三黃種雞場(chǎng)孵化死胚中沙門菌的分離鑒定與耐藥性分析

徐耀輝，鄧同煒，齊亞如，韓文龍，盧建洲，蔣增海

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，鄭州450046)

禽沙門菌病是一類重要的禽傳染病，可以造成幼雛大量死亡、產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋下降、種蛋孵化率、出雛率下降，弱雛率增加，該病具有水平傳播和垂直傳播的特性。該類病分為三種類型：雞白痢、禽傷寒、禽副傷寒，對(duì)應(yīng)的病原分別為雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌，以及雞白痢沙門菌與雞傷寒沙門菌之外的其他沙門菌[1]。其中雞白痢沙門菌和禽傷寒沙門菌有宿主特異性，主要感染禽類，而禽副傷寒沙門菌能廣泛感染各種動(dòng)物和人，引起食物中毒。沙門菌的多重耐藥性問題也日益突出,既困擾著畜牧業(yè)的發(fā)展也威脅到了人類的公共衛(wèi)生健康[2]。我國對(duì)禽沙門菌病非常重視，將其列為16種優(yōu)先防治的動(dòng)物疫病之一?！秶抑虚L期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012～2020年)》提出，2015年全國祖代以上種雞場(chǎng)的雞白痢沙門菌病達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)，2020年全國所有種雞場(chǎng)的雞白痢沙門菌病達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)。

三黃雞是我國最著名的土雞之一。從20世紀(jì)80年代開始，河南省鄭州地區(qū)新鄭市及其周邊地區(qū)發(fā)展為三黃雞北繁南養(yǎng)的集中區(qū)，并逐步轉(zhuǎn)為商品代三黃雞苗供應(yīng)基地。2014年11月—2015年1月，選擇鄭州及許昌地區(qū)有代表性的四個(gè)父母代三黃種雞場(chǎng)，在其自帶孵化場(chǎng)采集孵化后期死胚樣品進(jìn)行沙門菌的分離鑒定，并對(duì)其耐藥表型及相關(guān)耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，以了解死亡雞胚中沙門菌的感染狀況，初步掌握雞胚源沙門菌的耐藥情況，為該病的綜合防控乃至凈化提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和標(biāo)準(zhǔn)菌株

大腸桿菌ATCC25922，雞白痢標(biāo)準(zhǔn)株C79-13由揚(yáng)州大學(xué)人獸共患病學(xué)江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。2×TaqMaster Mix、DNA Marker DL2000均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；普通營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂均購自北京奧博星有限責(zé)任公司；沙門菌屬診斷血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；麥?zhǔn)媳葷峁苜徸詮V東環(huán)凱微生物科技有限公司；MH瓊脂購自英國Oxoid公司；所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 藥敏紙片

試驗(yàn)用藥敏紙片卡那霉素(K，30 μg·片-1，CT0026B)、慶大霉素(CN，10 μg·片-1，CT0024B)、阿米卡星(AK，30 μg·片-1，CT0107B)，氨芐西林(AMP，10 μg·片-1，CT0003B)，阿莫西林-克拉維酸(AMC，30 μg·片-1，CT0223B)，頭孢他啶(CAZ，30 μg·片-1，CT0412B)、頭孢曲松(CRO，30 μg·片-1，CT0417B)、頭孢唑林(KZ，30 μg·片-1，CT0011B)，美羅培南(MEM，10 μg·片-1，CT0774B)、亞胺培南(IPM，10 μg·片-1，CT0455B)，氨曲南(ATM，30 μg·片-1，CT0264B)，四環(huán)素(TE，30 μg·片-1，CT0054B)、土霉素(OT，30 μg·片-1，CT0041B)，多黏菌素E(CT，10 μg·片-1，CT0017B)，氯霉素(C，30 μg·片-1，CT0013B)，恩諾沙星(ENR，5 μg·片-1，CT0639B)、環(huán)丙沙星(CIP，5 μg·片-1，CT0425B)，磺胺甲噁唑/甲氧芐啶(19∶1)(SXT，25 μg·片-1，CT0052B)、磺胺異噁唑(SF，300 μg·片-1，CT0075B)，呋喃妥因(F，300 μg·片-1，CT0036B) 購自英國Oxoid公司；頭孢噻肟(CTX，30 μg·片-1，21027)、頭孢噻肟/克拉維酸(3∶1)(CTX/CA，30/10 μg·片-1，21092)、頭孢他啶(CAZ，30 μg·片-1，21028)、頭孢他啶/克拉維酸(3∶1) (CAZ/CA，30/10 μg·片-1，21091)均購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌器購自上海申安醫(yī)療器械廠，恒溫空氣浴搖床購自賽默飛世爾科技有限公司，梯度PCR儀購自Biometra公司，凝膠電泳成像分析系統(tǒng)購自BIO-RAD公司。

1.4 樣品的采集

在河南省鄭州地區(qū)及許昌地區(qū)共選取4個(gè)父母代三黃種雞場(chǎng)(存欄量均在5萬套以上，標(biāo)記為鄭州一場(chǎng)、鄭州二場(chǎng)、鄭州三場(chǎng)、許昌一場(chǎng))，在其自帶孵化場(chǎng)隨機(jī)抽樣法采集同一批次孵化后期死胚樣品360份，除去破損、變質(zhì)等不適于試驗(yàn)的，剩余356份，采樣時(shí)確保采集的每枚死胚來源于不同個(gè)體的種雞，增加了樣品的代表性。

1.5 細(xì)菌的分離、鑒定與血清分型

將死胚體表消毒后無菌采集卵黃液按常規(guī)方法分離沙門菌。參考文獻(xiàn)[3]合成沙門菌腸毒素Stn基因引物，進(jìn)行PCR初步鑒定，用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)一步鑒定。采用玻片凝集法進(jìn)行血清分型，根據(jù)Kauffmann-White抗原表[4]檢索沙門菌分離株的血清型。

1.6 藥敏試驗(yàn)及ESBLs確證試驗(yàn)

按照K-B法和美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical Laboratory Standards Institute，CLSI)手冊(cè)[5]進(jìn)行抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)和ESBLs陽性菌的篩選及確證試驗(yàn)。以E.coli(ATCC25922)為質(zhì)控菌株，試驗(yàn)結(jié)果按照手冊(cè)[5]要求進(jìn)行判讀。

1.7 耐藥基因的檢測(cè)

根據(jù)耐藥表型不同，擴(kuò)增相應(yīng)的37種耐藥基因。引物設(shè)計(jì)參考相關(guān)文獻(xiàn)，具體如下：超廣譜β-內(nèi)酰胺酶類(Extended-Spectrum Beta-Lactamases，ESBLs)12種：TEM[6]、SHV[6]、CTX-M-1[6]、CTX-M-2[7]、CTX-M-3[8]、CTX-M-8[9]、CTX-M-9[10]、CTX-M-25[9]、OXA-1[8]、OXA-2[8]、OXA-10[8]、PSE[8]、氨基糖苷類10種：armA[11]、rmtA[11]、rmtB[11]、rmtC[11]、rmtD[11]、rmtE[11]、npmA[12]、aac(3)-IV[13]、aac6′-Ib[14]、aadA1-like[13]；頭孢菌素類6種：MOX[15]、CIT[15]、DHA[15]、ACC[15]、EBC[15]、FOX[15]；磺胺類3種：sul1[16]、sul2[16]、sul3[16]；四環(huán)素類6種：tetA[16]、tetG[16]、tetX[16]以及tetB、tetC、tetR，后三種引物序列自行設(shè)計(jì)，退火溫度均為55 ℃，序列如下，tetB正向引物 5′-AAATAACAGCAAACAGTAATGG-3′, 反向引物 5′-AAGTAGGGGTTGAGACGCAGCTA-3′，擴(kuò)增片段長度493 bp；tetC正向引物 5′-TCTAACAATGCGCTCATCGT-3′，反向引物 5′-GGTTGAAGGCTCTCAAGGGC-3′，擴(kuò)增片段長度589 bp；tetR正向引物5′-AGGACGACGGTGCTTGCT-3′，反向引物 5′-ATGAGGACTGGCGGGTGT-3′，PCR擴(kuò)增后隨機(jī)選取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和序列比較。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離鑒定

共分離到173株沙門菌，包括5種血清型，分別為雞白痢沙門菌(162株)、布利丹沙門菌(5株)、塞羅沙門菌(4株)、腸炎沙門菌(1株)，菲爾摩雷沙門菌(1株)。不同場(chǎng)沙門菌的分離率差異較大，詳見表1。

表1 不同來源死胚樣品沙門菌的分離結(jié)果Table 1 Isolation of Salmonella from different sources dead embryos

2.2 藥敏試驗(yàn)

由表2可以看出，173株沙門菌總體上對(duì)磺胺異噁唑(82.1%)、氨芐西林(74.0%)、四環(huán)素(49.1%)、土霉素(48.6%)耐藥較嚴(yán)重。對(duì)于氨芐西林，鄭州一場(chǎng)(0)、鄭州二場(chǎng)(2.9%)分離菌株幾乎全為敏感，而鄭州三場(chǎng)分離的94株沙門菌耐藥率高達(dá)100%。對(duì)于四環(huán)素、土霉素，許昌一場(chǎng)分離菌株的耐藥率分別僅為5.1%和7.7%，遠(yuǎn)低于其他3個(gè)場(chǎng)。經(jīng)雙紙片協(xié)同法進(jìn)行ESBLs初篩和確證試驗(yàn)，有1株菲爾摩雷沙門菌(編號(hào)14-2)為ESBLs陽性。

由表3可知，呈現(xiàn)5重和6重耐藥的菌株各有1株，呈現(xiàn)4重耐藥的菌株有15株，有75株菌株(43.4%)呈現(xiàn)多重耐藥(耐三類或三類以上藥物)。其中耐藥譜為青霉素類-四環(huán)素類-磺胺類的菌株數(shù)量最多，有53株細(xì)菌。

2.3 耐藥基因的檢測(cè)

共檢測(cè)出13種耐藥基因。本次分離的1株ESBLs陽性菌株共檢測(cè)出TEM、CTX-M-3 2種耐藥基因；2株耐氨基糖苷類的菌株共檢出aac(3)-IV、aac6′-Ib、aadA1-like 3種耐藥基因；19株耐頭孢類的菌株共檢出MOX、ACC、DHA3種耐藥基因；143株耐磺胺類的菌株共檢出sul1、sul2、sul3 3種耐藥基因；84株耐四環(huán)素類的菌株共檢出tetA、tetR2種耐藥基因；耐藥基因檢出率詳見圖1。

本研究中五類抗菌藥物的耐藥表型和基因型的符合率均在72%以上，其中ESBLs類、氨基糖苷類、頭孢類的耐藥表型與基因型符合率為100%，詳見表4。

3 討 論

從356份三黃雞商品代死胚中分離到173株沙門菌，平均分離率為48.6%。鄭州一場(chǎng)分離率最低，為8.6%，鄭州二場(chǎng)、鄭州三場(chǎng)、許昌一場(chǎng)分離率分別為58.3%、79.7%、32.5%，比張莒等[17]報(bào)道的分離率(16.7%)和張麗芳等[18]報(bào)道的分離率(15.4%)高。由于本研究是以死胚而不是正常種蛋作為樣品，實(shí)際生產(chǎn)中攜帶沙門菌的種蛋比例應(yīng)低于本結(jié)果。

僅從雞白痢沙門菌的分離情況比較，鄭州一場(chǎng)最低，為5.2%，鄭州二場(chǎng)、鄭州三場(chǎng)、許昌一場(chǎng)分別為55.0%、78.8%、27.5%。經(jīng)了解，鄭州一場(chǎng)曾進(jìn)行過雞白痢凈化，其他場(chǎng)則沒有凈化，表明檢疫凈化對(duì)雞白痢控制效果顯著。

本次調(diào)查以雞白痢沙門菌(93.6%，162/173)為優(yōu)勢(shì)血清型。其他研究者報(bào)道[19-21](不顯示雞的品種)從河南省的發(fā)病雞采集病料或肉雞肛拭子和環(huán)境樣品分離沙門菌，以腸炎沙門菌為優(yōu)勢(shì)血清型，與本研究結(jié)果不完全一致。分析可能是沙門菌血清型的分布與雞的種源、雞場(chǎng)環(huán)境、飼料、鼠類及其他媒介生物攜帶沙門菌等生物安全措施有關(guān)。本次分離到11株副傷寒沙門菌(6.36%，11/173)，副傷寒沙門菌能通過種雞群垂直傳播擴(kuò)散，對(duì)雞群健康和食品安全帶來潛在威脅，需引起關(guān)注。

本次所分離的173株沙門菌對(duì)卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、阿莫西林-克拉維酸、頭孢曲松、頭孢他啶、氨曲南、呋喃妥因耐藥率較低，可能是生產(chǎn)中較少使用該類藥物所致。分離菌株對(duì)獸醫(yī)禁用的美羅培南、亞胺培南、氯霉素敏感，說明加強(qiáng)獸藥管理可以有效降低細(xì)菌的耐藥性。本次研究中磺胺異噁唑的耐藥率達(dá)到82.1%，而磺胺甲噁唑/甲氧芐啶耐藥率僅為8.1%，這可能反映出臨床上的藥物使用習(xí)慣，即在使用磺胺類藥物時(shí)一般都不使用增效劑[22]。氨芐西林極易產(chǎn)生耐藥性，四個(gè)場(chǎng)分離的菌株對(duì)氨芐西林耐藥率差異顯著；對(duì)于四環(huán)素、土霉素，鄭州一場(chǎng)、二場(chǎng)、三場(chǎng)分離菌株耐藥率遠(yuǎn)高于許昌一場(chǎng)；本次所有分離菌株對(duì)氟喹諾酮類藥物恩諾沙星、環(huán)丙沙星均為敏感，與其他報(bào)道[22-24]不完全一致，可能與養(yǎng)殖場(chǎng)的用藥習(xí)慣有關(guān)。本次分離菌株對(duì)磺胺異噁唑、氨芐西林、四環(huán)素及土霉素耐藥率較高，這些藥物長期以來被廣泛用于我國的畜禽養(yǎng)殖中，藥物的選擇壓力使細(xì)菌產(chǎn)生了相當(dāng)高的耐藥性，臨床上應(yīng)減少使用。

本研究中耐四環(huán)素類的84株沙門菌共檢出tetA(71.4%)、tetR(15.5%)兩種耐藥基因，tetA檢出率與朱順等[22]的報(bào)道(72.55%)基本一致，與賴海梅等[25]的報(bào)道(40.54%)及廖成水等[26]的報(bào)道(7.55%)不一致。對(duì)耐磺胺類的143株沙門菌，sul1(9.1%)、sul2(81.1%)、sul3(51.8%)的檢出率與朱順等[22]的報(bào)道(60.78%，78.43%，35.29%)和廖成水等[26]的報(bào)道(58.7%，41.3%，21.74%)有所差異。表明在沙門菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性過程中不同耐藥基因的參與程度存在差異。本研究中沙門菌的耐藥基因與耐藥表型的符合率大于72%，表明耐藥基因廣泛存在于耐藥菌株中。另外，少部分具有耐藥表型的菌株沒有檢測(cè)到本文所列的耐藥基因，表明耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，有待于進(jìn)一步研究。

表2 173株沙門菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitivity test of 173 Salmonella strains

表3 173株沙門菌的耐藥譜Table 3 Drug resistance of 173 Salmonella isolates

圖1 13種耐藥基因的檢出情況Fig.1 Detection results of 13 resistance genes

表4 沙門菌耐藥基因型的分析結(jié)果Table 4 Results of Salmonella isolates antimicrobial resistant genotype

許多耐藥基因可在動(dòng)物和人類病原菌間水平傳播。了解該地區(qū)流行株耐藥基因流行規(guī)律，對(duì)防控沙門菌病具有重要意義。

4 結(jié) 論

河南省三黃雞父母代群沙門菌的感染較為嚴(yán)重，以雞白痢沙門菌感染為主，也有少部分副傷寒沙門菌的感染。沙門菌多重耐藥嚴(yán)重，且耐藥基因普遍存在于耐藥菌株中。

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