右歸丸對(duì)鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎的治療作用及W nt信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響*

顏春魯，李盛華，安方玉，劉永琦，夏鵬飛，馬正民，牛彥強(qiáng)，柳鵬瑤

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，2.微生物與免疫教研室，3.科研實(shí)驗(yàn)中心，4.中醫(yī)臨床學(xué)院，5.臨床學(xué)院，6.甘肅省高校中藏藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州730000）

膝骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis of the knee，KOA）主要病理特征以膝關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退變、軟骨基質(zhì)發(fā)生降解為主，繼發(fā)滑膜炎癥和骨質(zhì)增生，引發(fā)關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。預(yù)防和阻止膝關(guān)節(jié)軟骨退變、降低軟骨基質(zhì)的降解是治療KOA的關(guān)鍵之所在。一些研究表明，KOA的發(fā)病機(jī)制涉及到Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的某些因子表達(dá)出現(xiàn)異常。Dickkopf同源物1（Dickkopf homolog 1，DKK1）、Wnt誘導(dǎo)分泌蛋白 1（Wnt induced secreted protein 1，WISP1）和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5（low density lipoprotein receptor related protein 5，LRP5）是 Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要信號(hào)蛋白質(zhì)［1-3］。發(fā)現(xiàn)膝骨性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中WISP1含量增加［2］。另外，WISP 1蛋白質(zhì)過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的損傷［4］。姜旭等［5］研究也發(fā)現(xiàn)，在骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）關(guān)節(jié)軟骨中 WISP 1、Wnt和βcatenin基因mRNA及蛋白質(zhì)水平明顯增高。因此，調(diào)節(jié)Wnt／β-catenin信號(hào)通路及通路中相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)可能是治療KOA的新靶點(diǎn)，可為防治膝骨性關(guān)節(jié)炎提供新的思考。

右歸丸出自《景岳全書(shū)》。方中附子、肉桂、鹿角膠培補(bǔ)腎中元陽(yáng)，溫里祛寒，為君藥。熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥滋陰益腎，養(yǎng)肝補(bǔ)脾，填精補(bǔ)髓，取“陰中求陽(yáng)”之義，為臣藥。再用菟絲子、杜仲補(bǔ)肝腎，強(qiáng)腰膝，配以當(dāng)歸養(yǎng)血和血，共補(bǔ)肝腎精血，為佐藥。全方共湊具有溫陽(yáng)補(bǔ)腎、填精補(bǔ)髓之功效。研究發(fā)現(xiàn)［6，7］，針刺、艾灸聯(lián)合右歸丸治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的有效率為90.2%，安絡(luò)痛膠囊聯(lián)合右歸丸治療陽(yáng)虛寒凝型膝骨性關(guān)節(jié)炎療效96.67%，但是右歸丸治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的具體機(jī)制未明。本實(shí)驗(yàn)采用改良Hulth法復(fù)制膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型，探討Wnt／β-catenin信號(hào)通路在KOA發(fā)生、發(fā)展中的分子調(diào)控機(jī)理，明確其在退行性骨關(guān)節(jié)病變中的作用。進(jìn)一步揭示右歸丸對(duì)KOA的作用機(jī)制，為右歸丸臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí) SD大鼠60只，體重（180±20）g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：SYXK（甘）2015-0005。

1.2 藥物與試劑

右歸丸購(gòu)自仲景宛西制藥股份有限公司；硫酸氨基葡萄糖片購(gòu)自新興同仁藥業(yè)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑2×prime script RTmastermix和熒光定量SYBR PRemix EX TaqⅡ均購(gòu)自寶生物；DKK1抗體、WISP1抗體、Wnt1抗體、LRP5抗體和β-catenin抗體均購(gòu)自Abcam。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

FA2004N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），ZY12306型微量加樣器（ScienTiFic產(chǎn)品），DW-86L338型超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司），Dynamic VELOCITY 18R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，ChemiDocTMXRS+型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），PowerPac Basic型數(shù)顯雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀（美國(guó) Bio-Rad公司），CFX96TM型 Real-time熒光定量PCR儀 （美國(guó)Bio-Rad），BioMate 3S型蛋白（核酸）濃度測(cè)定儀（Thermo），SK-1型快速混勻器（金壇市恒豐儀器廠(chǎng)）。

1.4 動(dòng)物分組、造模及給藥

60只SD大鼠雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為6組（n＝10）：隨機(jī)選取一組為假手術(shù)組，其余各組用改良Hulth法復(fù)制大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型［8，9］。腹腔注射 10%水合氯醛（0.3ml／100 g）麻醉各組大鼠后，雙側(cè)膝關(guān)節(jié)手術(shù)區(qū)常規(guī)消毒，無(wú)菌條件下將雙側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱向切開(kāi)長(zhǎng)約2 cm，逐層暴露關(guān)節(jié)腔，剔除膝前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶及內(nèi)側(cè)半月板，注意勿損傷關(guān)節(jié)軟骨面。用潔凈的5 ml注射器吸取生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔3～5次，行抽屜試驗(yàn)陽(yáng)性后徹底止血，逐層縫合。將假手術(shù)組SD大鼠從膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)打開(kāi)關(guān)節(jié)腔，不破壞韌帶、半月板，保留關(guān)節(jié)軟骨面?？p合傷口前均滴入少量的青霉素溶液，隨后逐層縫合。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素2×105U／d，各組大鼠均在相同條件下飼養(yǎng)，自由飲水、攝食。手術(shù)造模6周后，假手術(shù)組和模型組灌服蒸餾水；按人和動(dòng)物的體表面積計(jì)算法計(jì)算藥物用量。硫酸氨基葡萄糖組按0.17 g／kg灌服硫酸氨基葡萄糖。右歸丸由熟地24 g、山藥12 g、山茱萸9 g、枸杞子 9 g、鹿角膠12 g、菟絲子12 g、杜仲12 g、當(dāng)歸9 g、肉桂 6 g、制附子 6 g等組成，111 g×0.018×5～10 g／kg。常規(guī)水煎，制成濃度為生藥1 g／ml的藥液；右歸丸高、中、低劑量組分別按（20 g／kg、10 g／kg、5 g／kg）灌服相應(yīng)的藥物，灌服體積為 2ml／200 g，干預(yù)8周。末次給藥后無(wú)菌條件下分離膝關(guān)節(jié)，部分膝關(guān)節(jié)分裝于含4%多聚甲醛的磨口瓶中，用于組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察；部分膝關(guān)節(jié)分裝于凍存管中，于-80℃冰箱保存，用RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨中mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。

1.5 一般情況

觀(guān)察大鼠的飲食、飲水、活動(dòng)度、靈敏度、精神狀態(tài)，膝關(guān)節(jié)的畸形、腫脹、活動(dòng)情況，雙下肢肢端血運(yùn)及肌肉豐滿(mǎn)程度。

1.6 關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)變化的觀(guān)察

膝關(guān)節(jié)軟骨脫鈣后，按照HE染色方法進(jìn)行染色。光鏡下觀(guān)察膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化并進(jìn)行Mankin評(píng)分［10］。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，軟骨結(jié)構(gòu)光整如常，軟骨細(xì)胞數(shù)量如常，基質(zhì)染色正常，潮線(xiàn)比較完整；1分，軟骨表面有不規(guī)則裂隙，軟骨細(xì)胞數(shù)量彌漫性增多，基質(zhì)染色減退，出現(xiàn)多重潮線(xiàn)；2分，軟骨裂隙深達(dá)肌層，軟骨細(xì)胞成簇生長(zhǎng)，基質(zhì)染色明顯減退，軟骨下血管浸入肌層；3分，軟骨裂隙深達(dá)輻射層，軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，基質(zhì)染色明顯減退；4分，軟骨裂隙深達(dá)鈣化層，基質(zhì)染色完全消失；5分，軟骨層脫落。

1.7 DKK1、W ISP1、Wnt1、β-catenin和 LRP5 mRNA表達(dá)的測(cè)定

按Qiangen公司RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取軟骨組織RNA，測(cè)其濃度和A260nm／A280nm比值后，42℃30min，85℃5min進(jìn)行cDNA鏈的合成，95℃5min，95℃ 10 s，55℃ 20 s，75℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。每樣品重復(fù)3次，數(shù)據(jù)記錄采用相對(duì)定量法，以 2-△△Ct表示樣本中目的基因相對(duì)表達(dá)含量。其中 DKK1、WISP1、Wnt1、β-catenin、LRP5及β-actin等引物根據(jù)GenBank基因序列使用Oligo 6.0設(shè)計(jì)，由寶生物工程（大連）有限公司合成。引物序列如下：DKK1下游引物：5’-GAAGGTCTGGCTTGCAGGATA-3’，上游引物：5’-TCCATCGCATTTAGGCTGTTG-3’；WISP1下游引物：5’-CAGTCCTGATGGTGGGCAAC-3’，上 游 引 物：5’-ACACGGCCACTTGCAGAA-3’；Wnt1下游引物：5’-GCTGTGATGACGTGGGAAATA-3’，上游引物：5’-GAGGCATGGTTCACTGTTCA-3’；β-catenin下游引物：5’-GTCTGAGGACAAGCCACAGGACTAC-3’，上 游 引 物：5’-AATGTCCAGTCCGAGATCAGCA-3’；LRP5下游引物：5’-ACCATTGATTACGCCGACCAG-3’，上游引物：5’-ATCGCTATATTGAGTCAGGCCAAAG-3；β-actin下游引物：5’-TTGCTGATCCACATCTGCT-3’，上 游 引 物：GACAGGATGCAGAAGGAGAT。

1.8 DKK1、W ISP1、Wnt1、β-catenin和 LRP5蛋白質(zhì)表達(dá)的測(cè)定

用RIPA裂解液提取軟骨組織蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度為30μg／10μl。每孔點(diǎn)樣 15μl，作 SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉、滴加抗DKK1、WISP1、Wnt1、β-catenin和 LRP5等一抗孵育，用山羊抗兔IgG二抗孵育。采用ECL Plus超敏發(fā)光液染色觀(guān)察，將溶液 A和 B等體積混勻后，按約0.125ml／cm2膜面積進(jìn)行染色，室溫反應(yīng)1min后置于Image Lab 3.0進(jìn)行曝光，曝光條件為：?jiǎn)蝹€(gè)曝光時(shí)間10 s，總曝光時(shí)間60 s。

1.9 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way-Anova）。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般情況觀(guān)察

實(shí)驗(yàn)期間未出現(xiàn)動(dòng)物死亡現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)期間假手術(shù)組大鼠飲食、飲水、活動(dòng)如常，反應(yīng)比較靈敏，精神狀態(tài)良好；膝關(guān)節(jié)未出現(xiàn)畸形、腫脹，活動(dòng)良好，雙下肢端血運(yùn)正常，肌肉未發(fā)生萎縮。模型組大鼠飲食、飲水、活動(dòng)情況較模型組好、靈敏度及精神狀態(tài)均明顯變差，膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)內(nèi)翻畸形、腫脹，雙下肢端血運(yùn)變差，肌肉發(fā)生萎縮。右歸丸各干預(yù)組及硫酸氨基葡萄糖組大鼠飲食、飲水、活動(dòng)情況較模型組好，靈敏度及精神狀態(tài)也有所好轉(zhuǎn)，膝關(guān)節(jié)腫脹程度、肌肉萎縮程度均較模型組顯著改善，肢端血運(yùn)明顯恢復(fù)。

2.2 右歸丸對(duì)關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠關(guān)節(jié)面完整、光滑，滑膜完整，軟骨細(xì)胞排列整齊，呈水平排列；軟骨周?chē)?xì)胞較小，扁平形，排列密集，其長(zhǎng)軸平行于軟骨表面；中心細(xì)胞較大呈圓形或橢圓形，同源細(xì)胞群排列。模型組大鼠關(guān)節(jié)面破損嚴(yán)重，軟骨組織大量脫落，軟骨細(xì)胞正常排列改變，排列紊亂，有簇聚現(xiàn)象，細(xì)胞數(shù)目增多，空泡變大。各干預(yù)組大鼠軟骨細(xì)胞排列紊亂，由平行排列變?yōu)榭v行排列，細(xì)胞數(shù)目增多。其中，右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠軟骨細(xì)胞排列整齊，分布均勻，鈣化層軟骨細(xì)胞輕度成簇，潮線(xiàn)尚完整。Mankin評(píng)分結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組及各干預(yù)組大鼠Mankin評(píng)分均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠Mankin評(píng)分均明顯降低（P＜0.05）；與硫酸氨基葡萄糖組比較，右歸丸低、中劑量組大鼠 Mankin評(píng)分均明顯升高（P＜0.05，圖 1，表 1）。

Tab.1 Mankin scores ofmorphology structure of articular cartilage in each group（，n＝10）

Tab.1 Mankin scores ofmorphology structure of articular cartilage in each group（，n＝10）

*P＜0.05 vs sham group；＃P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs glucosamine sulfate group

Group Mankin scores Sham 0.20±0.089 Model 4.55±0.599*Glucosamine sulfate 2.55±0.896*＃Youguipill low-dose 3.91±0.553*△Youguipillmiddle-dose 3.82±0.579*△Youguipill high-dose 2.88±0.680*＃

2.3 右歸丸對(duì)軟骨組織 DKK1、W ISP1、Wnt1、βcatenin和LRP5 mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組和各干預(yù)組大鼠軟骨組織 WISP1、Wnt1、β-catenin和 LRP5 mRNA表達(dá)增高，模型組和右歸丸低劑量組DKK1 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05）。與模型組比較，右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠 WISP1、Wnt1、β-catenin和LRP5mRNA表達(dá)降低，DKK1 mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）。與硫酸氨基葡萄糖組比較，右歸丸低、中劑量WISP1、Wnt1、β-catenin和 LRP5 mRNA表達(dá)增高，DKK1mRNA表達(dá)降低（P＜0.05，表 2、表 3）。

Fig.1 Pathological changes of articular cartilage in knee joints（HE×200）

Tab.2 Effects of Youguipill on expressions of DKK1、W1SP1 and Wnt1mRNA in cartilage tissue（，n＝10）

Tab.2 Effects of Youguipill on expressions of DKK1、W1SP1 and Wnt1mRNA in cartilage tissue（，n＝10）

*P＜0.05 vs sham group；＃P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs glucosamine sulfate group

Group DKK1 WISP1 Wnt1 Sham 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 Model 0.46±0.18* 5.43±0.97* 4.77±0.37*Glucosamine sulfate 1.19±0.15＃ 1.80±0.51*＃ 3.24±0.85*＃Youguipill low-dose 0.42±0.03*△ 4.99±0.75*△ 4.48±0.84*△Youguipillmiddle-dose 0.59±0.11△ 4.22±0.40*△ 4.10±0.92*△Youguipill high-dose 0.90±0.14＃ 1.68±0.79*＃ 1.82±0.61*＃

Tab.3 Effects of Yougui pill on expressions ofβ-catenin、LRP5 mRNA in cartilage tissue（，n＝10）

Tab.3 Effects of Yougui pill on expressions ofβ-catenin、LRP5 mRNA in cartilage tissue（，n＝10）

*P＜0.05 vs sham group；＃P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs glucosamine sulfate group

Group β-catenin LRP5 Sham 1.00±0.00 1.00±0.00 Model 3.53±0.99* 4.34±0.89*Glucosamine sulfate 2.19±0.69*＃ 2.72±0.96*＃Youguipill low-dose 3.41±0.19*△ 4.29±0.64*△Youguipillmiddle-dose 3.33±0.75*△ 3.49±0.34*△Youguipill high-dose 2.08±0.85*＃ 2.14±1.11*＃

2.4 右歸丸對(duì)軟骨組織 DKK1、W ISP1、Wnt1、βcatenin和LRP5蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組、右歸丸低、中劑量組大鼠軟骨組織 WISP1、Wnt1、β-catenin和 LRP5蛋白質(zhì)表達(dá)增高，DKK1蛋白質(zhì)表達(dá)降低（P＜0.05）；與模型組比較，右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠 WISP1、Wnt1、β-catenin和 LRP5蛋白質(zhì)表達(dá)降低，DKK1蛋白質(zhì)表達(dá)升高（P＜0.05）；與硫酸氨基葡萄糖組比較，右歸丸低、中劑量組WISP1、Wnt1、βcatenin和LRP5蛋白質(zhì)表達(dá)增高，DKK1蛋白質(zhì)表達(dá)降低（P＜0.05，表 4、表 5，圖 2-6）。

Tab.4 Effects of Yougui pill on protein expressions of DKK1，WISP1 and Wnt1 in cartilage tissue（，n＝10）

Tab.4 Effects of Yougui pill on protein expressions of DKK1，WISP1 and Wnt1 in cartilage tissue（，n＝10）

*P＜0.05 vs sham group；＃P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs glucosamine sulfate group

Group DKK1 WISP1 Wnt1 Sham 0.89±0.17 0.96±0.06 0.91±0.24 Model 0.43±0.03*2.10±0.15*2.05±0.34*Glucosamine sulfate 0.99±0.18＃ 1.08±0.11＃ 1.42±0.45＃Youguipill low-dose 0.45±0.04*△ 1.87±0.36*△ 3.17±0.41*△Youguipillmiddle-dose 0.51±0.07*△ 1.69±0.15*△ 2.53±0.69*△Youguipill high-dose 0.76±0.05＃ 0.96±0.05＃ 1.00±0.24＃

Tab.5 Effects of Yougui pill on protein expressions ofβ-catenin and LRP5 in cartilage tissue（，n＝10）

Tab.5 Effects of Yougui pill on protein expressions ofβ-catenin and LRP5 in cartilage tissue（，n＝10）

*P＜0.05 vs sham group；＃P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs glucosamine sulfate group

Group β-catenin LRP5 Sham 0.78±0.11 1.00±0.24 Model 1.57±0.15* 3.49±0.21*Glucosamine sulfate 0.78±0.07＃ 1.00±0.04＃Youguipill low-dose 1.19±0.44*△ 2.60±0.64*△Youguipillmiddle-dose 1.28±0.49*△ 1.89±0.22*△Youguipill high-dose 0.71±0.11＃ 0.79±0.04＃

Fig.2 Effects of Youguipill on DKK1 protein expression in cartilage tissue

Fig.3 Effectsof YouguipillonWISP1 protein expression in cartilage tissue

Fig.4 Effects of Yougui pill onWnt1 protein expression in cartilage tissue

Fig．5 Effectof Youguipillonβ-catenin protein expression in cartilage tissue

Fig.6 Effects of Yougui pill on LRP5 protein expression in cartilage tissue

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路與胚胎軟骨發(fā)育，出生后軟骨發(fā)生、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞生成、軟骨內(nèi)成骨、骨重塑、骨折修復(fù)等密切相關(guān)，成為治療KOA的潛在靶點(diǎn)［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，KOA模型組大鼠軟骨組織DKK1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)降低，WISP1、Wnt1、β-catenin和 LRP5 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)增高，與以往的研究一致［12-16］。由此推測(cè) Wnt／βcatenin信號(hào)通路被異常激活參與了KOA發(fā)生、發(fā)展，是導(dǎo)致KOA軟骨破壞、滑膜損傷的主要原因。大劑量右歸丸干預(yù)后，能夠有效地促進(jìn)KOA模型組大鼠DKK1mRNA和蛋白表達(dá)，有效地抑制WISP1、Wnt1、β-catenin和 LRP5 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。推測(cè)，右歸丸可能是通過(guò)抑制經(jīng)典Wnt／β-catenin信號(hào)通路來(lái)達(dá)到治療KOA的目的。

另外，本實(shí)驗(yàn)病理形態(tài)學(xué)及Mankins評(píng)分結(jié)果顯示，模型組大鼠軟骨組織大量脫落，軟骨細(xì)胞數(shù)目增多，空泡變大，排列紊亂，出現(xiàn)簇聚現(xiàn)象，而右歸丸高劑量組大鼠軟骨細(xì)胞排列整齊，分布均勻，鈣化層軟骨細(xì)胞輕度成簇，潮線(xiàn)尚完整。模型組大鼠Mankin評(píng)分顯著高于假手術(shù)組，這與周穎燕等人的研究一致［17］。模型組及各干預(yù)組大鼠Mankin評(píng)分均高于假手術(shù)組，硫酸氨基萄葡糖組與右歸丸高劑量組大鼠Markin評(píng)分均低于模型組（P＜0.05），提示硫酸氨基萄葡糖與高劑量右歸丸治療膝骨性關(guān)節(jié)炎有效。

總之，高劑量右歸丸能較好地減輕KOA的關(guān)節(jié)軟骨病變，其具體的機(jī)制可能是通過(guò)抑制經(jīng)典Wnt／β-catenin信號(hào)通路中的 WISP1、Wnt1、β-catenin和LRP5關(guān)鍵因子來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

［1］ 李 波，姜 泉，鞏 勛，等.清熱活血方藥對(duì) CIA大鼠 Wnt信號(hào)通路成骨細(xì)胞相關(guān)因子的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2017，23（1）：75-77.

［2］ 董 寧，宮宇寶，楊 晨，等.探討膝骨性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中WISP-1的表達(dá)水平［J］.中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)衛(wèi)生管理，2016，11（9）：1233-1237.

［3］ 周明旺，李盛華，陳 嫻，等.膝骨性關(guān)節(jié)炎患者低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5基因與中醫(yī)體質(zhì)相關(guān)性研究［J］.西部中醫(yī)藥，2016，29（10）：5-7.

［4］ Blom AB，Brockbank SM，van Lent PL，et al.Involvement of theWnt signaling pathway in experimental and human osteoarthritis：prominent role ofWnt-induced signaling protein 1［J］.Arthritis Rheum，2009，60（2）：501-512.

［5］ 姜 旭，吳成愛(ài)，王 瑩，等.膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎中WISP-1調(diào)控機(jī)制的研究［J］.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2015，21（5）：537-540.

［6］ 王新革.針刺、艾灸聯(lián)合右歸丸治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎 102例［J］.中醫(yī)研究，2014，27（8）：62-63.

［7］ 吳 嵩，廖佑榮，吳和平.安絡(luò)痛膠囊聯(lián)合右歸丸治療陽(yáng)虛寒凝型膝骨性關(guān)節(jié)炎療效觀(guān)察［J］.藥物流行病學(xué)雜志，2016，25（6）：342-346.

［8］ De Souza RA，Xavier M，Mangueira NM，et al.Raman spectroscopy detection of molecular changes associated with two experimentalmodels of osteoarthritis in rats［J］.Lasers Med Sci，2014，29（2）：797-804.

［9］ Seo BK，Park DS，Baek YH.The analgesic effect of electroacupuncture on inflammatory pain in the ratmodelof collagenase-induced arthritis：mediation by opioidergic receptors［J］.Rheumatol Int，2013，33（5）：1177-1183.

［10］李登曉，徐 璇，朱 潔，等.滑膜炎膠囊對(duì)兔膝骨性關(guān)節(jié)炎組織病理學(xué)及 NO、SOD、COMP等的影響［J］.上海中醫(yī)雜志，2014，48（4）：86-90.

［11］Hoeppner LH，Secreto FJ，Westendorf JJ.Wntsignaling as a therapeutic target for bone disease［J］.ExpertOpin Ther Targets，2009，13（4）：485-496.

［12］Cawthorn WP，Bree AJ，Yao Y，et al.Wnt6，Wnt10a and Wnt10b inhibit adipogenesis and stimulate osteoblastogenesis through aβ-catenin-dependentmechanism［J］.Bone，2012，50（2）：477-489.

［13］Blom AB，Brockbank SM，van Lent PL，et al.Involvement of theWnt signaling pathway in experimental and human osteoarthritis：prominent role ofWnt-induced signaling protein 1［J］.Arthritis Rheum，2009，60（2）：501-512.

［14］ Lara-Castillo N，Johnson ML.LRP receptor family member associated bone disease［J］.Rev Endocr Metab Disord，2015，16（2）：141-148.

［15］ Qiu W，Chen L，Kassem M.Activation of non-canonical Wnt／JNK pathway byWnt3a is associated with differentiation fate determination of human bonemarrow stromal（mesenchymal）stem cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，413（1）：98-104.

［16］Cao Z，Liu R，Zhang H，etal.Osterix controls cementoblast differentiation through downregulation of Wnt-signaling via enhancing DKK1 expression［J］.Int J Biol Sci，2015，11（3）：335-344.

［17］周穎燕，徐偵雄，林潔華，等.熟地寄生壯骨方對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)的影響［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，32（4）：711-714.