黃芪注射液對阿霉素性心肌細胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與縫隙連接蛋白表達的影響*

賀智慧，邵立群，宣麗穎，王春貴，魏成喜，王 羽△，趙 明△

（1.內(nèi)蒙古民族大學醫(yī)學院，通遼028000；2.內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院，通遼028000）

阿霉素（adriamycin，ADR）是一種廣譜蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，由于ADR與心肌組織具有非常高的親和力，具有嚴重的心臟毒性，可導致阿霉素性心肌病，其特點為心室擴大并伴有心肌重構及收縮功能降低［1］。阿霉素性心肌病因心肌病變導致心肌細胞凋亡及心肌纖維化等因素易誘發(fā)室性心律失常，引起患者心源性暈厥、猝死［2］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是一種亞細胞器，主要功能是合成蛋白質(zhì)并使合成的蛋白質(zhì)由一級結構變成具有生理功能的空間結構場所。當各種原因?qū)е聝?nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡時，出現(xiàn)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)異常聚集并引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激性蛋白分泌增加，識別錯誤折疊蛋白，通過蛋白酶體將其降解，上述一系列反應過程即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應（endoplasmic reticulum stress，ERS）［3］。文獻報道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與心肌重構及心肌病密切相關［4］，而阿霉素性心肌病主要病理學變化就是發(fā)生心肌細胞凋亡及纖維化等心肌重塑改變。黃芪是我國傳統(tǒng)中藥之一（系豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根），為常用補氣藥物，具有顯著的益氣強心作用。本團隊在前期工作中發(fā)現(xiàn)黃芪注射液對阿霉素所致的心肌損傷具有保護作用［5］，但具體機制尚未明確。本研究擬用Wistar大鼠作為研究對象，建立阿霉素性心肌病動物模型，予以黃芪注射液干預治療，探討其對阿霉素心肌病保護的機制，為黃芪注射液臨床有效治療阿霉素性心肌病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物藥品與儀器

Wistar大鼠購自吉林大學基礎醫(yī)學院動物中心，許可證號：scxk（吉）2011-0004。阿霉素（深圳萬東藥業(yè)）。CX43及p-CX43抗體購于Wanleibio公司。黃芪注射液（成都地奧九泓制藥廠），國藥準字Z51021776，規(guī)格：10 ml／支。光學顯微鏡（Olympus）和H-600型電子顯微鏡（日立，日本）。

1.2 實驗分組及擴張型心肌病大鼠模型制備

36只Wistar雄性大鼠，體重200～230 g，適應性喂養(yǎng)后隨機分為3組（n＝12）：對照組、阿霉素心肌病組及黃芪注射液組，對照組腹腔注射0.9%Nacl（10ml／kg）；阿霉素心肌病組腹腔注射阿霉素2 mg／kg。黃芪注射液組在每次注射同等劑量阿霉素同時，注射黃芪注射液10 g／kg。各組每周注射一次，共三周）。

1.3 心臟彩超檢測

實驗第7周末，用VIVID E9彩超機對3組大鼠行多普勒心臟超聲檢測心功能，以左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）及左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）數(shù)值來確定阿霉素心肌病模型是否造模成功及黃芪注射液治療效果。

1.4 病理取材及切片制作

心臟超聲心動圖檢查后，立即處死大鼠，在無菌狀態(tài)下剪開大鼠左肋，去除心包后暴露心臟，取出心臟。將左心室肌組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)乙醇脫水，石蠟包埋，切片，心肌切片脫蠟、二甲苯透明，行HE、masson染色，于光鏡下觀察病理變化。同時將中、下1／3心臟組織加于2.5%戊二醛溶液中固定，PBS溶液漂洗，1%鋨酸固定，再次用PBS溶液漂洗，梯度乙醇脫水，Epon812環(huán)氧樹脂浸透包埋，超薄切片成70 nm切片，醋酸鈾檸檬酸鉛染色，于透射電鏡下觀察拍片并存檔。

1.5 TUNEL法檢測大鼠心肌細胞凋亡

采用標準TUNEL實驗步驟，檢測各組大鼠心肌細胞凋亡情況。

1.6 免疫組化檢測各組大鼠心肌細胞CX43及p-CX43表達

各組大鼠心肌組織用4%多聚甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，切片后進行免疫組化染色。加入抗CX43及抗 p-CX43抗體，37℃作用 2 h，PBS洗滌 3次。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃作用1 h后，PBS洗滌 3次。加入 3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，顯色終止后，顯微鏡下觀察染色后的組織，并采集圖像分析。

1.7 Real-time PCR檢測大鼠心肌細胞 Grp78、ATF-4及CHOPmRNA表達

引物信息：Grp78 Forward 5’-3’ CAGCCAACTGTAACAATCAA；Grp78 Reverse 5’-3’ CTGTCACTCGGAGAATACCA；ATF-4 Forward 5’-3’ CTG-TATGAGCCCAGAGTCCT；ATF-4 Reverse 5’-3’GCTGCTGTCTTGTTTTGCTC；CHOP Forward 5’-3’ATGTTGAAGATGAGCGGGTG；CHOP Reverse 5’-3’CCGTCTCCAAGGTGAAAGGC；β-actin Forward 5’-3’ GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC；β-actin Reverse 5’-3’ GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT

經(jīng)標準real-time PCR實驗步驟，檢測3組大鼠心肌細胞 Grp78、ATF-4及 CHOPmRNA表達，利用2-△△CT方法分析實驗數(shù)據(jù)。

1.8 統(tǒng)計學方法

實驗結果以均值 ±標準差（）表示，采用SSPS 11.5統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，兩組間均數(shù)比較采用 t檢驗。

2 結果

2.1 黃芪注射液對大鼠精神、飲食、活動、毛色及死亡數(shù)量的影響

對照組大鼠毛發(fā)光亮，體質(zhì)量隨時間增加。ADR組大鼠毛發(fā)灰暗，躁動不安，不喜飲食，心臟增大；黃芪注射液組大鼠毛發(fā)略灰暗。3組大鼠在飼養(yǎng)及實驗過程中均未出現(xiàn)死亡。

2.2 黃芪注射液對大鼠心臟彩超的影響

如圖1、表1所示，對照組大鼠心臟彩超未見明顯異常。與對照組比較，ADR組大鼠 LVEDD、LVESD明顯增大，LVEF明顯減少（P均 ＜0.01），說明造模成功。黃芪注射液組大鼠LVEDD、LVESD較ADR組大鼠明顯減小，LVEF明顯增加（P均 ＜0.01）。

Fig.1 Heart color Doppler ultrasound images of each group

2.3 黃芪注射液對大鼠心肌結構的影響

HE染色顯示：ADR組大鼠出現(xiàn)心肌纖維排列紊亂，心肌纖維間質(zhì)水腫，大量淋巴細胞浸潤。黃芪注射液組大鼠心肌紊亂及間質(zhì)水腫明顯輕于ADR組（圖2）。Masson染色時，心肌纖維和紅細胞呈紅色，而膠原纖維呈藍色。Masson染色顯示，ADR組大鼠心肌纖維化嚴重；黃芪注射液組大鼠心肌纖維化輕于ADR組（圖3）。電鏡觀察顯示：ADR組大鼠心肌顯示有肌纖維溶解破壞、線粒體極度腫脹、破壞，呈空泡樣。黃芪注射液組心肌細胞超微結構損傷較ADR組明顯減輕，線粒體空泡明顯減少（圖4）。

Tab.1 Ventricular structure in each group rats with dilated cardiomyopathy（，n＝12）

LVEDD：Left ventricular end-diastolic diameter；LVESD：Left ventricular end-systolic diameter；LVEF：Left ventricular ejection fraction**P＜0.01 vs control group； ＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs ADR group

Group LVEDD（mm） LVESD（mm） LVEF（%）Control 4.63±0.37 2.49±0.24 80.0±4.7 ADR 6.24±0.31**3.54±0.33**69.0±4.2**Astragalus 5.31±0.24＃＃ 2.97±0.41＃＃ 76.0±3.9＃

Fig.2 The rat cardiomyocyte HE staining

Fig.3 The rat cardiomyocyte Masson staining

Fig.4 Transmission electronic microscope image of rat cardiomyocyte

2.4 黃芪注射液對大鼠心肌細胞凋亡的影響

如圖5所示：與對照組大鼠心肌細胞凋亡（4.12±0.98）%比較，ADR組大鼠心肌細胞凋亡（25.23±5.38）%明顯增加（P＜0.01）；與 ADR組大鼠心肌細胞凋亡比較，黃芪注射液組大鼠心肌細胞凋亡（15.71±5.76）%明顯減低（P＜0.01）。

Fig.5 Apoptosis of rat cardiomyocyte of each group

2.5 黃芪注射液對大鼠心肌細胞CX43及p-CX43表達的影響

如圖6所示：與對照組大鼠（21.1±1.07）%比較，ADR組大鼠心肌細胞 CX43表達（1.15±0.51）%明顯減少，與ADR組大鼠比較，黃芪注射液組大鼠心肌細胞 CX43表達（10.37±0.78）%明顯增加。與對照組大鼠心肌細胞 p-CX43表達（0.94±0.11）%比較，ADR組大鼠心肌細胞 p-CX43表達（9.77±0.69）%明顯增加；與ADR組大鼠比較，黃芪注射液組大鼠心肌細胞 p-CX43表達（4.18±0.51）%明顯減少。

Fig.6 CX43 and p-CX43 immunohistochemistry staining of rat cardiomyocyte in each group

2.6 黃芪注射液對大鼠心肌細胞Grp78、ATF-4及CHOPmRNA表達的影響

3組大鼠心肌細胞Grp78、ATF-4及CHOP的擴增曲線及溶解曲線如圖7所示。

與對照組比較，ADR組大鼠心肌細胞Grp78，ATF-4和CHOPmRNA表達明顯增多（P＜0.01）；與ADR組大鼠比較，黃芪注射液組大鼠心肌細胞Grp78，ATF-4和 CHOP mRNA表達明顯減少（P＜0.01，表 2）。

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)正確折疊功能異常，可導致誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)異常聚集及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激性蛋白分泌增加，識別錯誤折疊蛋白質(zhì)，并通過蛋白酶體將其降解，上述一系列反應過程即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應（endoplasmic reticulum stress，ERS）［6］。VMC小鼠及柯莎奇 B3（CVB3）病毒感染心肌細胞可引發(fā)ERS［7］。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，阿霉素可引起心肌細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路引發(fā)心肌細胞凋亡［8］。凋亡使工作心肌細胞絕對數(shù)量減少，導致心肌收縮力下降，從而發(fā)生心力衰竭［9］。同時，心肌細胞凋亡可導致心臟成纖維細胞增生、轉化為肌成纖維細胞，增加細胞外基質(zhì)沉積，導致心臟纖維化引發(fā)心肌重構［10］。

Tab.2 The mRNA expression of Grp78，ATF-4 and CHOP in rats’heartof each group

Fig.7 Amplification and solubility curve of Grp78，ATF-4，CHOP real-time PCR

中藥材黃芪為豆科草本植物蒙古黃芪的根，具有補氣固表、利水退腫功效［11］，作為藥物使用已有兩千多年的歷史。黃芪注射液是從黃芪中提取的有效成分，臨床應用廣泛，可用于治療心氣虛損、血脈瘀阻之病毒性心肌炎、心功能不全等疾?。?］。

本研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素組大鼠心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激伴侶蛋白 Grp78（glucose-regulated protein 78）以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡信號通路因子ATF-4（activating transcription factor 4）、CHOP（C／EBP homologous protein）mRNA表達明顯增多，并出現(xiàn)嚴重心肌細胞凋亡；而黃芪注射液組大鼠心肌細胞凋亡明顯減少，同時伴有Grp78、ATF-4、CHOPmRNA表達減少。上述實驗結果說明，阿霉素可引起心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，并通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡信號通路Grp78→ATF-4→CHOP介導心肌細胞凋亡；黃芪注射液減少阿霉素大鼠心肌細胞凋亡機制是緩解心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，并抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡信號通路因子活化。同時，實驗發(fā)現(xiàn)黃芪注射液能夠增加阿霉素大鼠心肌細胞Cx43（connexin 43）表達，減少p-Cx43表達。文獻報道：Cx43是構成縫隙連接通道（gap junction，GJ）的主要成分，Cx43磷酸化使GJ通道關閉，而Cx43去磷酸化則促使GJ通道開放［12］。GJ通道關閉使得心肌細胞間電傳導出現(xiàn)障礙，是產(chǎn)生心律失常的重要原因。研究結果表明，黃芪注射液能增加Cx43表達，抑制p-Cx43表達，具有抗阿霉素心肌病所致的心律失常作用，其作用機制可能與抑制阿霉素誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激而致心肌細胞凋亡及縫隙連接蛋白磷酸化有關。據(jù)此推測，未來黃芪注射液可能被廣泛用于阿霉素心肌病的臨床治療。

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