高乙醇濃度等高脅迫不良環(huán)境中，如何提高抗脅迫基因的表達(dá)，成為產(chǎn)己酸微生物生死悠關(guān)分子進(jìn)化策略。為了提高產(chǎn)己酸菌的抗脅迫能力，因此，本研究嘗試以Lysinibacillus fusiformis為出發(fā)菌，利用易錯(cuò)PCR篩選有義突變技術(shù)分別轉(zhuǎn)染SigA和SigB基因，獲得抗高乙醇和低pH脅迫的優(yōu)良己酸產(chǎn)生工程菌，為己酸的選育提供理論依據(jù)和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質(zhì)粒與菌株

穿梭質(zhì)粒pBE3-MCS：由南昌大學(xué)生命科學(xué)院提供；菌株Lysinibacillusfusiformis：由本研究所分離并保存；pET32a（+）-SigA和pET32a（+）-SigB：由本研究所構(gòu)建并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH 7.0±0.2，固體培養(yǎng)基加入15 g瓊脂，121℃滅菌30 min。

改良麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基：葡萄糖1.0 g，KCl 1.8 g，酵母膏4 g，醋酸鈉15 g，固體培養(yǎng)基加入瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121℃滅菌30 min，使用前加入20 mL無水乙醇。

乙酸鈉培養(yǎng)基：葡萄糖1.0 g，KCl 1.8 g，酵母膏2.5 g，醋酸鈉8.2 g，固體培養(yǎng)基加入瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121℃滅菌30 min，使用前加入10 mL無水乙醇。

1.1.3 試劑

限制性核酸內(nèi)切酶XbaI、HindIII、KpnI：美國(guó)Thermos Fisher Scientific公司；T4脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）連接酶、DNALigationKitVer.1（CodeNo.6021）：大連TaKaRa公司；小量質(zhì)粒抽提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒（DP209）、DNA純化試劑盒、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）和DNA Marker：天根生化有限公司；易錯(cuò)PCR試劑盒：天恩澤生物技術(shù)有限公司；PCR引物：由捷瑞生物工程有限公司合成；卡那霉素（分析純）：湖北信康醫(yī)藥化工有限公司；氨芐青霉素（分析純）：杭州百思生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSD-YF3600全溫培養(yǎng)搖床：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：金壇市良友儀器有限公司；WD-9413A型凝膠成像分析儀、DYY-8C電泳儀：北京市六一儀器廠；NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Bio-Rad公司；SmartSpecPlus核酸蛋白分析儀：美國(guó)伯樂公司；SC-B梯度PCR儀：杭州艾普儀器設(shè)備股份有限公司；GC-2014氣相色譜儀：日本島津公司；YQX-II厭氧培養(yǎng)箱：上海衡柏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Scientz-2C基因?qū)雰x：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組菌的構(gòu)建篩選與引物的設(shè)計(jì)

Lysinibacillus fusiformis SigA/SigB原位超表達(dá)菌株構(gòu)建按照如下流程進(jìn)行。

為了從pET32a（+）-SigA和pET32a（+）-SigB重組質(zhì)粒獲得目的基因SigA和SigB基因，參考pET32a（+）質(zhì)粒、SigA、SigB及酶切位點(diǎn)基因序列，采用Primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)SigA和SigB基因的上下游引物，結(jié)果見表1。SigA和SigB基因的上下游引物分別帶有XbaI、HindIII和KpnI酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)的引物由上海捷瑞生物技術(shù)公司合成。

表1 擴(kuò)增SigA/SigB基因的引物設(shè)計(jì)Table 1 Design of primer sequences for amplification of SigA/SigBgene

1.3.2 pET32（+）-SigA/SigB重組質(zhì)粒的提取

取E.coliBL21（DE3）/pET32a（+）-SigA/SigB，單菌落接種至5 mL含100 μg/mL氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，采用天根公司質(zhì)粒小提試劑盒DP103）提取質(zhì)粒pET32a（+）-SigA/SigB，采用微量紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定重組質(zhì)粒濃度和波長(zhǎng)分別為260 nm、280 nm處的吸光度值比值（A260nm/A280nm）。

1.3.3 易錯(cuò)PCR條件的優(yōu)化

在PCR過程中Mg2+可以穩(wěn)定非互補(bǔ)的堿基對(duì)，而Mn2+可以降低聚合酶對(duì)模板的特異性，因而調(diào)整兩種離子的濃度，可以獲得不同突變頻率的多樣性文庫。本研究選擇Mn2+濃度為0.3～0.8mmol/L，Mg2+濃度為3～7mmol/L作為梯度進(jìn)行epPCR試驗(yàn)。采用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（dataprocessingsystem，DPS）7.5對(duì)Mn2+濃度和Mg2+濃度進(jìn)行2因素6水平U6（62）的均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其設(shè)計(jì)方案見表2。

表2 U6(62)均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 U6(62)design of uniform experiments

以重組質(zhì)粒pET-32a（+）-SigA/SigB為模板，按下列PCR體系和條件進(jìn)行ep PCR。反應(yīng)體系：10×Mix 5 μL，三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸（deoxyadenosine triphosphate，dATP）、三磷酸脫氧胸苷（deoxy-thymidine triphosphate，dTTP）、三磷酸脫氧鳥苷酸（deoxyguanosine triphosphate，dGTP）和三磷酸脫氧胞苷（deoxycytidine triphosphate，dCTP）各2.5 μL，模板1 μL，上下游引物各1 μL，Mn2+和Mg2+按表2進(jìn)行添加，Taq酶2 μL，補(bǔ)雙蒸水至50 μL。

反應(yīng)條件：SigB基因：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，45℃退火1 min，72℃延伸2 min，40個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。SigA基因：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1.2 min，32個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。

利用1%瓊脂糖電泳確認(rèn)PCR產(chǎn)物，采用天根膠回收試劑盒回收特異性高條件下的目的基因片段，用已回收片段為模板按第一輪ep PCR方案進(jìn)行第二輪ep PCR，選取特異性高的ep PCR條件進(jìn)行第二輪ep PCR，回收二輪易錯(cuò)產(chǎn)物于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4SigA/SigB基因ep PCR突變文庫的構(gòu)建

雙酶切：取第二輪易錯(cuò)PCR純化產(chǎn)物SigA、SigB基因和穿梭載體pBE3-MCS，分別采用XbaI/HindIII和KpnI/HindIII進(jìn)行雙酶切，酶切體系和條件見表3。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳確定酶切效果。

純化：取酶切效果良好產(chǎn)物，采用天根公司普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒（DP209）對(duì)SigA、SigB基因和穿梭載體pBE3-MCS的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收，對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行DNA濃度和純度檢測(cè)。

表3 易錯(cuò)PCRSigA/SigB基因和pBE3-MCS雙酶切體系及條件Table 3 Double enzyme digestion system and conditions of error-prone PCRSigA/SigBgene and pBE3-MCS

連接：按照DNA Ligation Kit Ver.1（Code No.6021）說明書，各取8 μLSigA和SigB純化酶切產(chǎn)物，分別加入2 μL pBE3-MCS片段配制成混合溶液，加入10 μL溶液I，充分混勻，16℃反應(yīng)30 min后，分別加入1 μL溶液III混勻。

轉(zhuǎn)化：各取10μL連接體系加入到200μLBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，各取100μL轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂至含100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)18 h，獲得SigA和SigB基因易錯(cuò)PCR突變文庫。

菌落PCR驗(yàn)證：各取含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基3 mL注入E.coliBL21（DE3）/pBE3-ep-SigA/SigB平板中，洗下單菌落加入到10 mL試管，補(bǔ)充含100 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基至5 mL，于37℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 h后，進(jìn)行菌液PCR鑒定。

雙酶切驗(yàn)證：經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后，挑取陽性克隆子的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。

1.3.5L.fusiformis-pBE3-ep-SigA/SigB工程菌的構(gòu)建

提取陽性克隆子菌液質(zhì)粒，經(jīng)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入L.fusiformis感受態(tài)細(xì)胞中。電轉(zhuǎn)化參數(shù)為電壓2 000 V，電容25 μF，電阻200 Ω，時(shí)間5.2 ms。取200 μL轉(zhuǎn)化液涂至含卡那霉素（50μg/mL）和2%乙醇的乙酸鈉培養(yǎng)基平板，34℃培養(yǎng)16h。

1.3.6 抗高乙醇和低pH己酸產(chǎn)生菌株L.fusiformis-pBE3-ep-SigA/SigB的篩選

己酸含量的檢測(cè)：參考薛正楷等的方法[15]。

乙醇耐受性的測(cè)定：取2mL含2%乙醇的改良麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基加入到1.3.5的平板上，洗滌克隆子，取200 μL洗滌液加入到含2%、4%、6%、8%、10%、12%乙醇和50 μg/mL卡那霉素的10mL乙酸鈉培養(yǎng)基中，90℃水浴5min，置于0.08MPa、34℃真空培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1 d后，按50 μg/mL加入卡那霉素繼續(xù)培養(yǎng)10 d，觀察氣泡出現(xiàn)時(shí)間并檢測(cè)10 d發(fā)酵液中己酸含量。

pH耐受性的測(cè)定：按5%接種量接種至pH值為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0的10 mL最大乙醇含量且能產(chǎn)氣泡的改良麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基中，培養(yǎng)至產(chǎn)氣泡，取pH值耐受性最高且產(chǎn)氣改良麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基涂板，隨機(jī)挑選10個(gè)單克隆子至10 mL含8%的乙醇和50 μg/mL的卡那霉素改良麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基中，培養(yǎng)10 d，檢測(cè)己酸含量。

1.3.7 抗高乙醇和低pH己酸產(chǎn)生菌株L.fusiformis-pBE3-ep-SigB的鑒定

菌落PCR鑒定：采用下列PCR體系和條件對(duì)1.3.5項(xiàng)下單克隆菌液，進(jìn)行菌液PCR鑒定，反應(yīng)體系：2×Tsingke mastermix25μL，模板1μL，上下游引物各1μL，菌液0.3μL，補(bǔ)雙蒸水到50 μL；反應(yīng)條件同1.3.3。

測(cè)序結(jié)果分析：取PCR鑒定陽性菌液1 mL送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，

將測(cè)序結(jié)果與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SigA/SigB基因易錯(cuò)PCR條件的優(yōu)化

按照均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)L.fusiformis SigA/SigB基因進(jìn)行隨機(jī)突變，結(jié)果見圖1。

圖1 SigA/SigB基因易錯(cuò)PCR結(jié)果Fig.1 Results of error-prone PCR ofSigA/SigBgene

由圖1A可知，SigB基因第一輪PCR產(chǎn)物中，所有條件下的SigB基因均較清晰，本試驗(yàn)選用試驗(yàn)5號(hào)條件進(jìn)行SigB基因第二輪PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1B。由圖1B可知，SigB第二輪易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以試驗(yàn)5號(hào)條件為最好，因此，本試驗(yàn)采用試驗(yàn)5號(hào)條件進(jìn)行第二輪SigB基因的易錯(cuò)PCR擴(kuò)增。由圖1C可知，在SigA基因的第一輪PCR產(chǎn)物中，試驗(yàn)5號(hào)產(chǎn)物濃度較高，且特異性較高，因此本試驗(yàn)采用試驗(yàn)5號(hào)條件進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1D。由圖1D可知，相對(duì)于其他易錯(cuò)PCR體系而言，試驗(yàn)4號(hào)為SigA基因較為適宜的第二輪PCR條件，因此，本試驗(yàn)采用試驗(yàn)4號(hào)進(jìn)行SigA基因的第二輪PCR擴(kuò)增。

2.2 SigA/SigB基因易錯(cuò)PCR突變庫的構(gòu)建與初步鑒定

以優(yōu)化的易錯(cuò)PCR條件和第一輪易錯(cuò)PCR產(chǎn)物為模板，分別對(duì)SigA和SigB為模板進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，將第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，將純化產(chǎn)物和pBE3-MCS分別用XbaI/HindIII和KnpI/HindIII進(jìn)行雙酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物采用Takara連接試劑盒進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，按每板100 μL接種至含50 μg/mL卡那霉素平板中，34℃培養(yǎng)14 h，觀察轉(zhuǎn)化板菌落，獲得SigA/SigB易錯(cuò)PCR突變庫。

取1mL含50 μg/mL卡那霉素LB培養(yǎng)基，加入易錯(cuò)PCR突變庫平板中，洗出易錯(cuò)PCR突變庫平板克隆子，接種至3支5mL含50μg/mL卡那霉素LB培養(yǎng)基中，于34℃、180r/min條件下培養(yǎng)14 h，取3 μL進(jìn)行菌液PCR鑒定。提取PCR鑒定正確的菌液質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，提取的重組質(zhì)粒PBE3-ep-SigA和PBE3-ep-SigB分別經(jīng)XbaI-HindIII和KnPI-HindIII雙酶切后，在1100bp左右（圖2A）和900 bp多（圖2B）有條帶，分別與SigA和SigB基因大小相符合，說明工程菌E.coliBL21（DE3）/PBE3-ep-SigA/SigB構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒PBE3-ep-SigA和PBE3-ep-SigB雙酶切結(jié)果Fig.2 Results of double enzyme digestion of recombinant plasmid PBE3-ep-SigAand PBE3-ep-SigB

2.3 抗高乙醇和低pH己酸產(chǎn)生菌株L.fusiformis-pBE3-ep-SigA/SigB的篩選

檢 測(cè) 菌 株L.fusiformis、L.fusiformis-PBE3-SigA、L.fusiformis-PBE3-SigB、L.fusiformis-PBE3-ep-SigA和L.fusiformis-PBE3-ep-SigB發(fā)酵10 d后發(fā)酵液中的己酸含量，結(jié)果見表4。

表4 不同脅迫條件下的己酸產(chǎn)量比較Table 4 Comparison of caproic acid yield under different stress conditionsmg/100 mL

由表4可知，在抗乙醇脅迫條件下，出發(fā)菌L.fusiformis的抗乙醇最高濃度為4%，其己酸含量為264.35 mg/mL；L.fusiformis-PBE3-SigA和L.fusiformis-PBE3-SigB的抗乙醇濃度為6%左右，其己酸濃度分別為175.45 mg/mL和198.46 mg/mL；L.fusiformis-PBE3-ep-SigA和L.fusiformis-PBE3-ep-SigB的耐乙醇濃度為8%左右，其己酸濃度為137.45 mg/mL和277.68 mg/mL，因此，出發(fā)菌轉(zhuǎn)入SigA和SigB基因獲得的重組菌株及其易錯(cuò)PCR重組突變菌株均能提高其在脅迫條件的產(chǎn)己酸能力，且L.fusiformis-ep-SigB在高乙醇濃度條件下的產(chǎn)己酸能力高于L.fusiformis-PBE3-ep-SigA達(dá)102%；在抗pH值脅迫條件下，出發(fā)菌L.fusiformis和重組菌L.fusiformis-PBE3-SigA、L.fusiformis-PBE3-SigB的抗pH均為3.5，其己酸產(chǎn)量分別為23.54mg/100mL、86.36mg/100mL和96.43mg/100mL，但重組菌己酸產(chǎn)量高于出發(fā)菌，易錯(cuò)PCR重組菌L.fusiformis-PBE3-ep-SigA和L.fusiformis-PBE3-ep-SigB的抗pH值分別為3.0和2.5，其己酸產(chǎn)量分別為35.44 mg/100 mL和77.00 mg/100 mL，因此在pH脅迫條件下，易錯(cuò)PCR重組菌L.fusiformis-PBE3-ep-SigB產(chǎn)己酸量高于易錯(cuò)PCR重組菌L.fusiformis-PBE3-ep-SigA達(dá)263.7%，因此，本研究采用L.fusiformis-PBE3-ep-SigB菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4 抗高乙醇和低pH己酸產(chǎn)生菌株L.fusiformis-ep-SigB的鑒定

從L.fusiformis-PBE3-ep-SigB突變庫中，隨機(jī)挑取6個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果見圖3。由圖3可知，PCR產(chǎn)物電泳條帶與目的基因大小相符，說明L.fusiformis-PBE3-ep-SigB單克隆菌株構(gòu)建成功。

圖3 L.fusiformis-PBE3-ep-SigB的PCR鑒定結(jié)果Fig.3 Results of PCR identification ofL.fusiformis-PBE3-ep-SigB

2.5 L.fusiformis-ep-SigB產(chǎn)己酸鑒定

經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證正確的菌株L.fusiformis-PBE3-ep-SigB在8%乙醇濃度，pH3.5條件下發(fā)酵10 d，采用氣相色譜測(cè)定發(fā)酵液中的己酸含量，結(jié)果見表5。由表5可知，在高酸度和高乙醇濃度發(fā)酵條件下，L.fusiformisPBE3-ep-SigB產(chǎn)己酸能力顯著高于L.fusiformis-PBE3-SigB和L.fusiformis（P＜0.01），說明成功選育高抗性產(chǎn)己酸工程菌株。

表5 高抗性產(chǎn)己酸菌株的己酸產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of caproic acid yield for caproic acid-producing strain with high resistant

2.6 L.fusiformis-ep-SigB產(chǎn)己酸菌株的測(cè)序鑒定

取取己酸產(chǎn)量最高的菌酸菌菌液500 μL，送上海生工進(jìn)行測(cè)序結(jié)果，將測(cè)序結(jié)果采用NCBI工具blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行比較，結(jié)果見圖4。

圖4 L.fusiformis-ep-SigB菌株突變株測(cè)序結(jié)果Fig.4 Sequencing results of mutant strain ofL.fusiformis-ep-SigB strain

由圖4A可知，L.fusiformis-ep-SigB突變株的易錯(cuò)基因（SigBv）與出發(fā)基因（SigB）相比，有7個(gè)點(diǎn)突變位點(diǎn)，分別是95位（C→G）、232位（A→T）、324位（T→A）、505位（C→G）、545位（C→G）、602位（G→C）、723位（A→T）；由圖4B可知，其蛋白質(zhì)序列有44位（T→R）、81位（N→Y）、100位（H→Q）、176位（H→D）、198位（T→R）、208位（R→P）、251位（Q→H）共7個(gè)氨基酸發(fā)生突變。

3 結(jié)論

σ因子SigA和SigB基因經(jīng)優(yōu)化的易錯(cuò)PCR條件進(jìn)行兩輪易錯(cuò)PCR突變，分別建立SigA和SigB的易錯(cuò)PCR突變庫，通過epSigA/SigB基因與表達(dá)載體pBE3-MCS連接，構(gòu)建L.fusiformis-PBE3-ep-SigA和L.fusiformis-PBE3-ep-SigB菌體庫，將兩種菌體庫在pH值2.0～5.0和乙醇含量2%～12%條件下進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，L.fusiformis-PBE3-ep-SigB重組菌株最高耐乙醇含量為8%左右，最低耐pH值為2.5左右；當(dāng)乙醇含量為8%、pH值為3.5時(shí)，L.fusiformis-PBE3-ep-SigB重組菌株的己酸產(chǎn)量到達(dá)（254.35±39.74）mg/100 mL，為出發(fā)菌L.fusiformis己酸產(chǎn)量（93.62±10.33）mg/100 mL的271.68%，表明L.fusiformis-PBE3-ep-SigB重組菌株是具有較強(qiáng)的抗高乙醇濃度和低pH值脅迫能力的優(yōu)良己酸產(chǎn)生菌株。

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