• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白引起綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化

    2018-06-07 07:40:38徐斯日古楞李慧萍劉淑英
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2018年5期
    關(guān)鍵詞:滋養(yǎng)層膜蛋白真核

    趙 娟,徐斯日古楞,李慧萍,劉淑英,2*

    (1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,呼和浩特 010018;2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,呼和浩特 010018)

    綿羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus, JSRV)是引起綿羊肺腺瘤病(ovine pulmonary adenocarcinoma,OPA)的病原,該病是綿羊肺分泌上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的一種傳染性肺癌[1-2]。綿羊肺腺瘤病毒含有標(biāo)準(zhǔn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因gag、pro、pol和env[3]。研究報(bào)道在羔羊的接種試驗(yàn)中,該病毒能夠在10 d內(nèi)迅速誘導(dǎo)腫瘤,類(lèi)似于攜帶致癌基因的急性轉(zhuǎn)化逆轉(zhuǎn)錄病毒[4]。JSRV-env基因主要編碼病毒的囊膜蛋白(Env),具有表面蛋白(surface protein, SU)和跨膜蛋白(transmembrane protein, TM)兩個(gè)功能區(qū)[5]。SU負(fù)責(zé)與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合,并且TM負(fù)責(zé)感染時(shí)病毒與細(xì)胞膜的融合。研究表明JSRV-env可作為致癌基因,單獨(dú)的JSRV Env蛋白可以轉(zhuǎn)化小鼠NIH3T3細(xì)胞[6]、大鼠208F細(xì)胞[7]、雞成纖維細(xì)胞[8]和犬上皮細(xì)胞[9],并且可以在小鼠[10-11]和綿羊[12]中誘導(dǎo)肺癌,因此,JSRV的囊膜蛋白(Env)具有引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化而致癌的罕見(jiàn)特征,但Env的致癌作用機(jī)制仍未解析清楚。

    在綿羊基因組中存在大約27拷貝的與綿羊肺腺瘤病毒(JSRV)基因結(jié)構(gòu)非常相似的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(enJSRV)[13],為了與之區(qū)別,JSRV也稱(chēng)外源性綿羊肺腺瘤病毒(exogenous Jaagsiekte sheep retrovirus,exJSRV)。研究發(fā)現(xiàn),exJSRV和enJSRV之間的序列除了三個(gè)區(qū)域的變異(VR1、VR2和VR3)以外具有高度同源性,其中VR3則映射到env基因部分,即TM蛋白的細(xì)胞質(zhì)尾區(qū)[14],而TM區(qū)的YXXM基序在所有轉(zhuǎn)化的JSRV中是必需的,但enJSRV的Env蛋白中不存在YXXM基序功能區(qū),也無(wú)轉(zhuǎn)化功能[15]。而且缺失和/或突變?cè)囼?yàn)已經(jīng)證明TM蛋白的細(xì)胞質(zhì)尾區(qū)是轉(zhuǎn)化必不可少的[16-17]。哺乳動(dòng)物的胎盤(pán)具有物質(zhì)交換、分泌激素和防御等重要功能,在胎盤(pán)中行使這些功能的主要細(xì)胞類(lèi)型是滋養(yǎng)層細(xì)胞[18]。本實(shí)驗(yàn)室從正常胎盤(pán)組織中分離培養(yǎng)了一株永生化的滋養(yǎng)層細(xì)胞系用于細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。因此本研究利用體外培養(yǎng)的永生化綿羊胎盤(pán)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞,轉(zhuǎn)染重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1/exJSRV-env,用平板克隆以及軟瓊脂集落形成試驗(yàn),觀察細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞增殖情況,為進(jìn)一步探討exJSRV Env的致癌功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    真核表達(dá)載體pEGFP-C1由本實(shí)驗(yàn)室保存;重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1/exJSRV-env以及pEGFP-C1/enJSRV-env由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建;永生化綿羊胎盤(pán)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室建立。

    1.2 主要試驗(yàn)試劑

    真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTMLTX & PLUS購(gòu)自Invitrogen公司;限制性?xún)?nèi)切酶KpnⅠ、BamHⅠ、HindⅢ和ApaⅠ購(gòu)自TaKaRa公司;DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、Opti-MEM培養(yǎng)液,0.25%胰蛋白酶購(gòu)自GIBCO公司;胎牛血清(FBS)購(gòu)自澳洲;瓊脂糖購(gòu)自Invitrogen公司。

    1.3 真核表達(dá)重組質(zhì)粒的鑒定

    成功構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1/exJSRV-env以及pEGFP-C1/enJSRV-env。重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1/exJSRV-env和pEGFP-C1/enJSRV-env分別用限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ、ApaⅠ和KpnⅠ、BamHⅠ水浴酶切,酶切結(jié)束后利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

    1.4 永生化綿羊胎盤(pán)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定

    將永生化綿羊胎盤(pán)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞復(fù)蘇,放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待長(zhǎng)到80%時(shí)傳代。轉(zhuǎn)染的前一天,用胰蛋白酶消化并將細(xì)胞接種在六孔板內(nèi),加入2 mL無(wú)雙抗(青鏈霉素)的含20% FBS完全培養(yǎng)基。細(xì)胞密度應(yīng)在轉(zhuǎn)染當(dāng)天匯合度應(yīng)達(dá)到80%左右。按照 LipofectamineTMLTX & PLUS轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pEGFP-C1/exJSRV-env、pEGFP-C1/enJSRV-env以及空載體pEGFP-C1,不作處理的正常細(xì)胞作為空白對(duì)照組。48 h后進(jìn)行免疫熒光照相,以及后續(xù)軟瓊脂集落形成試驗(yàn)和平板克隆試驗(yàn)。

    1.5 軟瓊脂集落形成試驗(yàn)

    轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打,作活細(xì)胞計(jì)數(shù),然后根據(jù)試驗(yàn)要求做梯度倍數(shù)稀釋。用1.2%瓊脂糖溶液均勻鋪制細(xì)胞6孔板底層,置CO2溫箱中備用。將0.7%瓊脂糖溶液與約3 000個(gè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞充分混勻,注入鋪有瓊脂糖底層的平皿中,置入37 ℃、5% CO2溫箱中,培養(yǎng)10~14 d。顯微鏡下觀察集落形成。

    1.6 平板克隆試驗(yàn)

    對(duì)各組轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),以每皿50個(gè)和100個(gè)細(xì)胞放入六孔板中,加入3 mL含20% FBS的完全培養(yǎng)基,每組做3組平行試驗(yàn),置入37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10~14 d。每3 d換一次培養(yǎng)液。待肉眼可見(jiàn)的克隆形成時(shí),用4%多聚甲醛固定并用結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù),計(jì)算克隆形成率(克隆形成率=克隆數(shù)/接種數(shù)×100%),并用SPSS軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    2 結(jié) 果

    2.1 pEGFP-C1/exJSRV-env和pEGFP-C1/enJSRV-env質(zhì)粒酶切鑒定

    將實(shí)驗(yàn)室保存的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1/exJSRV-env和pEGFP-C1/enJSRV-env經(jīng)單、雙酶切鑒定(圖1),結(jié)果顯示質(zhì)粒正確,可以繼續(xù)使用。

    2.2 綿羊胎盤(pán)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染效率

    綿羊胎盤(pán)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1/exJSRV-env和pEGFP-C1/enJSRV-env48 h后,熒光顯微鏡下觀察,結(jié)果顯示,在綿羊胎盤(pán)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)彌漫大量的綠色熒光蛋白(圖2A、B),表明重組真核表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染綿羊胎盤(pán)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞,可用于后續(xù)研究。

    2.3 軟瓊脂集落形成試驗(yàn)

    轉(zhuǎn)染重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1/exJSRV-env的綿羊胎盤(pán)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞接觸抑制性消失,且能夠在軟瓊脂上形成集落(圖3A),說(shuō)明綿羊胎盤(pán)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化;而轉(zhuǎn)染內(nèi)源性病毒的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1/enJSRV-env、空載體pEGFP-C1以及空白對(duì)照組細(xì)胞均不能在瓊脂上形成集落(圖3B、C、D),說(shuō)明綿羊胎盤(pán)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞并未發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。

    M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL5000); 1、2. HindⅢ單酶切pEGFP-C1/exJSRV-env重組質(zhì)粒; 3、4. Hind Ⅲ和ApaⅠ雙酶切pEGFP-C1/exJSRV-env重組質(zhì)粒; 5. HindⅢ單酶切pEGFP-C1空質(zhì)粒; 6. KpnⅠ單酶切pEGFP-C1空質(zhì)粒; 7、8. KpnⅠ單酶切pEGFP-C1/enJSRV-env重組質(zhì)粒; 9、10. KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切pEGFP-C1/enJSRV-env重組質(zhì)粒M. DNA marker (DL5000); 1, 2. Digested product of pEGFP-C1/exJSRV-env with HindⅢ; 3, 4. Digested product of pEGFP-C1/exJSRV-env with HindⅢ and ApaⅠ; 5. Digested product of pEGFP-C1 with HindⅢ; 6. Digested product of pEGFP-C1 with KpnⅠ; 7, 8. Digested product of pEGFP-C1/enJSRV-env with KpnⅠ; 9, 10. Digested product of pEGFP-C1/enJSRV-env with Kpn Ⅰ and BamHⅠ圖1 重組質(zhì)粒單、雙酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid by single and double restriction endonuclease digestion

    2.4 平板克隆試驗(yàn)

    統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)染 pEGFP-C1/exJSRV-env的細(xì)胞、轉(zhuǎn)染pEGFP-C1/enJSRV-env、pEGFP-C1以及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞形成的克隆數(shù)(圖4),克隆形成率結(jié)果經(jīng)SPSS軟件分析,轉(zhuǎn)染pEGFP-C1/exJSRV-env的綿羊胎盤(pán)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的克隆形成率極顯著高于其他三組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖5),轉(zhuǎn)染pEGFP-C1/enJSRV-env以及pEGFP-C1的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞之間無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖5)。

    3 討 論

    目前,綿羊肺腺瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒引起綿羊肺腺瘤病的致瘤轉(zhuǎn)化機(jī)制尚不清楚。M. Borobia等[19]將攜帶雙鏈DNA的JSRV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到NIH 3T3細(xì)胞中導(dǎo)致轉(zhuǎn)化,證明JSRV攜帶致癌基因。將pCMV2JS21真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH 3T3細(xì)胞,形成轉(zhuǎn)化灶,而轉(zhuǎn)染對(duì)照組pCDNA3.1(-)質(zhì)粒未有轉(zhuǎn)化灶形成[19]。本實(shí)驗(yàn)室張宇飛等[20]證實(shí)將重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1/exJSRV-env轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中也引起惡性轉(zhuǎn)化。以上研究結(jié)果均證明JSRV囊膜蛋白(Env)是腫瘤形成的主要因素。

    A. 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C1/exJSRV-env 48 h后的綿羊胎盤(pán)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞;B. 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C1/enJSRV-env 48 h后的綿羊胎盤(pán)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞A. The ovine trophoblast cells transfected with recombinant plasmid pEGFP-C1/exJSRV-env after 48 h; B. The ovine trophoblast cells transfected with recombinant plasmid pEGFP-C1/enJSRV-env after 48 h圖2 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后的綿羊胎盤(pán)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞Fig.2 The ovine trophoblast cells transfected with recombinant plasmid

    A.轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C1/exJSRV-env 的細(xì)胞;B.轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C1/enJSRV-env 的細(xì)胞;C.轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞;D.空白對(duì)照A. Cells tranfected with recombinant plasmid pEGFP-C1/exJSRV-env; B.Cells transfected with recombinant plasmid pEGFP-C1/enJSRV-env; C. Cells transfected with plasmid pEGFP-C1; D. Blank control圖3 集落形成試驗(yàn)(×100)Fig.3 Colony growth in soft agar(×100)

    A. 每孔50個(gè)細(xì)胞;B. 每孔100個(gè)細(xì)胞;1.未轉(zhuǎn)染的綿羊胎盤(pán)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞; 2.轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-C1的細(xì)胞; 3.轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C1/enJSRV-env的細(xì)胞; 4.轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C1/exJSRV-env的細(xì)胞A. 50 cells per well; B. 100 cells per well; 1. The sheep trophoblast cells without treatment; 2. Cells transfected with pEGFP-C1; 3. Cells transfected with pEGFP-C1/enJSRV-env; 4. Cells transfected with pEGFP-C1/exJSRV-env圖4 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞平板克隆試驗(yàn)Fig.4 Cells plate cloning experiments after transfection

    各組間比較,***.P<0.01Asterisks indicate significand differences (***.P<0.01) when compared among the different groups圖5 克隆形成率柱狀圖Fig.5 Cloning efficiency histograms

    3.1 Env引起綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化

    為了更好地闡述JSRV Env蛋白的轉(zhuǎn)化機(jī)制,利用重組質(zhì)粒pEGFP-C1/exJSRV-env轉(zhuǎn)染綿羊胎盤(pán)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞,通過(guò)軟瓊脂集落形成試驗(yàn)對(duì)該細(xì)胞發(fā)生的形態(tài)變化進(jìn)行分析。正常的絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞不能在半固體軟瓊脂上懸浮生長(zhǎng)形成集落,而惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞獲得了錨定非依賴(lài)性生長(zhǎng)能力可以生長(zhǎng)形成集落。而本研究顯示轉(zhuǎn)染重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1/exJSRV-env的細(xì)胞形成集落,而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C1/enJSRV-env、空質(zhì)粒pEGFP-C1以及空白對(duì)照組細(xì)胞卻不能形成集落,這提示exJSRV囊膜蛋白(Env)促使綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。M. Borobia等[19]研究顯示將缺失gag、pro、pol編碼序列的表達(dá)質(zhì)粒pCMVJS21(pCMVJS21ΔGP,唯一完整的基因是env)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)化灶,并且將exJSRV的細(xì)胞質(zhì)尾區(qū)與enJSRV交換的嵌合體卻不能轉(zhuǎn)化NIH3T3細(xì)胞,說(shuō)明引起細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的必需是完整的囊膜蛋白,而本試驗(yàn)所采用的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1/exJSRV-env就是完整表達(dá)了SU 和TM的囊膜蛋白所發(fā)揮的作用。

    3.2 Env對(duì)綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖的影響

    細(xì)胞增殖是檢測(cè)分裂中的細(xì)胞數(shù)量或者細(xì)胞群體發(fā)生的變化,克隆形成率反應(yīng)細(xì)胞的增值能力。據(jù)報(bào)道地方性鼻病毒(ENTV)[21]、禽血管瘤病毒(AHV)[22]的囊膜蛋白(Env)也具有類(lèi)似的致癌功能,AHV對(duì)NIH3T3細(xì)胞的增殖作用也通過(guò)AHVenv基因介導(dǎo),通過(guò)將AHVenv基因克隆到基于MuLV的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中證明了這一點(diǎn),并且用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和表型改變[22]。S. L. Liu等[9]將JSRV Env轉(zhuǎn)染犬腎細(xì)胞(MDCK),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖要顯著高于對(duì)照組。enJSRV-env對(duì)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞融合也有一定的促進(jìn)作用[23]。本實(shí)驗(yàn)室杜方原等[24]將重組質(zhì)粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env轉(zhuǎn)染到NIH3T3細(xì)胞也發(fā)生細(xì)胞增殖。而本研究中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C1/exJSRV-env的細(xì)胞平板克隆試驗(yàn)的克隆形成率也顯著高于對(duì)照組,說(shuō)明了細(xì)胞在exJSRV囊膜蛋白(Env)的作用下,細(xì)胞發(fā)生增殖,與上述研究結(jié)果一致。目前研究表明在exJSRV囊膜蛋白致癌過(guò)程中可能有P53蛋白、表面蛋白A(surfactant protein A, SP-A)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、JSRV基質(zhì)蛋白(JSRV matrix protein, MA)[25]、鋅指蛋白111(Zinc Finger Protein, Zfp111)[26]的參與,以及囊膜蛋白致癌過(guò)程也與細(xì)胞自噬[27]和信號(hào)通路[28]相關(guān),本試驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)的研究提供了理論依據(jù)。

    4 結(jié) 論

    exJSRV囊膜蛋白能夠引起綿羊胎盤(pán)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞增殖。

    參考文獻(xiàn)(References):

    [1] ZHANG Y F, SHI J, LIU S Y. Recent advances in the study of active endogenous retrovirus envelope glycoproteins in the mammalian placenta[J].VirolSin, 2015, 30(4):239-248.

    [2] HULL S, LIM J, HAMIL A, et al. Analysis ofJaagsiektesheepretrovirus (JSRV) envelope protein domains in transformation[J].VirusGenes, 2012, 45(3):508-517.

    [3] HOFACRE A, FAN H. Jaagsiekte sheep retrovirus biology and oncogenesis[J].Viruses, 2010, 2(12):2618-2648.

    [4] LIU S L, MILLER A D. Oncogenic transformation by theJaagsiektesheepretrovirus envelope protein[J].Oncogene, 2007, 26(6):789-801.

    [5] DEMARTINI J C, BISHOPP J V, ALLEN T E, et al.Jaagsiektesheepretrovirus proviral clone JSRVJS7,derived from the JS7 lung tumor cell line,induce ovine pulmonary carcinoma and is integrated into the surfactant protein A gene[J].JVirol, 2001, 75(9):4239-4246.

    [6] YOUSSEF G,WALLACE W A H,DAGLEISH M P,et al.Ovine pulmonary adenocarcinoma:a large animal model for human lung cancer[J].ILARJ,2015,56(1):99-115.

    [7] RAI S K, DUH F M,VIGDOROVICH V, et al. Candidate tumor suppressor HYAL2 is a glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored cell-surface receptor for Jaagsiekte sheep retrovirus, the envelope protein of which mediates oncogenic transformation[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2001, 98(8):4443-4448.

    [8] ALLEN T E, SHERRILL K J, CRISPELL S M, et al. The Jaagsiekte sheep retrovirus envelope gene induces transformation of the avian fibroblast cell line DF-1 but does not require a conserved SH2 binding domain[J].JGenVirol, 2002, 83(11):2733-2742.

    [9] LIU S L, MILLER A D. Transformation of Madin-Darby canine kidney epithelial cells by sheep retrovirus envelope proteins[J].JVirol, 2005, 79(2):927-933.

    [10] WOOTTON S K, HALBERT C L, MILLER A D. Sheep retrovirus structural protein induces lung tumours[J].Nature, 2005, 434(7035):904-907.

    [11] LINNERTH-PETRIK N M,SANTRY L A,YU D L, et al. Adeno-associated virus vector mediated expression of an oncogenic retroviral envelope protein induces lung adenocarcinomas in immunocompetent mice[J].PLoSOne, 2012, 7(12):e51400.

    [12] CAPORALE M, COUSENS C, CENTORAME P, et al. Expression of the Jaagsiekte sheep retrovirus envelope glycoprotein is sufficient to induce lung tumors in sheep[J].JVirol, 2006, 80(16):8030-8037.

    [13] LEROUX C, GIRARDI N, COTTIN S, et al. Jaagsiekte sheep retrovirus (JSRV): from virus to lung cancer in sheep[J].VetRes, 2007, 38(2):211-228.

    [14] SISTIAQA-POVEDA M, LARRUSKAIN A, MATEO-ABAD M, et al. Lack of association between polymorphic copies of endogenous Jaagsiekte sheep retrovirus (enJSRVs) and ovine pulmonary adenocarcinoma[J].VetMicrobiol, 2016, 185:49-55.

    [15] 張亞坤,劉淑英.綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白致癌作用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué), 2012, 42(12):1315-1320.

    ZHANG Y K, LIU S Y. Advance in tumorigenesis of Jaagsiekte sheep retrovirus’ envelope protein[J].ChineseVeterinaryScience, 2012, 42(12):1315-1320. (in Chinese)

    [16] PALMARINI M, MAEDA N,MURGIA C, et al. A phosphatidylinositol 3-kinase docking site in the cytoplasmic tail of the Jaagsiekte sheep retrovirus transmembrane protein is essential for envelope-induced transformation of NIH 3T3 cells[J].JVirol, 2001, 75(22):11002-11009.

    [17] HOFACRE A,FAN H.Multiple domains of the Jaagsiekte sheep retrovirus envelope protein are required for transformation of rodent fibroblasts[J].JVirol, 2004, 78(19):10479-10489.

    [18] 張宇飛.綿羊胎盤(pán)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞中enJSRV囊膜蛋白的細(xì)胞生物學(xué)作用[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

    ZHANG Y F.Cell biological function of enJSRV envelope proteins in sheep trophoblast cells[D].Hohhot:Inner Mongolia Agricultural University, 2016.(in Chinese)

    [19] BOROBIA M,ORTIN A,FERRER L M, et al. Cells infected withJaagsiektesheepretrovirus are detected in the bone marrow of asymptomatic sheep[J].CanJVetRes, 2014, 78(3):237-240.

    [20] 張宇飛, 劉 月, 王專(zhuān)家, 等.綿羊肺腺瘤病毒pEGFP-C1/exJSRV-env構(gòu)建及引起NIH3T3細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的研究[J].病毒學(xué)報(bào), 2014, 30(3):268-277.

    ZHANG Y F, LIU Y, WANG Z J, et al. Research on construction of sheep lung adenomas virus pEGFP-C1/exJSRV-envand induction of malignant transformation in NIH3T3[J].ChineseJournalofVirology, 2014, 30(3):268-277. (in Chinese)

    [21] MAEDA N, FAN H. Signal transduction pathways utilized by enzootic nasal tumor virus (ENTV-1) envelope protein in transformation of rat epithelial cells resemble those used byJaagsiektesheepretrovirus[J].VirusGenes, 2008, 36(1):147-155.

    [22] ZHANG Y F, SHI J, LIU S Y. Establishment and characterization of a Telomerase-Immortalized sheep trophoblast cell line[J].BiomedResInt, 2016, 2016:5808575.

    [23] 張宇飛,石 晶,劉淑英. enJSRV囊膜蛋白及其受體的瞬時(shí)表達(dá)與綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞融合的誘導(dǎo)研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2015, 46(11): 1924-1933.

    ZHANG Y F, SHI J, LIU S Y. Study on the Transient expression of enJSRV envelope protein and its receptor and the induction of trophoblast cell fusion in sheep[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2015, 46(11): 1924-1933. (in Chinese)

    [24] 杜方原,陳大勇,張宇飛,等.綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的表達(dá)可促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2016, 32(9):1188-1192.

    DU F Y,CHEN D Y,ZHANG Y F, et al. Envelope protein ofJaagsiektesheepretrovious expressed in NIH3T3 cells promotes cell proliferation[J].ChineseJournalofCellularandMolecularImmunology, 2016, 32(9):1188-1192.(in Chinese)

    [25] ILHAN F, VURAL S A, YILDIRIM S, et al. Expression of p53 protein, Jaagsiekte sheep retrovirus matrix protein, and surfactant protein in the lungs of sheep with pulmonary adenomatosis[J].JVetDiagnInvest, 2016, 28(3):249-256.

    [26] HSU T, PHUNG A, CHOE K, et al. Role for a zinc finger protein (Zfp111) in transformation of 208F rat fibroblasts byJaagsiektesheepretrovirus envelope protein[J].JVirol, 2015, 89(20):10453-10466.

    [27] SUN X L, DU F Y, LIU S Y. Modulation of autophagy in exJSRV-env-transfected cells through the Akt/mTOR and MAPK signaling pathway[J].BiochemBiophysResCommun, 2017, 485(3):672-678.

    [28] 孫曉林,劉淑英.外源性綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)通路及調(diào)控Beclin1的研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2017, 39(4):251-256.

    SUN X L,LIU S Y.Modulation of Beclin 1 in exogenous Jaagsiekte sheep retrovirus envelope gene transfected cells through the Akt/mTOR signaling pathway[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine, 2017, 39(4):251-256.(in Chinese)

    猜你喜歡
    滋養(yǎng)層膜蛋白真核
    微小miR-184在調(diào)控女性滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡中的作用及其分子機(jī)制探究
    真核翻譯起始因子-5A2在肝內(nèi)膽管癌中的表達(dá)及意義
    Kisspeptin對(duì)早期胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用
    干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白抑制小兒流感病毒作用及其機(jī)制研究
    滋養(yǎng)層干細(xì)胞研究進(jìn)展
    EB病毒潛伏膜蛋白1基因多態(tài)性與NK/T細(xì)胞淋巴瘤的相關(guān)性
    梅毒螺旋體四種膜蛋白克隆重組表達(dá)和ELISA法建立的應(yīng)用研究
    兔妊娠早中期滋養(yǎng)層細(xì)胞侵潤(rùn)的觀察研究
    人醛縮酶A干擾RNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建
    真核翻譯起始因子5A2在胰腺癌中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性
    免费看十八禁软件| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲九九香蕉| 国产又爽黄色视频| 老司机靠b影院| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲成a人片在线一区二区| 色精品久久人妻99蜜桃| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲在线自拍视频| 1024手机看黄色片| 90打野战视频偷拍视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 香蕉久久夜色| 国产精品永久免费网站| x7x7x7水蜜桃| 后天国语完整版免费观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 久久久久久大精品| 黄片小视频在线播放| 一区福利在线观看| 悠悠久久av| 久久久久久免费高清国产稀缺| 日韩免费av在线播放| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美三级亚洲精品| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲一区高清亚洲精品| 日韩高清综合在线| 午夜亚洲福利在线播放| 国产黄a三级三级三级人| av欧美777| 97碰自拍视频| 麻豆成人av在线观看| 可以在线观看毛片的网站| svipshipincom国产片| 久久性视频一级片| 国产成年人精品一区二区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 又黄又粗又硬又大视频| 成人精品一区二区免费| 中文在线观看免费www的网站 | 男女视频在线观看网站免费 | 中文在线观看免费www的网站 | cao死你这个sao货| 国产黄a三级三级三级人| 草草在线视频免费看| av欧美777| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 搞女人的毛片| 一区二区三区国产精品乱码| 熟女电影av网| 男人舔奶头视频| 欧美日韩精品网址| 不卡av一区二区三区| 亚洲av五月六月丁香网| 欧美国产精品va在线观看不卡| 岛国在线观看网站| 天天一区二区日本电影三级| 精品国产乱子伦一区二区三区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 成年人黄色毛片网站| 这个男人来自地球电影免费观看| 亚洲七黄色美女视频| 99在线人妻在线中文字幕| 99re在线观看精品视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产99白浆流出| 日本成人三级电影网站| 日韩精品中文字幕看吧| 又黄又粗又硬又大视频| 在线国产一区二区在线| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美另类亚洲清纯唯美| 中文字幕人妻熟女乱码| 99riav亚洲国产免费| 黄色视频,在线免费观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 哪里可以看免费的av片| 宅男免费午夜| 在线免费观看的www视频| 国产精品影院久久| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲国产精品合色在线| 中文字幕精品免费在线观看视频| 看免费av毛片| 91老司机精品| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久热在线av| 黄片播放在线免费| 成人欧美大片| 午夜日韩欧美国产| 人人妻人人看人人澡| 亚洲国产欧美网| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲五月天丁香| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 日本三级黄在线观看| a级毛片在线看网站| 亚洲久久久国产精品| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久精品人妻少妇| 亚洲专区字幕在线| 看片在线看免费视频| 最新美女视频免费是黄的| 色尼玛亚洲综合影院| 国产人伦9x9x在线观看| 国产av一区在线观看免费| 国产激情久久老熟女| 国产久久久一区二区三区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 91麻豆av在线| 观看免费一级毛片| 欧美大码av| 精品日产1卡2卡| 久久性视频一级片| 日本 欧美在线| 又大又爽又粗| 久久久久久大精品| 成人免费观看视频高清| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产三级黄色录像| АⅤ资源中文在线天堂| 长腿黑丝高跟| 亚洲av成人av| a级毛片a级免费在线| 一级片免费观看大全| or卡值多少钱| 久久久久久久精品吃奶| 黄频高清免费视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 在线天堂中文资源库| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 亚洲av成人av| 亚洲无线在线观看| 亚洲av电影在线进入| 久久久国产精品麻豆| 国产一区二区激情短视频| 国产精品影院久久| 国产男靠女视频免费网站| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 婷婷亚洲欧美| 91在线观看av| 色婷婷久久久亚洲欧美| 精品不卡国产一区二区三区| 午夜视频精品福利| 色在线成人网| 国产精品久久久久久精品电影 | 精品午夜福利视频在线观看一区| 日韩欧美在线二视频| 日韩欧美在线二视频| 级片在线观看| 三级毛片av免费| 精品久久蜜臀av无| 男人操女人黄网站| 男女视频在线观看网站免费 | 免费av毛片视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 男女视频在线观看网站免费 | 国产精品一区二区三区四区久久 | 99国产精品一区二区蜜桃av| 午夜福利在线观看吧| 午夜精品在线福利| 亚洲人成伊人成综合网2020| 成年女人毛片免费观看观看9| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 久9热在线精品视频| a在线观看视频网站| 后天国语完整版免费观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| x7x7x7水蜜桃| 制服诱惑二区| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久香蕉激情| 国产区一区二久久| 国产久久久一区二区三区| 久久久久久久久免费视频了| 男男h啪啪无遮挡| 手机成人av网站| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲中文字幕日韩| 男人舔女人的私密视频| 国产成人系列免费观看| 午夜福利欧美成人| 久久中文看片网| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品精品国产色婷婷| 母亲3免费完整高清在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| e午夜精品久久久久久久| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲欧美精品综合久久99| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 久久伊人香网站| 丁香六月欧美| 成人国产综合亚洲| 久久欧美精品欧美久久欧美| 精品久久久久久,| 一区福利在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 欧美激情久久久久久爽电影| 999久久久精品免费观看国产| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产精品久久久av美女十八| 大型黄色视频在线免费观看| 12—13女人毛片做爰片一| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产精品国产高清国产av| 成人国产综合亚洲| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久国产乱子伦精品免费另类| 日韩精品青青久久久久久| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 日韩欧美三级三区| 日韩av在线大香蕉| 操出白浆在线播放| 日本在线视频免费播放| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲 国产 在线| 国产不卡一卡二| 亚洲无线在线观看| 欧美乱妇无乱码| xxxwww97欧美| 久久人妻av系列| 曰老女人黄片| 91成人精品电影| 99精品欧美一区二区三区四区| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 一本一本综合久久| 无人区码免费观看不卡| 99热这里只有精品一区 | 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产午夜福利久久久久久| 丁香欧美五月| 欧美激情极品国产一区二区三区| 免费搜索国产男女视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 日本在线视频免费播放| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 日韩欧美免费精品| 一本久久中文字幕| 美女 人体艺术 gogo| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产高清videossex| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 午夜视频精品福利| 国产一卡二卡三卡精品| 国产高清有码在线观看视频 | 亚洲真实伦在线观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 天堂√8在线中文| 久久精品成人免费网站| 国产成人欧美在线观看| 人人妻人人看人人澡| 日韩欧美 国产精品| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | www.www免费av| 国产成人欧美在线观看| 亚洲av片天天在线观看| 国产成人欧美| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 人人妻人人澡人人看| 人人澡人人妻人| 在线观看66精品国产| 国产野战对白在线观看| 午夜免费成人在线视频| 丰满的人妻完整版| 国产成年人精品一区二区| 免费高清视频大片| 亚洲中文av在线| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 午夜精品在线福利| 久久这里只有精品19| 欧美久久黑人一区二区| 国产99久久九九免费精品| 欧美三级亚洲精品| 久久人人精品亚洲av| 哪里可以看免费的av片| 久久久久国内视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产av在哪里看| 日韩视频一区二区在线观看| 日韩有码中文字幕| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 一级a爱视频在线免费观看| 999久久久国产精品视频| 十八禁网站免费在线| 欧美在线一区亚洲| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产伦在线观看视频一区| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲片人在线观看| 日韩视频一区二区在线观看| 国产av又大| 国产av一区在线观看免费| 又黄又爽又免费观看的视频| 村上凉子中文字幕在线| 色综合站精品国产| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产99久久九九免费精品| 久久精品91蜜桃| 久久国产精品男人的天堂亚洲| АⅤ资源中文在线天堂| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲国产精品合色在线| 无遮挡黄片免费观看| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产成人精品久久二区二区免费| 成人国产一区最新在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲免费av在线视频| 看黄色毛片网站| 成人手机av| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美又色又爽又黄视频| 欧美zozozo另类| 婷婷丁香在线五月| 成人精品一区二区免费| 亚洲一区二区三区色噜噜| 岛国视频午夜一区免费看| 亚洲精华国产精华精| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 十分钟在线观看高清视频www| 人人妻人人看人人澡| 最好的美女福利视频网| 嫩草影院精品99| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 韩国av一区二区三区四区| 欧美在线黄色| 日韩av在线大香蕉| 亚洲天堂国产精品一区在线| 成人特级黄色片久久久久久久| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 男人操女人黄网站| 男男h啪啪无遮挡| 无遮挡黄片免费观看| 国产黄色小视频在线观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 手机成人av网站| 精品人妻1区二区| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产亚洲欧美精品永久| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产成人欧美| 99在线人妻在线中文字幕| 1024视频免费在线观看| 日本在线视频免费播放| 成人永久免费在线观看视频| 嫩草影视91久久| or卡值多少钱| 国产成人欧美在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 99热只有精品国产| x7x7x7水蜜桃| 婷婷亚洲欧美| 99精品欧美一区二区三区四区| 操出白浆在线播放| 国产精品亚洲美女久久久| 一a级毛片在线观看| 俺也久久电影网| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 老司机午夜福利在线观看视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产av一区二区精品久久| 国产成人影院久久av| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 亚洲精品粉嫩美女一区| 一级作爱视频免费观看| 99国产精品99久久久久| 国产av在哪里看| 国产成人精品久久二区二区91| www.熟女人妻精品国产| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 女性生殖器流出的白浆| 国产亚洲欧美98| 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美黑人精品巨大| 99riav亚洲国产免费| 久久青草综合色| av天堂在线播放| 欧美zozozo另类| 午夜久久久久精精品| 亚洲一区二区三区色噜噜| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 精品无人区乱码1区二区| 韩国av一区二区三区四区| 黄色女人牲交| 精品无人区乱码1区二区| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产v大片淫在线免费观看| 日本黄色视频三级网站网址| 午夜亚洲福利在线播放| 国产在线精品亚洲第一网站| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久性视频一级片| 最新美女视频免费是黄的| 久久精品人妻少妇| 两个人视频免费观看高清| 级片在线观看| 国产视频一区二区在线看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 99热这里只有精品一区 | 美女大奶头视频| 黄片大片在线免费观看| 精品国产国语对白av| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 91麻豆精品激情在线观看国产| 99热6这里只有精品| 成人国产综合亚洲| 亚洲精品美女久久av网站| 首页视频小说图片口味搜索| 在线观看免费视频日本深夜| 国产精品九九99| 亚洲男人的天堂狠狠| 婷婷亚洲欧美| 色综合亚洲欧美另类图片| 麻豆av在线久日| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 在线观看www视频免费| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 在线观看66精品国产| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 亚洲成人免费电影在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 午夜福利高清视频| 人成视频在线观看免费观看| 看黄色毛片网站| 免费在线观看完整版高清| 婷婷丁香在线五月| 好男人电影高清在线观看| 黄片大片在线免费观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲熟妇熟女久久| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲成人久久性| 亚洲黑人精品在线| 窝窝影院91人妻| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 一进一出抽搐动态| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产一区在线观看成人免费| 国产熟女午夜一区二区三区| 日韩国内少妇激情av| 变态另类丝袜制服| 成人三级做爰电影| 男人舔女人的私密视频| 免费看十八禁软件| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲av成人av| 久久午夜综合久久蜜桃| 一a级毛片在线观看| 两性夫妻黄色片| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产三级黄色录像| 制服人妻中文乱码| 美女午夜性视频免费| 亚洲人成伊人成综合网2020| 精品不卡国产一区二区三区| 欧美日韩乱码在线| 一级毛片精品| 天堂动漫精品| 色尼玛亚洲综合影院| 午夜福利18| 欧美日韩一级在线毛片| 国产黄片美女视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 制服人妻中文乱码| 美女午夜性视频免费| 免费在线观看亚洲国产| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲av熟女| 欧美日本视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 日韩欧美在线二视频| 搡老岳熟女国产| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久婷婷成人综合色麻豆| 久久久久国内视频| 国产精品国产高清国产av| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 日日爽夜夜爽网站| 在线永久观看黄色视频| 久久草成人影院| 午夜免费成人在线视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久精品91蜜桃| 午夜福利在线观看吧| 亚洲国产精品合色在线| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 丁香六月欧美| 天堂√8在线中文| 黄片播放在线免费| 久久天堂一区二区三区四区| 热99re8久久精品国产| 麻豆成人av在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 精品欧美国产一区二区三| www日本在线高清视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 午夜免费鲁丝| 午夜a级毛片| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 日本一本二区三区精品| 国产私拍福利视频在线观看| 欧美中文综合在线视频| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| 少妇粗大呻吟视频| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲中文字幕日韩| 视频在线观看一区二区三区| av免费在线观看网站| 夜夜爽天天搞| 成年版毛片免费区| 久久久久久久精品吃奶| 99国产精品一区二区三区| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲av片天天在线观看| 天天添夜夜摸| 精品卡一卡二卡四卡免费| 美女高潮到喷水免费观看| 国产精品一区二区免费欧美| 久久久久久久久久黄片| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 一二三四社区在线视频社区8| 天堂影院成人在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 日韩欧美国产在线观看| 欧美在线黄色| 校园春色视频在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 精品高清国产在线一区| 国产黄a三级三级三级人| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产成年人精品一区二区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产精品 国内视频| 亚洲一区中文字幕在线| 免费高清在线观看日韩| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产在线观看jvid| 精品午夜福利视频在线观看一区| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美成人免费av一区二区三区| 波多野结衣av一区二区av| 最新在线观看一区二区三区| 无遮挡黄片免费观看| 十分钟在线观看高清视频www| 男女午夜视频在线观看| 国产视频内射| 亚洲美女黄片视频| 十分钟在线观看高清视频www| 国产男靠女视频免费网站| 国内精品久久久久久久电影| 国产精品影院久久| 99热6这里只有精品| 波多野结衣高清无吗| xxxwww97欧美| 久久久国产欧美日韩av| 色av中文字幕| 国产av一区二区精品久久| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产91精品成人一区二区三区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲男人天堂网一区| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品二区激情视频| 成人欧美大片| 亚洲无线在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 黄频高清免费视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 中国美女看黄片| 麻豆成人av在线观看| www.www免费av| 国产99白浆流出|