分段調(diào)控pH值對陰溝腸桿菌WL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫的影響

屈曉偉，李艷賓，2，張 琴，2*

（1.塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué) 塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

氫能是地球上最清潔的終極能源，目前已成為世界各國競相開發(fā)的可再生能源。近年來，通過產(chǎn)氫微生物發(fā)酵木質(zhì)纖維素水解液生產(chǎn)生物氫已引起了廣泛地關(guān)注[1-5]。其中，產(chǎn)氫微生物在發(fā)酵產(chǎn)氫過程中起到了主導(dǎo)作用，自然界的發(fā)酵產(chǎn)氫微生物主要包括專性厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫菌、兼性厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫菌和需氧發(fā)酵產(chǎn)氫菌[6-11]。兼性厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫菌中的腸桿菌屬（Enterobacter）是目前研究最多的產(chǎn)氫細菌，能夠通過分解甲酸的代謝途徑產(chǎn)氫，即通過混合酸發(fā)酵途徑產(chǎn)氫[12-13]。該屬細菌在發(fā)酵產(chǎn)氫過程中會伴隨多種有機酸（如乳酸、乙酸等）的產(chǎn)生，使發(fā)酵液pH值降低。

pH值是影響發(fā)酵產(chǎn)氫過程的重要因素，能影響產(chǎn)氫菌的活力和發(fā)酵產(chǎn)氫代謝過程[14]。發(fā)酵過程的pH調(diào)控直接影響產(chǎn)氫菌一些有機酸類代謝物（如乳酸、乙酸等）的濃度，有利于生物氫的合成[15]。QIU C S等[16]研究了pH和基質(zhì)濃度對極端嗜熱菌群發(fā)酵產(chǎn)氫的影響，發(fā)現(xiàn)菌群最適的發(fā)酵產(chǎn)氫起始pH在中性范圍（pH6.0～7.0），在起始pH7.0、木糖質(zhì)量濃度7.5g/L時獲得最高的生物氫產(chǎn)量（1.29 mol H2/mol消耗的木糖）。KHANNA N等[13]調(diào)控Enterobacter cloacaeIIT-BT 08發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氫過程中pH值恒定為6.5，獲得了較高的生物氫產(chǎn)量（3.1 mol H2/mol葡萄糖）、特異產(chǎn)氫潛力

收稿日期：2018-01-26 修回日期：2018-04-26

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（21406150）

作者簡介：屈曉偉（1992-），男，碩士研究生，研究方向為產(chǎn)氫微生物發(fā)酵產(chǎn)氫及代謝調(diào)控。

*通訊作者：張 琴（1980-），女，副教授，博士，研究方向為產(chǎn)氫微生物及其代謝工程改造。798.1 mL/g）和特異產(chǎn)氫速率（72.1 mL（/L·h·g））。

棉稈是新疆分布最廣泛的生物質(zhì)原料，用棉稈水解糖液發(fā)酵產(chǎn)氫已成為棉稈高值化利用的重要方式之一，然而，目前棉稈水解糖液發(fā)酵產(chǎn)氫僅限于產(chǎn)氫動力學(xué)等基本特性的研究[17]，尚未實現(xiàn)對其發(fā)酵過程的有效調(diào)控。本研究通過研究分段調(diào)控pH值對Enterobacter cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中發(fā)酵液pH值、生物氫合成、棉稈水解糖液中葡萄糖和木糖利用、菌株生長的影響，以期為有效調(diào)控該菌株發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫的過程提供理論指導(dǎo)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）WL1318：由塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室保藏；棉稈原料：采自新疆阿拉爾棉田，風(fēng)干、粉碎、過篩后經(jīng)水解獲得水解糖液用于發(fā)酵產(chǎn)氫實驗。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、木糖、牛肉膏、蛋白胨、3,5-二羥基甲苯（地衣酚）、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、酒石酸鉀鈉、瓊脂粉、重蒸酚：生工生物工程（上海）股份有限公司；NaCl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl、FeCl3、濃鹽酸、濃硫酸、NaOH（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；大孔吸附樹脂LS808：陜西藍深特種樹脂有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面活化培養(yǎng)基：D-木糖10 g，葡萄糖10 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，KH2PO40.5 g，MgSO·47H2O 1 g，瓊脂22 g，pH7.0，水1 000 mL，110 ℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：D-木糖10 g，葡萄糖10 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 1 g，pH 7.0，水1 000 mL，110℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：棉稈酸解糖液1 000 mL，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，KH2PO40.5 g，MgSO·47H2O 0.5 g，pH 7.5，110℃滅菌30min。棉桿水解糖液初始糖濃度調(diào)節(jié)為40g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KB立式電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2F超凈工作臺、HPX-9272MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱、GZX-9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；UV754N紫外-可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器公司；PHS-3C精密酸度計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 棉稈水解糖液制備方法

棉稈水解糖液制備參照ZHANG Q等[18]報道的棉稈酸解優(yōu)化工藝進行制備：過篩的棉稈（20目）采用4%（V/V）稀硫酸溶液按照固液比1∶5（g∶mL）于121 ℃水解30 min，抽濾得到棉稈的酸水解液。酸水解液經(jīng)NaOH和Ca（OH）2（1∶3，物質(zhì)的量比）沉淀、4%H2SO4回調(diào)脫毒，大孔吸附樹脂脫色，得到一定濃度脫毒、脫色的棉稈水解糖液，再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至所需糖濃度備用。

1.3.2 菌種的活化與接種

挑取2～3環(huán)活化的斜面菌種接種至種子培養(yǎng)基，250mL三角瓶裝液量為100 mL，于37℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)15～16 h。調(diào)節(jié)種子液OD600nm為0.8～1.0，按10%（V/V）接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，密封好發(fā)酵裝置并連接好各導(dǎo)氣管（500 mL自制產(chǎn)氫發(fā)酵裝置裝液量為350 mL，每個處理3個重復(fù)），置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 生物氫收集和檢測方法

采用排氫氧化鈉溶液法[20]收集并檢測氫氣體積，每24h收集并檢測3次氫氣體積，累加計為日均產(chǎn)氫量。每24 h取8 mL發(fā)酵液，2 mL用于測定菌體OD600nm，1 mL通過稀釋平皿計數(shù)法檢測活菌數(shù)，剩余5 mL置于離心管中，4 000 r/min離心20 min，取上清液，檢測葡萄糖和木糖的質(zhì)量濃度。

1.3.4 分析檢測方法

棉稈水解糖液及發(fā)酵液中葡萄糖和木糖質(zhì)量濃度分別采用DNS比色法[19]和地衣酚比色法[21]測定。培養(yǎng)基和發(fā)酵液的pH值采用精密酸度計測定。葡萄糖和木糖利用率：采用發(fā)酵過程中消耗的葡萄糖（或木糖）質(zhì)量濃度占初始葡萄糖（或木糖）質(zhì)量濃度的百分比來表示。

1.3.5 計算公式和分析軟件

采用Gompertz模型對不同處理下的累積產(chǎn)氫量進行擬合[22]，方程如下所示：

式中：H為累積產(chǎn)氫量，mL/L；P表示產(chǎn)氫潛力，mL/L，Rm為最大產(chǎn)氫速率，mL（/L·h），λ為延滯期時間，h，e為自然常數(shù)，2.718 28；式中P、Rm和λ值通過Sigmaplot 12.0軟件進行計算和分析。

各處理數(shù)據(jù)通過Origin 8.0軟件計算、分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 分段調(diào)控pH值對E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中發(fā)酵液pH值的影響

檢測了不同pH值分段調(diào)控處理下，E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中的發(fā)酵液pH值變化，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，未進行pH調(diào)控的處理組，盡管發(fā)酵液初始pH值調(diào)節(jié)為7.5，但其pH值在發(fā)酵產(chǎn)氫過程中卻急劇下降，發(fā)酵48 h，發(fā)酵液pH值＜5.0，至發(fā)酵結(jié)束（120 h），發(fā)酵液pH值＜4.0。在分段調(diào)控pH值的處理中，自調(diào)控時間點起，發(fā)酵pH值調(diào)為初始pH值（7.5），之后發(fā)酵液pH值也隨發(fā)酵時間降低，但降低的幅度仍然小于未調(diào)控處理的，并且48 h調(diào)控組的pH值降低幅度小于28 h調(diào)控組的，這兩個pH值調(diào)控組至發(fā)酵結(jié)束（120 h）時，發(fā)酵液pH值均能維持在5.0左右。由此可見，E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中，適當進行pH值調(diào)控，可控制發(fā)酵液pH值不會急劇降低。

圖1 分段調(diào)控pH值對E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中發(fā)酵液pH值的影響Fig.1 Effect of subsection control of pH value on pH value of fermentative broth in the hydrogen production process of cotton stalk hydrolysate fermentation byE.cloacae WL1318

2.2 分段調(diào)控pH值對E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中生物氫合成的影響

對E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中的日均產(chǎn)氫量進行了監(jiān)測，結(jié)果如圖2所示。

圖2 分段調(diào)控pH值對E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中日均產(chǎn)氫量的影響Fig.2 Effect of subsection control of pH value on daily average hydrogen yield in the hydrogen production process of cotton stalk hydrolysate fermentation byE.cloacae WL1318

由圖2可知，發(fā)酵前48 h，分段調(diào)控pH值處理和未調(diào)控處理的日均產(chǎn)氫量沒有顯著差異（P＞0.05）。發(fā)酵48 h后，分段調(diào)控pH值處理的日均產(chǎn)氫量顯著提高（P＜0.05），尤其48 h調(diào)控pH值的處理提高幅度較大，發(fā)酵72 h的日均產(chǎn)氫量相較未調(diào)控處理的提高約1.5倍。至發(fā)酵結(jié)束（120 h），24 h調(diào)控pH值和48 h調(diào)控pH值處理的日均產(chǎn)氫量接近，均高于未調(diào)控處理的?？梢姡{(diào)控pH值處理有效提高了發(fā)酵液pH值和菌株的日均產(chǎn)氫量，說明E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中進行pH調(diào)控可有效促進菌株生物氫的合成。

日均產(chǎn)氫量按發(fā)酵時間累加，統(tǒng)計了E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液120 h的累積產(chǎn)氫量，統(tǒng)計結(jié)果見圖3。由圖3可知，發(fā)酵48 h后，分段調(diào)控pH值處理顯著提高了菌株的累積產(chǎn)氫量（P＜0.05）。至發(fā)酵結(jié)束（120 h），24 h調(diào)控pH值和48 h調(diào)控pH值處理的累積產(chǎn)氫量相較未調(diào)控處理的分別提高了約15%和30%，表明調(diào)控pH值處理有利于菌株累積合成氫氣，對菌株生物氫的合成起到了正調(diào)控作用。

圖3 分段調(diào)控pH值對E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中累積產(chǎn)氫量的影響Fig.3 Effect of subsection control of pH value on cumulative hydrogen yield in the hydrogen production process of cotton stalk hydrolysate fermentation byE.cloacae WL1318

采用Gompertz模型對不同處理下的累積產(chǎn)氫量進行擬合，并對其中的參數(shù)P、Rm和λ值進行計算，并計算模型的相關(guān)系數(shù)R2，結(jié)果見表1。由表1可知，在各處理條件下，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.99，說明各處理組的累積產(chǎn)氫量可充分通過Gompertz模型進行擬合。24 h調(diào)控pH值和48 h調(diào)控pH值處理的產(chǎn)氫潛力P均高于未調(diào)控處理的，說明在發(fā)酵的一定階段調(diào)控發(fā)酵液pH值可提高菌株的產(chǎn)氫潛力，有利于生物氫的合成。最大產(chǎn)氫速率Rm以24 h調(diào)控pH值的處理最高，說明在發(fā)酵24h調(diào)控pH值能促進生物氫的快速合成。24h調(diào)控pH值和48 h調(diào)控pH值處理的延滯期λ均較未調(diào)控處理的長，說明菌株在一定pH值調(diào)控處理下，通過延長延滯期、推遲生長峰期來適應(yīng)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫過程，從而提高自身產(chǎn)氫潛力，以提高生物氫的合成量。

表1 不同pH值調(diào)控方式下Gompertz模型擬合累積產(chǎn)氫量的參數(shù)和相關(guān)系數(shù)Table 1 Parameters and correlation coefficients of Gompertz model fitted cumulative hydrogen yield in different pH value control methods

2.3 分段調(diào)控pH值對E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中棉稈水解糖液中葡萄糖和木糖利用的影響

檢測了不同pH值分段調(diào)控處理下，E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中的葡萄糖和木糖質(zhì)量濃度變化，并換算了全發(fā)酵過程中的葡萄糖和木糖利用率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 分段調(diào)控pH值對E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中葡萄糖（A）和木糖（B）利用的影響Fig.4 Effect of subsection control of pH value on glucose(A)and xylose(B)utilization in the hydrogen production process of cotton stalk hydrolysate fermentation byE.cloacaeWL1318

由圖4可知，在發(fā)酵過程中，24 h和48 h調(diào)控pH值處理的葡萄糖質(zhì)量濃度略低于未調(diào)控處理的，葡萄糖利用率略高于未調(diào)控處理的。由此可見，E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中調(diào)控發(fā)酵液pH值對棉稈水解糖液中葡萄糖利用的影響并不顯著（P＞0.05），僅引起了葡萄糖質(zhì)量濃度及其利用率的略微變化（見圖4A）。發(fā)酵液24 h和48 h調(diào)控pH值對棉稈水解糖液中木糖利用的影響均不顯著（P＞0.05），說明在發(fā)酵24 h和48 h調(diào)控pH值并不影響棉稈水解糖液中木糖的利用（見圖4B）。

2.4 分段調(diào)控pH值對E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中菌株生長的影響

檢測了E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中的活菌數(shù)和菌體生長OD600nm的變化，結(jié)果如圖5所示。

圖5 分段調(diào)控pH值對E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中活菌數(shù)和OD600 nm的影響Fig.5 Effect of alternative pH regulation on viable count and OD600 nm in the hydrogen production process of cotton stalk hydrolysate fermentation byE.cloacaeWL1318

由圖5可知，分段調(diào)控pH值對E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中的活菌數(shù)變化影響較大，發(fā)酵24h調(diào)控pH值，其活菌數(shù)在發(fā)酵48 h達到峰值；48 h調(diào)控pH值的處理，其活菌數(shù)在發(fā)酵72 h達到另一個峰值；未調(diào)控處理，其活菌數(shù)在發(fā)酵24 h達到峰值后，數(shù)量急劇下降，至發(fā)酵結(jié)束（120 h），其活菌數(shù)已接近初始接種的活菌數(shù)量水平。相應(yīng)地，從OD600nm的變化曲線來看，分段調(diào)控pH值的處理，其OD600nm在調(diào)控時間點后均顯著高于未調(diào)控處理的（P＜0.05）。可見，在一定的發(fā)酵階段進行pH值調(diào)控，有利于細菌菌體的生長，而細菌菌體的生長對于菌株發(fā)酵產(chǎn)氫是十分必要的。

E.cloacaeWL1318是一類典型的兼性厭氧細菌，這類細菌發(fā)酵產(chǎn)氫主要通過混合酸發(fā)酵途徑進行[12-13]，因此，這類細菌發(fā)酵產(chǎn)氫的過程會伴隨大量有機酸的產(chǎn)生，造成發(fā)酵液pH值的降低。發(fā)酵液pH值過低勢必引起細菌生長和生物氫合成受阻，為此，在菌株發(fā)酵產(chǎn)氫的一定階段進行pH值調(diào)控，可以促進細菌有效生長，從而有利于生物氫的合成。

3 結(jié)論

本研究采用分段調(diào)控pH值對E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程進行了調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，pH調(diào)控處理首先使得發(fā)酵液中的pH值不會急劇下降，從而不會產(chǎn)生過低的pH培養(yǎng)環(huán)境，并且能維持發(fā)酵結(jié)束的pH值維持在5.0左右。

分段調(diào)控pH值對E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中生物氫合成和菌體生長有顯著影響（P＜0.05）。發(fā)酵48 h后，分段調(diào)控pH值處理均能顯著提高日均產(chǎn)氫量和累積產(chǎn)氫量（P＜0.05），尤以48 h調(diào)控pH值的處理提高幅度較大。采用Gompertz模型對不同處理下的累積產(chǎn)氫量擬合，其相關(guān)系數(shù)R2均高于0.99，闡明了動力學(xué)模型的可行性。分段調(diào)控pH值處理的產(chǎn)氫潛力P均高于未調(diào)控處理的，說明在發(fā)酵的一定階段調(diào)控發(fā)酵液pH值可提高菌株的產(chǎn)氫潛力，有利于生物氫的合成。分段調(diào)控pH值處理使E.cloacaeWL1318在調(diào)控時間點后達到活菌數(shù)峰值，且菌體生長OD600nm在調(diào)控時間點后均高于未調(diào)控處理的，表明其對菌株的生長有正調(diào)控作用。

總的來看，E.cloacaeWL1318發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程中發(fā)酵液pH值會急劇降低。在其一定的發(fā)酵產(chǎn)氫階段進行pH值調(diào)控，可以促進細菌有效生長，從而有利于生物氫的合成，調(diào)控pH處理方式為有效調(diào)控該菌株的發(fā)酵產(chǎn)氫過程、提高生物氫產(chǎn)量提供了技術(shù)參考和理論指導(dǎo)，具有重要的意義。

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