中藥復(fù)方芩藿飲對鴨肝炎病毒實(shí)驗(yàn)感染雛鴨的治療效果分析

張 偉，白景英，杜紅旭，熊 文, 明 珂，劉家國

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)研究室，南京 210095)

鴨病毒性肝炎(duck virus hepatitis, DVH) 是鴨肝炎病毒(duck hepatitis A virus, DHAV)感染雛鴨引起的一種傳播迅速、發(fā)病率高、病死率高的傳染性疾病，臨床主要以肝腫大及出血為典型病理特征。1949年在美國首次發(fā)現(xiàn)本病[1]，隨后，英國、德國、日本相繼報(bào)道發(fā)生DVH；目前該病在全世界流行。鴨肝炎病毒主要有3個血清型，分別是DHAV-1、DHAV-2、DHAV-3，三種血清型之間無交叉免疫性[2]。臨床上一旦暴發(fā)該病，常給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，國內(nèi)外臨床上還沒有有效抗DHAV-1藥物；該病的預(yù)防措施主要是通過對雛鴨注射弱毒疫苗進(jìn)行人工主動免疫；卵黃抗體、高免血清和單克隆抗體治療鴨病毒性肝炎有很好的療效[3]，但由于其儲存條件要求高以及給藥操作方式繁瑣，致使在實(shí)際應(yīng)用中有所限制。

中藥是多組分的復(fù)合體，具有較廣泛的抗病毒作用，在我國具有悠久的使用歷史。越來越多的研究顯示，中藥在治療病毒性疾病方面有良好的治療效果。張玉清等[4]發(fā)現(xiàn)黃芩苷、野菊花黃酮等組成的復(fù)方能夠顯著降低雞群感染新城疫病毒的病死率。任志華等[5]發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根、黃芪、連翹等組成的復(fù)方可以抑制鴨瘟病毒在鴨胚成纖維細(xì)胞上的增殖。周廣生[6]研究發(fā)現(xiàn)金絲桃素對鴨病毒性肝炎有極好的治療效果。吳舒淵[7]發(fā)現(xiàn)金銀花、茵陳等組成的中藥復(fù)方對人工感染鴨肝炎病毒雛鴨具有良好治療效果，且療效明顯優(yōu)于抗生素治療組。因此研發(fā)治療鴨病毒性肝炎的中藥制劑具有重要的生產(chǎn)實(shí)踐意義。

黃芩為唇形科(Labiatae)植物黃芩(Scutellariabaicalensis)的干燥根，主要成分是黃芩苷，具有抗病毒、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、肝保護(hù)作用[8]。淫羊藿為小檗科(Berberidaceae)淫羊藿屬(Epimedium)植物的干燥地上部分，主要成分是淫羊藿黃酮，在免疫方面能提高機(jī)體體液免疫能力[9]。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究過程中，根據(jù)中獸醫(yī)理論將多味中藥相互配伍，通過體外細(xì)胞試驗(yàn)篩選出黃芩、淫羊藿等幾味中藥配伍后形成芩藿飲[10]且具有一定的抗DHAV-1效果。本研究旨在通過動物體內(nèi)試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證芩藿飲對雛鴨感染鴨肝炎病毒的臨床治療效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)試劑盒、總蛋白(total protein，TP)試劑盒、白蛋白(albumin，ALB)試劑盒，以上試劑盒購自美國Dade Behring公司。

鴨白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)酶聯(lián)免疫試劑盒、鴨白細(xì)胞介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫試劑盒、鴨白細(xì)胞介素-8(IL-8)酶聯(lián)免疫試劑盒、鴨干擾素-β(interferon-β，IFN-β)酶聯(lián)免疫試劑盒，以上試劑盒購自南京奧青生物技術(shù)有限公司；肝素鈉(購自北京索萊寶科技有限公司，批號：HB8060)。

Dimension X Pand Plus全自動生化分析儀(Dade Behring，USA)，BX43顯微鏡(Olympus, Japan)，Leica RM 2235切片機(jī)(Leica, Germany)，Thermo Fisher Multiskan FC酶標(biāo)儀(Thermo Fisher，USA)，BIOFUGE PRIMO RCentrifuge離心機(jī)(Thermo Fisher，USA)。

1.2 試驗(yàn)藥物

芩藿飲：由黃芩、淫羊藿等中藥按一定比例組成[10]；水煎煮兩次，收集濾液后濃縮至生藥濃度1 g·mL-1，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)動物和病毒

1日齡非免疫(鴨病毒性肝炎疫苗)健康櫻桃谷雛鴨，購自安徽朝陽孵化場。

DHAV-1(LQ2株)，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所黃兵惠贈，制備方法參照于可響等[11]的報(bào)道。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 動物分組與處理 1日齡非免疫健康櫻桃谷雛鴨飼養(yǎng)至6日齡時，選取300只隨機(jī)平均分為5組，每組60只，雌雄各半。試驗(yàn)組分別為芩藿飲高劑量組、中劑量組、低劑量組，以及病毒組、空白組?？瞻捉M雛鴨腿部肌肉注射0.9%氯化鈉注射液0.2 mL·只-1，單獨(dú)隔離飼養(yǎng)；其他各試驗(yàn)組雛鴨腿部肌肉注射DHAV-1 0.2 mL·只-1，人工攻毒造模。

感染1 h后，芩藿飲高劑量組、中劑量組、低劑量組分別按高劑量(0.6 mL·只-1)、中劑量(0.4 mL·只-1)、低劑量(0.2 mL·只-1)添加芩藿飲于適量飲水中飲喂，每天1次，連續(xù)給藥3 d；病毒組和空白組飲水中不添加任何藥物，連續(xù)3 d。

1.4.2 病死率統(tǒng)計(jì) 每天觀察記錄各試驗(yàn)組雛鴨的臨床癥狀，每隔4 h定時記錄各試驗(yàn)組雛鴨發(fā)病死亡情況，直至停止出現(xiàn)死亡后24 h。死亡雛鴨及時逐只剖檢、觀察肝病變，以具有典型鴨病毒性肝炎病理特征的為有效記錄數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)各試驗(yàn)組死亡情況及計(jì)算病死率。

1.4.3 血清樣品制備 在雛鴨注射DHAV-1染毒后第4、8和48小時，每組隨機(jī)抽取雛鴨5只(不計(jì)入樣本數(shù))，采集血液樣本，3 000 r·min-1離心10 min；將分離的血清分裝在2 mL EP管中，置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 肝病理剖檢及HE染色 上述各試驗(yàn)組雛鴨采血結(jié)束后立即處死，采集肝組織，然后放入10%中性甲醛溶液中固定，先制備石蠟/冰凍切片，再進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.5 肝生化指標(biāo)的測定 血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)含量的測定，按照試劑盒說明書操作，采用全自動生化分析儀測定，計(jì)算球蛋白(GLO=TP-ALB)含量。

1.4.6 血液中DHAV-1VP1基因定量分析 采用實(shí)時熒光定量 PCR方法測定。

1.4.6.1 血液中總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄：在攻毒給藥治療后第4、8和48小時，每組隨機(jī)抽取雛鴨5只(不計(jì)入樣本數(shù))，采集血液樣本，肝素鈉抗凝，取30 μL 抗凝全血加入1 mL Trizol，用于總RNA提取；按照PrimeScript RT Master Mix Kit說明書反轉(zhuǎn)錄cDNA。

1.4.6.2 實(shí)時熒光定量 PCR分析：引物設(shè)計(jì)，根據(jù)GenBank上發(fā)表的鴨 DHAV-1 ZJ 株VP1基因序列，用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，以鴨胚肝細(xì)胞看家基因β-actin為內(nèi)參。Real-time PCR 反應(yīng)在Step One Plus Real-time PCR 儀上進(jìn)行，按照SYBR Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)條件為“95 ℃ 30 s；40 個循環(huán)95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s”；利用2-ΔΔCt法處理qPCR結(jié)果[12]。

表1 Real-time PCR引物信息Table 1 The information of Real-time PCR primer

1.4.7 細(xì)胞因子指標(biāo)的測定 采用ELISA法測定血清中IL-2、IL-6、IL-8、IFN-β含量。按照試劑盒說明書操作，在酶標(biāo)儀上于450 nm處測量各孔OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程，在回歸方程基礎(chǔ)上計(jì)算各樣品所對應(yīng)的濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

2 結(jié) 果

2.1 病死率統(tǒng)計(jì)

各試驗(yàn)組雛鴨病死率結(jié)果見表2。攻毒給藥治療后，截至96 h各試驗(yàn)組雛鴨停止死亡?？瞻捉M雛鴨全部存活，病死率為0；病毒組雛鴨全部死亡，病死率100%；高劑量組雛鴨病死率為71.1%；中劑量組和低劑量組雛鴨病死率分別為93.3%和97.8%，高劑量組雛鴨病死率顯著低于病毒組(P<0.05)。

2.2 肝病理剖檢情況

給藥治療第8小時(圖1A～E)，高劑量組(A)肝局部區(qū)域出血，出血灶不密集；中劑量組(B)肝腫大，表面彌漫性出血；低劑量組(C)肝腫脹，大面積出血點(diǎn)，顏色稍暗紅；病毒組(D)肝腫脹，顏色暗紅，表面密布大小不等的點(diǎn)狀或斑狀出血點(diǎn)或壞死灶；空白組(E)肝呈褐色，色澤均勻、質(zhì)地柔軟，無病理性損傷。

給藥治療第48小時(圖1F～J)，高劑量組(F)肝出血點(diǎn)少，僅有少數(shù)淤血斑；中劑量組(G)、低劑量組(H)肝表面無彌漫性出血點(diǎn)，局部區(qū)域有少量淤血斑；病毒組(I)肝顏色暗紅，表面有大面積密集出血點(diǎn)；空白組(J)肝色澤正常，無病理損傷變化。

表2 各試驗(yàn)組雛鴨病死率Table 2 The mortality rate of ducklings in each group

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母相異表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。*.無死亡
Different letters in the same column mean significant difference between the treatments (P<0.05), same letter in the same column mean no significant difference between treatments (P>0.05). *.No ducklings died

圖1 給藥治療第8、48小時肝病理剖檢變化Fig.1 Pathological change of liver at the 8th and 48th hour after drug treatment

2.3 肝病理組織學(xué)分析

各試驗(yàn)組雛鴨給藥治療第48小時肝病理切片結(jié)果見圖2。高劑量組(A)肝出血較少，無炎性細(xì)胞浸潤；中劑量組(B)肝小葉之間有少量出血點(diǎn)，肝竇周圍有炎性細(xì)胞浸潤；低劑量組(C)肝小葉之間有中等程度出血點(diǎn)；病毒組(D)肝彌漫性出血，炎性細(xì)胞浸潤；空白組(E)肝無明顯病理損傷。

A.高劑量組；B.中劑量組；C.低劑量組；D.病毒組；E.空白組A. High dose group; B. Middle dose group; C. Low dose group; D. Virus group; E. Blank control group圖2 給藥治療第48小時肝病理切片F(xiàn)ig.2 Pathological section of liver at the 48th hour after drug treatment

2.4 肝損傷生化評價(jià)指標(biāo)的動態(tài)變化

各試驗(yàn)組雛鴨肝功能生化指標(biāo)AST、ALT、ALB、TP、GLO含量動態(tài)變化結(jié)果見表3。

在給藥治療第4、8和48小時，病毒組AST含量均顯著高于空白組(P<0.05)，高、中、低3個劑量組AST含量均顯著低于病毒組(P<0.05)，顯著高于空白組(第48小時高劑量組AST含量除外)(P<0.05)。

在給藥治療第4、8和48小時，病毒組ALT含量均顯著高于空白組(P<0.05)；高劑量組顯著低于病毒組(P<0.05)，中劑量組和低劑量組與病毒組差異不顯著(P>0.05)。

在給藥治療第4、8和48小時，病毒組ALB含量均顯著低于空白組(P<0.05)；高、中、低3個劑量組ALB含量均顯著高于(P<0.05)或高于病毒組，均顯著低于空白組(P<0.05)。

在給藥治療第4、8和48小時，病毒組TP含量顯著低于空白組(P<0.05)；第8和48小時，高劑量組和中劑量組TP含量均顯著高于病毒組(P<0.05)；第4、8小時，高劑量組TP含量顯著高于中劑量組和低劑量組(P<0.05)，中劑量組和低劑量組TP含量差異不顯著(P>0.05)；第48小時，高劑量組和中劑量組TP含量顯著高于低劑量組(P<0.05)，與空白組接近。在給藥治療第4小時，病毒組GLO含量顯著低于空白組(P<0.05)，高劑量組GLO含量顯著高于病毒組(P<0.05)。

表3 各試驗(yàn)組肝功能生化指標(biāo)變化結(jié)果Table 3 The results of hepatic function biochemical indexes in each

(轉(zhuǎn)下頁Carried forward)

(續(xù)表3 Continued)

同行數(shù)據(jù)后所標(biāo)字母相異表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下表同
Different letters in the same row mean significant difference between the treatments (P<0.05), same letter in the same row means no significant difference between treatments (P>0.05). The same as followed

2.5 血液中DHAV-1 VP1基因拷貝數(shù)的變化

各試驗(yàn)組雛鴨血液中DHAV-1VP1基因拷貝數(shù)結(jié)果見圖3?？瞻捉M未檢測出DHAV-1VP1基因表達(dá)，將病毒組第4小時DHAV-1VP1基因拷貝數(shù)設(shè)為1。在給藥治療第4、8和48小時，病毒組呈先升高后下降趨勢，3個劑量組和病毒組變化趨勢相一致。第4、8小時，3個劑量組均顯著低于病毒組(P<0.05)，高劑量組顯著低于中劑量組和低劑量組(P<0.05)，中劑量組顯著低于低劑量組(P<0.05)；第48小時，與第8小時相比，各試驗(yàn)組DHAV-1VP1基因拷貝數(shù)均顯著大幅降低(P<0.05)，高劑量組顯著低于其余各試驗(yàn)組(P<0.05)，中、低劑量組均顯著低于病毒組(P<0.05)。

同一時間點(diǎn)字母相異表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)Different letters in the bars at the same time mean significant difference between the treatments (P<0.05), same letter in the bars at the same time means no significant difference between treatments (P>0.05)圖3 各試驗(yàn)組雛鴨血液中DHAV-1 VP1基因拷貝數(shù)結(jié)果Fig.3 The results of duck relative blood DHAV-1 VP1 gene copies number in each group

2.6 血清中細(xì)胞因子含量的動態(tài)變化

各試驗(yàn)組雛鴨血清中IL-2、IL-6、IL-8、IFN-β含量動態(tài)變化結(jié)果見表4。

在給藥治療第4、8和48小時，病毒組IL-2含量顯著高于空白組(P<0.05)，高劑量組IL-2含量顯著高于病毒組(P<0.05)；高、中、低3個劑量組IL-2含量均高于病毒組；第8小時，高劑量組IL-2含量顯著高于低劑量組(P<0.05)；3個時間點(diǎn)，各劑量組均顯著高于空白組(P<0.05)。

在給藥治療第4、8和48小時，病毒組IL-6含量顯著低于空白組(P<0.05)，高、中、低3個劑量組顯著高于病毒組和空白組(P<0.05)；3個時間點(diǎn)，高、中、低3個劑量組均呈升高趨勢，但各劑量組間無顯著性差異(P>0.05)。

在給藥治療第4和8小時，病毒組IL-8含量顯著低于空白組(P<0.05)；除第48小時低劑量組外，3個時間點(diǎn)各劑量組均顯著高于病毒組(P<0.05)；高、中、低3個劑量組IL-8含量隨著芩藿飲劑量不同而有所差異，第48小時，高劑量組顯著高于低劑量組(P<0.05)。

在給藥治療第4、8和48小時，病毒組IFN-β含量均低于空白組；第4和48小時，高劑量組IFN-β含量顯著高于病毒組(P<0.05)；3個時間點(diǎn)，高劑量組IFN-β含量顯著高于低劑量組(P<0.05)，與空白組接近。

3 討 論

3.1 芩藿飲對感染鴨肝炎病毒雛鴨肝及肝生化指標(biāo)的影響

肝是機(jī)體最大的藥物代謝和解毒器官，擔(dān)負(fù)著機(jī)體重要的生理功能。肝一旦損傷，必然導(dǎo)致肝細(xì)胞功能受損，影響新陳代謝的正常進(jìn)行。病理剖檢是對動物進(jìn)行系統(tǒng)性全身病理檢查和疾病診斷的基本手段，病理切片則是觀察組織微細(xì)病理變化的常用技術(shù)[13]，兩者都能直觀顯示組織損傷或修復(fù)情況。

表4 各試驗(yàn)組血清中細(xì)胞因子含量動態(tài)變化Table 4 The variation of serum cytokine content in each ng·L-1

肝中ALT、AST是評估肝功能或肝損傷常用的2種酶。正常生理?xiàng)l件下，ALT主要分布在肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，血清中ALT含量極少；肝細(xì)胞損傷時細(xì)胞膜破裂，ALT從細(xì)胞中釋放到血液，血清中ALT含量急劇增高，是反映肝損傷的一項(xiàng)敏感指標(biāo)[14-15]。AST在肝中主要分布于細(xì)胞質(zhì)和線粒體，其中80%分布在線粒體。肝細(xì)胞受損時，線粒體膜和細(xì)胞膜破裂，AST釋放入血液，血清中AST含量迅速升高，是反映肝細(xì)胞壞死程度的重要指標(biāo)[16]。ALB是血液系統(tǒng)重要成分，具有維持膠體滲透壓、抗氧化等功能。肝合成ALB后釋放入血液，其含量多少能夠反映肝合成蛋白質(zhì)功能的強(qiáng)弱[17]。一定濃度ALB可以減輕肝水腫，降低肝損傷程度；此外，ALB可以增高血漿膠體滲透壓使血管內(nèi)液體不溢出血管外，避免機(jī)體因血容量降低而導(dǎo)致休克、死亡。研究表明，雛鴨感染DHAV-1后，血清中TP和ALB含量會降低[18]。GLO是體內(nèi)重要的一種免疫球蛋白，參與機(jī)體免疫反應(yīng)，一定程度上反映機(jī)體的免疫狀況[19]。TP由ALB和GLO組成，肝細(xì)胞受損時，肝合成蛋白質(zhì)減少，其含量高低能夠反映肝合成蛋白質(zhì)的能力。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，DHAV-1侵入雛鴨體內(nèi)致使肝不同程度出血水腫，肝細(xì)胞大量破壞導(dǎo)致血清中ALT、AST含量急劇升高；ALB、TP、GLO含量降低。給予芩藿飲治療后，隨著藥物作用時間延長，肝出血顯著減少、腫脹減輕；血清中ALT、AST含量與空白組接近，ALB、TP、GLO含量逐漸恢復(fù)至正常水平；說明芩藿飲能夠抑制DHAV-1對肝細(xì)胞破壞，保護(hù)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的完整性。

3.2 芩藿飲對感染鴨肝炎病毒雛鴨血液中DHAV-1VP1基因拷貝數(shù)的影響

雛鴨血液中DHAV-1VP1基因拷貝數(shù)可以反映體內(nèi)DHAV-1的數(shù)量。體內(nèi)病毒數(shù)量越多，肝細(xì)胞破壞越嚴(yán)重，則肝功能受損越嚴(yán)重。研究表明，DHAV-1屬于小RNA病毒科，完成一個復(fù)制周期需要6～8 h；病毒感染早期，雛鴨體內(nèi)主要是藥物的直接抗病毒作用而非體液免疫抵御病毒[20-21]。本試驗(yàn)中，在疾病初期，病毒可能未完成一個復(fù)制周期；其次，芩藿飲抑制病毒的復(fù)制和釋放；兩者都影響病毒在體內(nèi)的數(shù)量；因此，3個劑量組DHAV-1VP1基因拷貝數(shù)均顯著低于病毒組。病毒完成復(fù)制后，3個劑量組和病毒組DHAV-1迅速增殖，病毒組DHAV-1VP1基因拷貝數(shù)顯著高于3個劑量組。在疾病后期，雛鴨通過體液免疫、細(xì)胞免疫等自我清除機(jī)制及芩藿飲共同發(fā)揮抗病毒作用，故3個劑量組和病毒組DHAV-1VP1基因拷貝數(shù)快速下降。本試驗(yàn)結(jié)果表明，芩藿飲能夠抑制病毒在體內(nèi)復(fù)制，有效降低病毒數(shù)量，減輕肝細(xì)胞損傷，從而使感染雛鴨肝出血腫脹顯著減輕，肝功能生化指標(biāo)恢復(fù)至接近正常水平。

3.3 芩藿飲對感染鴨肝炎病毒雛鴨血清細(xì)胞因子的影響

白細(xì)胞介素類細(xì)胞因子可作用于多種病毒，一方面刺激機(jī)體產(chǎn)生抗病毒蛋白；另一方面通過免疫調(diào)節(jié)，有效地抑制病毒復(fù)制、抵抗病毒感染[22]。IL-2由激活的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，具有誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，促進(jìn)B細(xì)胞分化及分泌抗體，增強(qiáng)單核細(xì)胞、NK細(xì)胞殺傷活性等功能，在機(jī)體免疫反應(yīng)中具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用[23]。隨著對中藥免疫調(diào)節(jié)作用的研究，發(fā)現(xiàn)許多中藥復(fù)方、單味中藥對IL-2的產(chǎn)生及活性有明顯影響。鄭玲紅等[24]研究發(fā)現(xiàn)猴頭菇多糖能夠顯著促進(jìn)MDRV感染番鴨IL-2的分泌。于學(xué)武[25]研究發(fā)現(xiàn)IL-2在抗AIV 感染早期發(fā)揮極其重要的抗病毒作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，給與芩藿飲治療后，3個劑量組IL-2含量顯著高于病毒組，說明芩藿飲能夠提高雛鴨血清中IL-2含量，即芩藿飲可作用于T細(xì)胞促進(jìn)其分泌IL-2，從而促進(jìn)雛鴨特異性免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，這為芩藿飲作為治療雛鴨病毒性肝炎有效藥物的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

IL-6是體內(nèi)重要的白細(xì)胞介素，由活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，參與機(jī)體抗炎癥反應(yīng)[26]。IL-8又稱嗜中性粒細(xì)胞因子，是炎癥性疾病的重要介質(zhì)，在抗感染、免疫調(diào)節(jié)方面具有重要作用；IL-8對特異性和非特異性免疫細(xì)胞具有強(qiáng)烈的趨化作用[27]，主要對嗜中性粒細(xì)胞趨化和激活作用。IL-6和IL-8在一定水平反映炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度，也是消除炎癥反應(yīng)的因子；此外，兩者高水平時也是炎癥的刺激因子。本試驗(yàn)結(jié)果表明，雛鴨感染DHAV-1導(dǎo)致肝發(fā)生炎癥性損傷，病毒組IL-6、IL-8含量低于空白組；給與芩藿飲治療后，3個劑量組血清中IL-6、IL-8含量顯著高于病毒組，說明芩藿飲促使機(jī)體分泌一定水平IL-6、IL-8消除炎癥反應(yīng)，限制炎癥的擴(kuò)散，對雛鴨病毒性肝炎引起的炎癥感染有良好治療作用。

IFN-β是由成纖維細(xì)胞和病毒核酸等干擾素誘生物質(zhì)刺激所分泌的一種糖蛋白；具有廣譜抗病毒作用，其抑制病毒增殖程度因病毒種類不同而有所差異；在病毒感染起始階段、體液免疫和細(xì)胞免疫發(fā)生作用之前發(fā)揮重要作用[28]。與IFN-α相似，IFN-β不僅具有抗病毒作用，而且具有抗腫瘤、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)等功能[29]。IFN-β 誘導(dǎo)MHC-I類抗原表達(dá)從而促進(jìn)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答；此外，IFN-β 還誘導(dǎo)多種蛋白酶小體和滲透酶，參與病毒肽的降解和運(yùn)輸，有利于抗原處理和遞呈[30]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，感染雛鴨經(jīng)芩藿飲治療后，3個劑量組血清中IFN-β含量顯著高于病毒組，說明芩藿飲促使機(jī)體分泌IFN-β，迅速調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答清除體內(nèi)病毒，使病毒數(shù)量初期升高后期降低，對病毒復(fù)制有一定抑制作用，從而降低病毒對肝的損害。

3.4 芩藿飲對感染鴨肝炎病毒雛鴨病死率的影響

中獸醫(yī)理論認(rèn)為，鴨病毒性肝炎是DHAV-1侵入雛鴨體內(nèi)導(dǎo)致肝膽濕熱、肝風(fēng)內(nèi)動而引起的疾??；臨床癥狀主要表現(xiàn)為全身痙攣、抽搐和腹瀉等；治療原則為清熱解毒、息風(fēng)止痙、疏肝解郁、提高雛鴨機(jī)體免疫力[31]。黃芩，味苦，性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒功效；淫羊藿，味辛，性溫，具有補(bǔ)腎助陽、祛風(fēng)除濕功效。因此，根據(jù)中獸醫(yī)辨證理論將上述中藥配伍組成方劑治療鴨病毒性肝炎。病死率是反映試驗(yàn)藥物對靶動物是否真實(shí)有效最直接的指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，感染雛鴨給與芩藿飲治療后，芩藿飲促使機(jī)體分泌IL-2、IL-6、IL-8、IFN-β抵御病毒感染，有效降低體內(nèi)病毒數(shù)量；體內(nèi)病毒數(shù)量降低使肝細(xì)胞損傷減輕，肝出血及腫脹程度明顯減輕，ALT、AST等肝功能生化指標(biāo)恢復(fù)至接近正常水平；結(jié)果顯示，病毒組雛鴨病死率100%，高劑量組雛鴨病死率71.1%，病死率降低28.9%；說明芩藿飲能夠有效提高感染雛鴨的存活數(shù)。這個效果雖然不及卵黃抗體，但本品使用方便簡單，治療范圍廣，并不局限于鴨病毒性肝炎，故仍然具有一定的開發(fā)利用前景。

4 結(jié) 論

芩藿飲能夠有效降低感染雛鴨的病死率；顯著降低雛鴨血液中DHAV-1VP1基因拷貝數(shù)；修復(fù)DHAV-1對肝造成的損傷；降低血清中AST、ALT含量，增加TP、ALB、GLO蛋白含量；促進(jìn)機(jī)體IL-2、IL-6、IL-8、IFN-β細(xì)胞因子分泌。高劑量芩藿飲對實(shí)驗(yàn)感染性鴨肝炎病毒雛鴨有一定的臨床治療作用。

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