西紅花水提物對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠血糖水平的影響*

江石平，沈 倩，陸 雨，晏永球，童應(yīng)鵬，王 平

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州310014）

糖尿?。╠iabetesmellitus，DM）是一種由遺傳和 環(huán)境因素相互作用引起的以慢性高血糖為特征的內(nèi)分泌代謝紊亂疾病。長期的高血糖和代謝紊亂導(dǎo)致全身組織器官，特別是眼、腎、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)的損害及功能障礙［1］，導(dǎo)致腎衰竭、視網(wǎng)膜病變、血管病變、神經(jīng)病變、足部壞疽等多種嚴(yán)重并發(fā)癥。糖尿病的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)至今尚無針對(duì)病因的有效治療手段。目前，臨床上治療糖尿病以注射胰島素和口服化學(xué)降糖藥物如雙胍類、磺尿類、α-糖苷酶抑制劑等為主［2］，但是這些藥物長期服用可致降糖作用失效，并且對(duì)肝、腎、腸道有較大的副作用?，F(xiàn)在越來越多的研究者把開發(fā)新的治療糖尿病藥物轉(zhuǎn)向天然產(chǎn)物或者功能性食品［3］，而且隨著人們對(duì)生活水平要求的提高，對(duì)食品營養(yǎng)健康和安全問題日益重視。我國功能性食品發(fā)展迅速，目前已經(jīng)發(fā)展到以具有明確量效和構(gòu)效為特點(diǎn)的第三代功能性食品?，F(xiàn)代藥理研究也表明，飲食干預(yù)對(duì)糖尿病的治療有積極作用。因此，從天然產(chǎn)物中開發(fā)功能性食品輔助治療糖尿病顯得極有意義。

西紅花，又名藏紅花、番紅花，為鳶尾科（Iridaceae）番紅花（crocus）屬植物番紅花（Crocus sativus L）的干燥柱頭，其產(chǎn)量極低，畝產(chǎn)量僅為1 kg左右，在國際市場上其售價(jià)約為6 000美元／公斤，被譽(yù)為“植物黃金”。西紅花作為一味名貴的傳統(tǒng)中藥，其藥用部位主要為花柱，味甘、性平，具有解郁安神、活血化瘀、清熱解毒之功效［4］。研究發(fā)現(xiàn)，地中海國家的人們由于經(jīng)常把西紅花當(dāng)食品來服用，其心臟病、心肌病、腫瘤、高血脂的發(fā)病率要比其他地區(qū)低［5］。文獻(xiàn)報(bào)道，伊朗西紅花具有降血糖作用［6］。課題組前期的化學(xué)成分指紋圖譜研究表明，中國產(chǎn)與伊朗產(chǎn)的西紅花相比存在較大差異［7］，國產(chǎn)西紅花的降血糖作用尚未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。因此，本文通過鏈脲佐菌素建立糖尿病小鼠模型，觀察國產(chǎn)西紅花水提物對(duì)其空腹血糖、血脂及胰腺組織的影響，旨在為將國產(chǎn)西紅花開發(fā)成功能性食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑、藥品與儀器

1.1.1 主要試劑與藥品 鏈脲佐菌素，由Sigma公司生產(chǎn)，杭州澤衡生物科技有限公司提供，批號(hào)：20161115；西紅花，浙江建德西紅花合作社提供；血糖（blood glucose，BG）測定試紙購于強(qiáng)生（上海）醫(yī)療器材有限公司；糖化血清蛋白（glycated serum protein，GSP）測定試劑盒、血清胰島素（insulin，INS）測定試劑盒購于南京建成生物科技有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-c）購于寧波美康生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器 TBA-40FR全自動(dòng)生化分析儀（東芝醫(yī)療系統(tǒng)株式會(huì)社）；Powerwave 340酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；Microc117微量離心機(jī)（美國Thermo公司）；XS205電子天平，Mettlertoledo生產(chǎn)；穩(wěn)豪型血糖儀，強(qiáng)生（上海）醫(yī)療器材有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR種小鼠，雄性，體重22～25 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：0277988，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。

1.3 糖尿病模型的建立與分組

將50只ICR雄性小鼠分籠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，禁食不禁水12 h，連續(xù)2 d 9：00腹腔注射鏈脲佐菌素（60mg／kg）。1周后測定小鼠空腹血糖，血糖值大于13.9 mmol／L視為造模成功。模型小鼠隨機(jī)分為模型（diabetesmodel，DM）組、二甲雙胍（metformin hydrochloride，MH）組、西紅花（saffron aqueous extract，SE）組，每組10只，另取10只正常小鼠作為對(duì)照（normal control，NC）組。SE組給予西紅花提取物（100mg／kg，用純凈水配置成 5 mg／ml，根據(jù)中華人民共和國藥典規(guī)定日服量1 g折算）灌胃［8］，西紅花水提物是由西紅花在50℃下經(jīng)超聲提取45 min后，蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得到。MH組給予鹽酸二甲雙胍（100 mg／kg，用純凈水配制 5 mg／kg）灌胃［9］，NC組和DM組灌胃生理鹽水（20 ml／kg）。各組連續(xù)灌胃6周。

1.4 指標(biāo)觀察與測定

每周記錄1次小鼠的飲水量、進(jìn)食量。實(shí)驗(yàn)第6周，每組動(dòng)物禁食6 h，用血糖儀測定空腹血糖。接著各組動(dòng)物均經(jīng)口灌胃葡萄糖2.0 g／kg，測定0、0.5、2 h的血糖值以測定動(dòng)物的糖耐量。實(shí)驗(yàn)最后摘眼球取血，常溫下3 500 r／min離心2次分離血清，得到的上清液分別用相應(yīng)的試劑盒測定TC、TG、HDL-c等指標(biāo)?？崭寡怯醚窃嚰垳y定，血清胰島素用ELISA法測定，糖化血清蛋白用果糖胺法測定。

1.5 組織學(xué)觀查

取胰臟，用10%中性福爾馬林固定，之后進(jìn)行石蠟包埋切片、HE染色，顯微鏡下觀察胰腺的病理組織學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組間在進(jìn)行方差分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行 q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 西紅花水提物對(duì)糖尿病小鼠一般特征、飲水量及進(jìn)食量影響

NC組小鼠精神狀態(tài)良好、毛色光亮，飲食、尿量正常，體重逐漸增加；DM組小鼠精神萎靡、反應(yīng)遲鈍，表現(xiàn)出明顯的多飲、多食、多尿癥狀。DM組小鼠的飲水量和進(jìn)食量較NC組明顯升高（P＜0.01）；MH組飲水量與進(jìn)食量較 DM組顯著降低（P＜0.05）；SE組飲水量較 DM組明顯降低（P＜0.05），進(jìn)食量與DM組無明顯差異，但呈下降趨勢（表1）。

Tab.1 Effects on the amountofwater drinking and food-intake in STZ induced diabeticmice（，n＝10）

Tab.1 Effects on the amountofwater drinking and food-intake in STZ induced diabeticmice（，n＝10）

NC：Normal control；DM：Diabetesmodel；MH：Metformin hydrochloride；SE：Saffron aqueous extract；STZ：Streptozotocin**P＜0.01 vs normal control group；＃P＜0.05 vs diabetic model group

Group Food（g／100 g） Water（ml／100 g ）NC 18.35±2.31 19.17±8.89 DM 71.35±8.13** 163.39±7.06**MH 57.64±11.61＃ 138.02±15.10＃SE 60.94±4.22 142.25±6.92＃

2.2 西紅花水提物對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖、血清胰島素、糖化血清蛋白的影響

結(jié)果表明：DM組小鼠的FBG、GSP較NC組顯著升高（P＜0.01），INS則明顯降低（P＜0.01）；與DM組比較，MH組 FBG和GSP均明顯降低（P＜0.05）；與 DM組比較，SE組 FBG顯著降低（P＜0.05），INS明顯升高（P＜0.05）；SE組，INS值優(yōu)于MH組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

Tab.2 Effect of saffron aqueous extract on FBG、INS and GSP levels in STZ induced diabeticmice（，n＝10）

Tab.2 Effect of saffron aqueous extract on FBG、INS and GSP levels in STZ induced diabeticmice（，n＝10）

NC：Normal control；DM：Diabetesmodel；MH：Metformin hydrochloride；SE：Saffron aqueous extract；FBG：Fasting blood glucose；INS：Insulin；GSP：Glycated serum protein**P＜0.01 vs normal control group；＃P＜0.05 vs diabetic model group

Group FBG（mmol／L） INS（m IU／L） GSP（mmol／L）2.34±0.36 NC 4.58±0.86 61.58±4.90 1.87±0.11 DM 27.67±3.42**33.83±4.16**2.56±0.69**MH 20.83±0.97＃ 38.32±2.83 2.11±0.15＃SE 21.06±4.17＃ 39.06±3.05＃

2.3 西紅花水提物對(duì)糖尿病小鼠糖耐量的影響

DM組灌胃葡萄糖后0 h、0.5 h、2 h的血糖值及線下曲線面積較NC組顯著升高（P＜0.01）；與DM組相比，SE組0.5 h、2 h血糖值有下降趨勢，但無顯著差異，線下曲線面積顯著降低（P＜0.01）；與 MH組相比，SE組2 h血糖和線下曲線面積有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

Tab.3 Effectof saffron aqueous extracton glucose tolerance in STZ induced diabeticmice（，n＝10）

Tab.3 Effectof saffron aqueous extracton glucose tolerance in STZ induced diabeticmice（，n＝10）

NC：Normal control；DM：Diabetesmodel；MH：Metformin hydrochloride；SE：Saffron aqueous extract；**P＜0.01 vs normal control group；＃＃P＜0.01 vs diabeticmodel group

Group Blood glucose level（mmol／LArea under the curve NC 4.58±0.86 14.66±3.13 7.52±0.95 21.45±3.84 DM 27.67±3.42** 32.33±2.59** 27.84±5.69** 60.68±6.75**MH 20.83±0.97＃＃ 31.87±0.74 29.37±2.19 58.37±4.29 SE 21.06±4.17＃＃ 31.57±3.08 23.26±4.99 52.71±6.19）0 h 0.5 h 2 h＃＃

2.4 西紅花水提物對(duì)糖尿病小鼠血脂的影響

DM組小鼠TC較NC組顯著升高（P＜0.01），TG和HDL-c顯著降低（P＜0.01）；與 DM相比，MH組TC顯著降低（P＜0.01）；與DM組相比，SE組 TC顯著降低（P＜0.01），HDL-c顯著升高（P＜0.05）；SE組與 MH組比較，TC、TG、HDL-c均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但HDL有升高的趨勢（表4）。

Tab.4 Effect of saffron aqueous extracton blood lipid in STZ induced diabeticmice（mmol／L，珋，n＝10）

Tab.4 Effect of saffron aqueous extracton blood lipid in STZ induced diabeticmice（mmol／L，珋，n＝10）

NC：Normal control；DM：Diabetesmodel；MH：Metformin hydrochloride；SE：Saffron aqueous extract；TC：Total cholesterol；TG：Triglyceride；HDL-c：High density lipoprotein cholesterol**P＜0.01 vs normal control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs diabeticmodel group

Group TC TG HDL-c NC 2.83±0.13 1.19±0.30 2.31±0.43 DM 3.66±0.39**0.42±0.19**1.78±0.27**MH 3.06±0.69＃＃ 0.46±0.25 1.93±0.33 SE 3.08±0.64＃＃ 0.37±0.22 2.14±0.35＃

2.5 西紅花水提物對(duì)糖尿病小鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響

胰腺組織進(jìn)行HE染色顯示：正常組胰島結(jié)構(gòu)和邊緣界限清晰，形狀呈圓形或橢圓形；胰島細(xì)胞數(shù)量較多，分布均勻，細(xì)胞核大小均一，胞漿豐滿，無血管擴(kuò)增現(xiàn)象。模型組胰島結(jié)構(gòu)破壞，胰島數(shù)量明顯減少；胰島細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核大小不一，血管出現(xiàn)增生現(xiàn)象。經(jīng)給藥治療后，SE組和MH組胰島細(xì)胞形態(tài)、分布及胰島邊緣界限均有所改善，而且SE組胰島細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞排列較規(guī)則（圖1）。

Fig.1 Results of HE staining in pancreas tissue of each group（HE×400）

3 討論

糖尿病是當(dāng)前對(duì)人類健康威脅最嚴(yán)重的非傳染性疾病之一。隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活水平不斷提高，我國的糖尿病發(fā)病率也在逐年上升。因此，從天然產(chǎn)物中開發(fā)功能性食品輔助治療糖尿病是一個(gè)理想方向。

目前實(shí)驗(yàn)性糖尿病模型主要是通過化學(xué)藥物誘導(dǎo)建立，常用的化學(xué)藥物有四氧嘧啶和鏈脲佐菌素。四氧嘧啶造模易受環(huán)境因素的影響，模型不夠穩(wěn)定，部分動(dòng)物能恢復(fù)正常血糖水平，而且對(duì)肝、腎組織有損害，死亡率高；鏈脲佐菌素可以選擇性地破壞胰島細(xì)胞，模型穩(wěn)定，并且對(duì)其他組織無影響。因此，本次實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射STZ誘導(dǎo)糖尿病模型。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究總結(jié)中藥西紅花具有廣泛的藥理活性，其主要的活性成分是西紅花苷、西紅花酸、藏花醛、西紅花苦苷等，其藥效主要有抗抑郁、抗腫瘤、抗心血管疾病、降血脂、抗氧化、減輕胰島素抵抗［10］。Maeda研究報(bào)道藏花醛是一種蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶新型抑制劑，可激活C2C12肌肉胰島素信號(hào)和改善糖尿病小鼠的糖耐量［11］。Samarghandian報(bào)道西紅花苷可以抑制糖尿病大鼠主動(dòng)脈的TNF-α和IL-6，減輕胰島素抵抗，提高小鼠的免疫力［12］。本研究結(jié)果顯示西紅花水提物能夠有效緩解糖尿病小鼠多飲多食的狀況，降低FBG，升高INS含量，有效改善胰腺病變。與當(dāng)前臨床使用的藥物二甲雙胍相比較，二者的降血糖效果基本相近，但是二甲雙胍長期使用容易導(dǎo)致肝腎功能受損及乳酸中毒等副作用［13］。西紅花作為一種食品，長期食用，尚未見有嚴(yán)重副作用的報(bào)道。因此，將其開發(fā)成一種輔助降血糖的功能性食品，用于糖尿病的輔助治療，具有一定的臨床優(yōu)勢。西紅花降血糖和修復(fù)胰島細(xì)胞的物質(zhì)基礎(chǔ)可能是西紅花苷，尚需進(jìn)一步研究確定。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病病人的血脂代謝和糖代謝密切關(guān)聯(lián)，當(dāng)糖代謝長期發(fā)生障礙時(shí)容易導(dǎo)致血脂代謝異常，進(jìn)而造成糖尿病、冠心病、高血壓等疾病。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，西紅花水提物可以顯著降低TC，升高HDL-c，西紅花水提物降血脂效果與二甲雙胍相比，無顯著性差異。其降血脂機(jī)制可能是西紅花苷抑制了促進(jìn)甘油三酯水解的胰脂肪酶，從而阻礙了脂肪和膽固醇的吸收［14］。大量研究表明，糖尿病的治療效果與血脂代謝水平直接相關(guān)。因此推測西紅花水提物可以通過改善糖尿病小鼠的血脂代謝紊亂降低血糖。

綜上所述，西紅花水提物對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠有降血糖、降血脂作用，并且對(duì)受損的胰腺組織有較好的修復(fù)作用，為西紅花開發(fā)成系列功能性食品提供了依據(jù)，但其物質(zhì)基礎(chǔ)以及作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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