大鼠雙下肢骨折合并失血對(duì)心肌細(xì)胞損傷的作用及其機(jī)制

李朝暉，張 穎，路 艷，陸慶明，謝曉華△

（解放軍總醫(yī)院南樓綜合外科，北京100853）

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全世界每年僅交通事故傷害就導(dǎo)致超過(guò)120萬(wàn)人死亡［1］。嚴(yán)重的創(chuàng)傷失血（traumatic hemorrhage）是可以直接威脅生命的危急重癥，也是中青年人重要的致死原因。當(dāng)機(jī)體受到嚴(yán)重創(chuàng)傷時(shí)，常因血容量丟失導(dǎo)致有效循環(huán)血量減少，引起嚴(yán)重微循環(huán)障礙，引發(fā)一系列延續(xù)性局部／全身創(chuàng)傷反應(yīng)，造成臟器功能不可逆損傷，包括心肌組織，但其確切發(fā)生機(jī)制尚不清楚。目前已知，在心肌損傷的發(fā)生過(guò)程中，心肌細(xì)胞凋亡具有重要意義。本文通過(guò)在體觀察及體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)研究，探討雙下肢骨折創(chuàng)傷失血反應(yīng)可否誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡反應(yīng)，以為下一步深入研究肢體創(chuàng)傷出血導(dǎo)致心肌損傷的發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 大鼠雙下肢骨折創(chuàng)傷失血模型的建立與分組

健康雄性SD大鼠20只，體重250～300 g（購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心），常規(guī)飼養(yǎng)條件下正常飲食飲水。大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和骨折創(chuàng)傷組（n＝10）。腹腔注射3%異戊巴比妥鈉（80 mg／kg體重）麻醉大鼠，使用自制重物墜落裝置致大鼠雙后肢股骨干粉碎性骨折。方法為：將大鼠固定在裝置底盤(pán)上，將重物升至固定高度后任其自由墜落，分別砸傷大鼠雙側(cè)股骨干致其閉合性粉碎性骨折，隨后尾動(dòng)脈抽血約10ml，1 h后雙倍液體（生理鹽水）回輸，包扎，固定［2］。全部大鼠分別在創(chuàng)傷發(fā)生后 0、1、2、4、8、12、16、24及 48 h尾動(dòng)脈取血，并于 48 h時(shí)處死大鼠，留取左室前壁心肌標(biāo)本，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 心肌細(xì)胞損傷模型

取正常大鼠心臟，經(jīng)Langendorff裝置灌注，從灌流液中分離心肌細(xì)胞，置CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)24 h后，加入創(chuàng)傷血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h，構(gòu)建心肌損傷模型。

1.3 血清炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的測(cè)定

在創(chuàng)傷后的不同時(shí)間點(diǎn)（創(chuàng)傷前和創(chuàng)傷后1、2、4、8、12、16、24及 48 h），分別取各組大鼠尾動(dòng)脈血液，2 000～3 000 r／min離心 20 min，取血清，以備ELISA法測(cè)定。

1.4 心肌組織HE染色

心肌組織取材、固定、脫水、石蠟包埋、切片，常規(guī)蘇木素-伊紅染色，中性樹(shù)膠封固。

1.5 心肌細(xì)胞凋亡的測(cè)定

取心肌細(xì)胞制備切片，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物，生物素標(biāo)記后，采用TUNEL法測(cè)定。

1.6 凋亡調(diào)控基因bcl-2／bax測(cè)定

取30mg心肌碾碎后，加入1 ml Trizol振搖，離心 12 000 r／min×15min（4℃），采用 RT-PCR法測(cè)定基因表達(dá)。引物序列為：baxForward 5’-3’TCGTCCATCGAGGATGACTTC， Reverse 5’-3’AACACCACAATTAAGGCAGGG；bcl-2Forward 5’-3’ACGTGGACCTCATGGAGTG，Reverse 5’-3’TGTGTATAGCAATCCCAGGCA

1.7 凋亡調(diào)控基因 bcl-2／bax蛋白表達(dá)的測(cè)定（Western blot）

取心肌碾磨，加入RIPA 300μl裂解30 min，4℃12 000 r／min離心，SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)液中反應(yīng)后轉(zhuǎn)膜，加入一抗后4℃孵育過(guò)夜，給予二抗結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)DAB顯色，測(cè)定Bcl-2／Bax蛋白的表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，所有資料均運(yùn)用GraphPad Prism醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行檢驗(yàn)，兩組等方差數(shù)據(jù)之間的比較采用成組t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠雙下肢骨折創(chuàng)傷失血對(duì)心肌損傷的影響

2.1.1 心肌組織HE染色 閱片發(fā)現(xiàn)，骨折創(chuàng)傷失血反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致心肌組織發(fā)生一定程度的損傷，心肌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，排列不規(guī)則，腫脹明顯，伴有大量巨噬細(xì)胞聚集（圖1，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅳ）。

2.1.2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)TUNEL染色 實(shí)驗(yàn)表明，加入創(chuàng)傷血清進(jìn)行心肌細(xì)胞培養(yǎng)后，能夠復(fù)制創(chuàng)傷模型，創(chuàng)傷組培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中出現(xiàn)大量核染成棕褐色的細(xì)胞，此即為凋亡的心肌細(xì)胞（圖2，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅳ）。對(duì)照組凋亡指數(shù)為3.65±0.81，創(chuàng)傷組凋亡指數(shù)為 27.47±1.83，兩組有明顯差異（P＜0.01）。

2.2 大鼠雙下肢骨折創(chuàng)傷失血對(duì)血清炎性因子含量的影響

檢測(cè)大鼠骨折創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)血清炎性因子含量的變化，發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷后短時(shí)期（8 h）內(nèi)血清IL-2水平急劇下降，8 h降至最低值（74.22±8.90 pg／ml，n＝6），較對(duì)照組（214.41±11.99 pg／ml，n＝10）顯著減低 （P＜0.05）；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，血清IL-2的水平開(kāi)始緩慢增加，一直到創(chuàng)傷后48 h大鼠血清IL-2水平仍顯著低于對(duì)照組水平（P＜0.05）。

在骨折失血后，創(chuàng)傷組大鼠血清IL-6、IL-10水平開(kāi)始急劇升高，創(chuàng)傷后4 h達(dá)到峰值，分別為（455.70±14.31pg／ml，n＝6）和（189.71±8.05 pg／ml，n＝6），較對(duì)照組（分別為 203.75±4.98 pg／ml，n＝10和 64.52±8.36 pg／ml，n＝10）顯著增加（P＜0.05，P＜0.05）。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，血清 IL-6、IL-10水平呈逐步下降趨勢(shì)，創(chuàng)傷后16～24 h恢復(fù)至對(duì)照組水平。

在骨折創(chuàng)傷失血后的早期，創(chuàng)傷組TNF-α表達(dá)水平迅速升高，創(chuàng)傷后1 h即可達(dá)到最高值（58.22±3.51 pg／ml，n＝6），較對(duì)照組（45.24±5.94 pg／ml，n＝10）顯著升高（P＜0.05），隨后即呈快速下降趨勢(shì)（圖 3）。

2.3 雙下肢骨折創(chuàng)傷失血對(duì)大鼠心肌bcl-2／bax表達(dá)的影響

骨折創(chuàng)傷發(fā)生后，Western blot方法檢測(cè)顯示，心肌bax蛋白表達(dá)量增高，而bcl-2蛋白表達(dá)量下調(diào)。

RT-PCR檢查結(jié)果則提示，對(duì)照組bax基因相對(duì)表達(dá)量為（0.98±0.03，n＝10），創(chuàng)傷組為（3.96±0.21，n＝6），兩組差異顯著（P＜0.01）。而創(chuàng)傷組bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量為（0.50±0.08，n＝6），較之對(duì)照組（1.01±0.05，n＝10）明顯下調(diào)（P＜0.01，圖 4）。

Fig.3 Changes in contentofserum associated inflammatory factors in rats

Fig.4 Changes of bax／bcl-2 expression in ratmyocardial tissue 1：Control group；2：Trauma group

2.4 心肌細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定凋亡調(diào)控基因bax／bcl-2表達(dá)的變化

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，加入創(chuàng)傷血清培養(yǎng)的損傷心肌細(xì)胞中，bcl-2蛋白表達(dá)量減少，而bax蛋白表達(dá)量增加。

進(jìn)一步以 RT-PCR方法檢測(cè)基因 bax／bcl-2表達(dá)。結(jié)果顯示：對(duì)照組心肌細(xì)胞中促凋亡基因bax的相對(duì)表達(dá)量為（0.99±0.09），而創(chuàng)傷組為（3.95±0.28），兩者差異顯著（P＜0.01）。而對(duì)照組抑制凋亡基因 bcl-2的相對(duì)表達(dá)量為（0.99±0.08），創(chuàng)傷組為（0.56±0.05），二者相差具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖 5）。

Fig.5 Changes of bax／bcl-2 expression in cultured cardiomyocytes

3 討論

目前認(rèn)為，創(chuàng)傷所導(dǎo)致的心肌損傷機(jī)制，與炎性因子介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激損傷、能量代謝障礙、鈣超載等諸多因素有關(guān)，這些因素之間還存在相互鏈接，交織成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。本研究通過(guò)ELISA檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷后 IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α均呈現(xiàn)時(shí)間依賴性規(guī)律的變化，首先是TNF-α在創(chuàng)傷后極短時(shí)間內(nèi)達(dá)峰值（1 h內(nèi)），然后緩慢下降；隨即IL-6、IL-10升高，4 h左右達(dá)到峰值，然后逐步下降；而IL-2呈現(xiàn)相反的改變，創(chuàng)傷后急劇下降，4～8 h時(shí)降至谷底，隨后緩慢回升。這樣的變化規(guī)律，與其他學(xué)者的研究報(bào)導(dǎo)是一致的［3］。這說(shuō)明創(chuàng)傷可使機(jī)體產(chǎn)生和釋放一系列炎癥相關(guān)因子，通過(guò)級(jí)聯(lián)放大產(chǎn)生“全身炎癥瀑布效應(yīng)”，造成心肌受損。如IL-6和TNF-α，可引起機(jī)體多種炎性介質(zhì)的釋放失調(diào)［4］，TNF-α表達(dá)水平的持續(xù)增高既可直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜受損、破壞，同時(shí)還可以募集其他炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，直至心肌發(fā)生壞死、纖維化。而IL-6則可以通過(guò)氧化應(yīng)激機(jī)制促使心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡［5］，TNF-α還可以增加IL-6的表達(dá)，產(chǎn)生協(xié)同作用，加速心肌細(xì)胞損傷。IL-10通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制直接／間接降低凋亡消音蛋白的活性，上調(diào)機(jī)體對(duì)創(chuàng)傷損害的敏感性閾值，避免凋亡發(fā)生［6］。

HE染色發(fā)現(xiàn)，大鼠雙下肢骨折創(chuàng)傷失血反應(yīng)可以導(dǎo)致心肌不同程度受損，心肌細(xì)胞腫大，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而且，培養(yǎng)心肌細(xì)胞TUNEL染色證實(shí)，創(chuàng)傷可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。對(duì)于心肌細(xì)胞凋亡的認(rèn)知曾有爭(zhēng)議。曾有人認(rèn)為，心肌細(xì)胞是一種最終分化的細(xì)胞，其死亡過(guò)程應(yīng)為壞死，一旦壞死發(fā)生則不可再生。但隨著凋亡相關(guān)研究的逐步深入，心肌細(xì)胞凋亡這一現(xiàn)象得到普遍的認(rèn)同。心肌缺血、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌病變等心血管疾患的不斷發(fā)展均可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而加重心臟功能受損；反之，心肌細(xì)胞凋亡又可以加速心臟疾患的進(jìn)程，累及心功能不斷下降。資料表明，壓力過(guò)負(fù)荷所致心衰過(guò)程中，常常伴有心肌細(xì)胞肥大，而細(xì)胞數(shù)量減少，凋亡系這種量減少過(guò)程的主要原因；即使是極小量的減少，也極可能會(huì)明顯惡化心力衰竭的進(jìn)程。甚至有研究提示，單一細(xì)胞死亡，通過(guò)與鄰近細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，也會(huì)對(duì)整個(gè)心臟功能產(chǎn)生影響［7］。體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)觀察到，凋亡在短時(shí)間內(nèi)（2 h）即可發(fā)生［8］；而在體研究表明，凋亡的發(fā)生可能需要4～24 h［9，10］，甚至更長(zhǎng)。相對(duì)于某一固定的時(shí)間點(diǎn)，所測(cè)得的凋亡反應(yīng)僅能反映相對(duì)固定的短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，只有歷經(jīng)足夠長(zhǎng)的時(shí)間過(guò)程檢測(cè)，才可能符合機(jī)體心臟的實(shí)際狀況［11］。

心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Bcl-2／Bax是一對(duì)最有效也是最關(guān)鍵的凋亡蛋白，具有非常重要的意義。Bax分布廣泛，細(xì)胞膜、細(xì)胞漿及細(xì)胞核中都有它的定位，如在線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核周膜等處［12］。在各種凋亡誘發(fā)信號(hào)介導(dǎo)下，游離于胞漿中的Bax發(fā)生遷移，與Bcl-2異源寡聚化為Bax-Bcl-2，可以使Bcl-2的活性受到抑制；同時(shí)還可以直接同源寡聚化為Bax-Bax，促進(jìn)Cyt-c釋放入胞漿，松解凋亡激活因子Apaf-1與 Bcl-2的耦合，進(jìn)而觸發(fā)凋亡［13］。與之相反，Bcl-2的主要作用是抑制心肌細(xì)胞凋亡，是公認(rèn)的長(zhǎng)命基因，通過(guò)C末端插入域定位于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核周膜等處，能夠封閉Bax激活的mPTP孔道，進(jìn)而阻斷凋亡［14］。研究表明，細(xì)胞內(nèi) Bcl-2／Bax的比例變化，對(duì)于是否產(chǎn)生凋亡傾向具有關(guān)鍵意義，直接反映心肌受損程度［15］。一般情況下，Bcl-2／Bax處于穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，一旦機(jī)體受到刺激，通過(guò)信號(hào)傳遞打破這種動(dòng)態(tài)平衡，將產(chǎn)生截然相反的結(jié)局。因此，Bax／Bcl-2的比例可以作為檢測(cè)凋亡的一個(gè)很重要的指標(biāo)，如出現(xiàn)Bax表達(dá)增加而B(niǎo)cl-2表達(dá)下調(diào)，則促進(jìn)凋亡；反之，則可抑制凋亡反應(yīng)。有資料顯示，心肌缺血初始階段，p38MAPK及其下游通道活化，促進(jìn)Bax易位至線粒體，進(jìn)而啟動(dòng)凋亡；這一過(guò)程涉及凋亡激活因子Apaf-1，以及死亡蛋白（caspase-9）的易化過(guò)程；Bcl-2通過(guò)維持線粒體膜的完整性，阻斷該反應(yīng)過(guò)程［16，17］。

綜上，本研究表明，大鼠雙下肢骨折創(chuàng)傷失血反應(yīng)，無(wú)論在體內(nèi)或體外，均可以誘導(dǎo)凋亡調(diào)控基因Bcl-2／Bax表達(dá)比例發(fā)生變化，呈現(xiàn)促凋亡發(fā)生樣改變，導(dǎo)致遠(yuǎn)隔臟器的損傷。通過(guò)一系列細(xì)胞因子介導(dǎo)，最終可以引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，造成更加嚴(yán)重的傷害，但其確切傳遞機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。針對(duì)性地阻斷其傳導(dǎo)通路，或上調(diào)其保護(hù)性應(yīng)答機(jī)制，可能會(huì)為臨床提高危重創(chuàng)傷的救治、避免心肌損傷的發(fā)生提供一定的幫助。

［1］ Wang ZG.Road traffic injuries［J］.JMed Col PLA，2005，20（1）：1-3.

［2］ Michael F，Hagen A，Christian Z，etal.Experimental traumamodels：an update［J］.J Biomed Biotechnol，2011，2011（1）：636-650.

［3］ Ayala A，Perrin MM，Meldrum DR，et al.Hemorrhage induces an increase in serum TNF which is not associated with elevated levels of endotoxin［J］.Cytokine，1990，2（3）：170-174.

［4］ 趙自剛，張 靜，牛春雨.多器官功能障礙綜合征發(fā)病機(jī)制的某些研究進(jìn)展［J］.微循環(huán)學(xué)雜志，2004，14（3）：80-83.

［5］ Pudil R，Pidrman V，Krejsek J，et al.The effect of trimetazidine on c-reactive protein，cytokines and adhesion molecules in the course ofacutemyocardial infarction［J］.Acta Medica，2001，44（4）：135-140.

［6］ GrilliM，Barbieri I，Basudev H，et al.Interleukin-10modulates neuronal threshold of vulnerability to ischaemic damage［J］.Eur JNeurosci，2000，12（7）：2265-2272.

［7］ Teiger E，Than VD，Richard L，etal.Apoptosis in pressure overload induced hearthypertrophy in the rat［J］.JClin Invest，1996，97（12）：2891-2897.

［8］ Oberhammer FA，Pavelka M，Sharma S，et al.Induction of apoptosis in cultured hepatocytes and in regressing liver by transforming growth factor（beta）1［J］.PNAS，1992，89（12）：5408-5412.

［9］ Kang PM，Izumo S.Apoptosis and heart failure：a critical review of the literature［J］.Circ Res，2000，86（11）：1107-1113.

［10］Lim H，F(xiàn)allavollita JA，Hard R，et al.Profound apoptosismediated regionalmyocyte loss and compensatory hypertrophy in pigswith hibernatingmyocardium［J］.Circulation，1999，100（23）：2380-2386.

［11］Zhao ZQ，Velez DA，Wang NP，et al.Progressively developed myocardial apoptotic cell death during late phase of reperfusion［J］.Apoptosis，2001，6（4）：279-290.

［12］Barclay LA，Wales TE，Garner TP，etal.Inhibition of proapoptotic Bax by a noncanonical interaction mechanism［J］.Mol Cell，2015，57（5）：873-886.

［13］Hoetelmans R，van Slooten HJ，Keijzer R，et al.Bcl-2 and Bax proteins are present in interphase nuclei ofmammalian cells［J］.Cell Death Differ，2000，7（4）：384-392.

［14］Chang SF，Sun YY，Yang LY，etal.Bcl-2 gene family expression in the brain of rat offspring after gestational and lactational dioxin exposure［J］.Ann NYAcad Sci，2005，1042：471-480.

［15］ Prince PS，Dhanasekar K，Rajakumar S.Preventive effects of vanillic acid on lipids，bax，bcl-2 and myocardial infarct size on isoproterenol-inducedmyocardial infarcted rats：a biochemical and in vitro study.［J］.Cardiovasc Toxicol，2011，11（1）：58-66.

［16］Capano M，Crompton M.Bax translocates tomitochondria of heart cells during simulated ischaemia：involvement of AMP-activated and p38 mitogen-activated protein kinases［J］.Biochem J，2006，395（1）：57-64.

［17］Wang X，Welsh N.Bcl-2maintains themitochondrialmembrane potential，but fails to affect production of reactive oxy-gen species and endoplasmic reticulum stress，in sodium palmitate-induced beta-cell death［J］.Ups J Med Sci，2014，119（4）：306-315.